Name: initial 3d cell cluster control in a hybrid gel cube device for repeatable pattern formations
Uploaded: 2019-03-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations at JoVE.com

עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי JSPS KAKENHI (18H 04765) ואת התוכנית להפצת מערכת מעקב אחר הקביעות, MEXT, יפן.

1. ייצור של היברידית ג'ל קוביה התקן
<ol><li>להכין מסגרת מעוקב פוליקרבונט (PC) באמצעות תהליך עיבוד שבבי או מדפסת תלת-ממד. הגודל של המסגרת PC תלוי גודל המדגם. במחקר זה, השתמשנו באפשרות מסגרת של 5 מ מ בכל צד כך הענפים היה די שטח כדי להאריך במהלך culturing.</li>
	<li>להציב את המסגרת PC על שקופית זכוכית טרום מקורר ?...

<ol>
	<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosystems+dynamics+in+self-organization+of+tissue+architecture.">Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture.</a> Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-+cytoskeleton+linkages.">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin- cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li><li>Hannezo, E., Prost, J., Joanny, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+epithelial+sheet+morphology+in+three+dimensions.">Theory of epithelial sheet morphology in three dimensions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 27-32 (2014).</li><li>Tawk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mirror-symmetric+cell+division+that+orchestrates+neuroepithelial+morphogenesis.">A mirror-symmetric cell division that orchestrates neuroepithelial morphogenesis.</a> Nature. 446 (7137), 797-800 (2007).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-58 (2011).</li><li>Zegers, M. M. P., O&#8217;Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+polarity+and+tubulogenesis+in+vitro.">Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro.</a> Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).</li><li>Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tube+or+not+tube:+Remodeling+epithelial+tissues+by+branching+morphogenesis.">Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis.</a> Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).</li><li>Denk, W., Strickler, J., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Huisken, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy.">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. , 1007-1009 (2004).</li><li>Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+in+Cube:+In+Vitro+3D+Culturing+Platform+with+Hybrid+Gel+Cubes+for+Multidirectional+Observations.">Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).</li><li>Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+Scale+Imaging+by+Fine+Spatial+Alignment+of+Multi-Scanning+Data+with+Gel+Cube+Device.">Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device.</a> Applied Sciences. 8 (235), (2018).</li><li>Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+bioprinting+of+thick+vascularized+tissues.">Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).</li><li>Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+Tissue+spheroids+as+building+blocks.">Organ printing: Tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).</li><li>Onoe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metre-long+cell-laden+microfibres+exhibit+tissue+morphologies+and+functions.">Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions.</a> Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues.">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).</li><li>Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+repeatability+from+3D+experimental+platform+for+quantitative+analysis+of+cellular+branch+pattern+formations.">High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations.</a> Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems.">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li></ol>

השיטה המובאת בעיתון הזה הוא פשוט, יכול להתבצע ללא ציוד טכנולוגיה. במקביל, ניתן להשיג תוצאה שליטה צורה של אשכול תא מדויק במרחב תלת-ממדי של הידרוג. לאחר הפקד הראשונית, התאים יכולים לגדול ב- HGC עד כמה הם בתרבית על צלחת. ההדמיה רב כיוונית מתבצע על ידי סיבוב הדגימה עם HGC באמצעות כל מערכת מיקרוסקופ, ...

חשיבותה של תרבות 3D, אשר כדאי מחקה סביבות ביולוגי מאשר תרבות 2D, מודגשת במידה ניכרת תא/רקמות תרבות1,2,3. האינטראקציה בין תאים מטריצה חוץ-תאית (ECM) מספק רמזים חשובים לגבי מורפוגנזה4,5. תצורות רקמות רבים יכולים לצאת רק תחת סביבות תלת-ממד, כגון תהליך קיפול6,7, invagination8ו מבנה צינורי9,10. עם זאת, הקשיים למנוע חוקרים הסטה ל ניסויים תלת-ממד של ניסויים 2D בצלחת. אחד הקשיים העיקריים בניסויים 3D הוא הנושא של דגימות 3D הדמיה. לעומת ניסויים מישורי, רכישת תמונות תלת-ממד המתאים הוא עדיין מאתגר במקרים רבים. בפרט, קבלת תמונה תלת-ממדית המתאימה היא משימה קשה כאשר גודל המדגם מגיע הטווח מ מ בשל העומק מוקד גדול של עדשות ההגדלה נמוך. לדוגמה, עומק מוקד מגיע יותר מ 50 מיקרומטר כאשר 10 x עדשת הגדלה בזמן הגודל של התא הבודד הוא בדרך כלל פחות מ- 10 מיקרומטר. כדי לשפר את איכות הדמיה, מפתחים מערכות טכנולוגיה מיקרוסקופ (למשל מיקרוסקופ שני הפוטונים11 ו מערכת מיקרוסקופ אור-גיליון12), אבל את זמינותם מוגבל בשל מחירן יקר. כחלופה, פותחו בעבר היברידית ג'ל קוביה (HGC) התקן13. המכשיר מורכב משני סוגים של hydrogels: agarose ג'ל תמיכה, ECM כמו קולגן או Matrigel כמו ג'ל תרבות. HGC מאפשר לנו לאסוף את הדגימה במהלך culturing לסובב את הקוביה כדי להשיג הדמיה רב כיוונית, אשר פותר את הבעיה של מוקד עומק14.
קושי נוסף בניסויים 3D הוא שלהם הדיר נמוכה בשל בקירות וצפיות המסכן סביבות תלת-ממד. בניגוד תרבות מישורי בצלחת פלסטיק, בווריאציות התנאים התרבות הראשונית בקלות להתרחש במרחב תלת-ממדי מוקף בחומר רך. וריאציה משמעותי בתוצאות הניסוי מתדרדר את הניתוח הבא ומסכות המנגנונים המשמשת כבסיס. טכנולוגיות הנדסיות רבות פותחו ליישור במרחב תאים בודדים, כגון15,bioprinting16, סיבים אריגה17, פיגומים18, אבל הם דורשים preprocessing מורכבים או באופן ספציפי ציוד מעוצב. לעומת זאת, פיתחנו מתודולוגיה להשגת תא 3D יישור HGC19.
ב פרוטוקול זה, אנחנו מאויר הליך פשוט עם ציוד נפוץ לשליטה הצורה אשכול 3D תא הראשונית HGC. ראשית, הודגם תהליך ייצור HGC. לאחר מכן, micromolds מפוברק על ידי פוטוליתוגרפיה או תהליך עיבוד שבבי יכניסו את HGC לייצר כיס עם צורה שרירותית ב- ECM. לאחר מכן, הוזרקו תאים בעלי צפיפות גבוהה לאחר צנטריפוגה לתוך הכיס כדי לשלוט בצורה אשכול תא הראשונית ב HGC. האשכול התא מבוקרת בדיוק יכול לדימות מכיוונים רבים בגלל HGC. האדם הסמפונות אפיתל (NHBE) תאים נורמליים שימשו כדי להפגין השליטה של הצורה אשכול תא ראשוני והדמיה של הענפים מכיוונים רבים לשיפור איכות הדמיה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:673px;" width="673">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">12-well-plate</td>
			<td style="width:124px;">Corning&#160; Inc.</td>
			<td align="right" style="width:132px;">3513</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">2-Methoxy-1-methylethyl Acetate</td>
			<td style="width:124px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.</td>
			<td style="width:132px;">130-10505</td>
			<td>PGMEA, CAS: 108-65-6&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">4% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:124px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.</td>
			<td style="width:132px;">161-20141</td>
			<td>CAS: 30525-89-4</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:251px;">Agarose, low gelling temperature&#160; BioReagent</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Alexa fluor 488 phalloidin</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AZ1512</td>
			<td>Merck</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">BEGM bullet kit</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-3170</td>
			<td>Specialized medium for NHBE cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Bovine Serum Albumin solution (10 %)</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">A1595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">EGM-2 bullet kit</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-3162</td>
			<td>Specialized medium for endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Lipidure</td>
			<td style="width:124px;">NOF co.</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td>MPC polymer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix</td>
			<td style="width:124px;">Corning&#160; Inc.</td>
			<td style="width:132px;">354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">50197Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Normal human bronchial epithelial cells</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-2541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SILPOT 184 W/C</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning Co.</td>
			<td style="width:132px;">3255981</td>
			<td>Base resin and catalyst for PDMS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">SUEX D300</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:132px;">DJ MicroLaminates, Inc</td>
			<td>Thick negative photoresist (thichness: 300 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Triton X-100 (1%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">HFH10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">TWEEN 20</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

initial 3d cell cluster control in a hybrid gel cube device for repeatable pattern formations

החשיבות של תרבויות 3D במבחנה מודגשת במידה ניכרת בתרבות תא/רקמות. עם זאת, חוסר ניסיוני הדיר הוא אחד את ההגבלות שהיא מטילה. הפקת תוצאות הדיר כמה תבניות מתדרדר הניתוח של המנגנונים הארגון עצמית. הפחתת וריאציה של תנאי התרבות הראשונית צפיפות התאים והפצה מטריצה חוץ-תאית (ECM), חיוני לשפר את הדיר של תרבות תלת-ממד. במאמר זה נדגים הליך פשוט אך חזקים לשליטה הצורה אשכול תא הראשונית מטריצה חוץ-תאית תלת-ממד כדי לקבל תבנית מאוד הדיר תצורות. Micromold לצורה הרצויה היה מפוברק על-ידי שימוש פוטוליתוגרפיה או תהליך עיבוד שבבי, הוא נוצר כיס תלת-ממד ב- ECM הכלול קוביה ג'ל היברידית (HGC). תאים מרוכז ואז הוזרקו בכיס כך הצורה אשכול תא מתאימים עם הצורה עובש מפוברק. HGC מועסקים מותר רב כיוונית סריקה על ידי הסיבוב שלה, שאיפשר דימות ברזולוציה גבוהה ועל לכידתו של המבנה כולו רקמות למרות עדשת הגדלה נמוכה שימש. אדם נורמלי הכיל. תאים אפיתליים הסמפונות שימשו כדי להדגים את המתודולוגיה.

האדם הסמפונות אפיתל (NHBE) תאים נורמליים שימשו כדי להדגים את המתודולוגיה מאויר ולשלוט הגיאומטריה תא קולקטיבית הראשונית כדי להשיג את צורת גליל צורה פריזמה, בהתאמה בסביבה ECM. רב כיוונית הדמיה התוצאות המתקבלות על ידי ניגודיות שלב, כמו גם phalloidin מכתים של צורת גליל (אי...

Watch this Scientific Journal Video about Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations at JoVE.com

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

שליטה אשכול הראשונית תא 3D היברידית ג'ל קוביה התקן עבור תצורות דפוס הדיר

אנו מציגים הליך לשליטה אשכול תא ראשוני הצורה מטריצה חוץ-תאית תלת-ממד כדי לקבל צורה דפוס הדיר. מכשיר מעוקב המכיל שני hydrogels שונים הוא מועסק כדי להשיג הדמיה רב כיוונית עבור צורה דפוס רקמות.

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

פרוטוקול זה משתמש בשיטה פשוטה לשיפור האמינות של מודל תרבות תאים תלת-ממד ללא שימוש בציוד מיוחד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו יכולים לנהל את הניסוי תרבות 3D חוזר על ידי שליטה על מצב התרבות הראשונית בתוך המכשיר מעוקב. לאחר הכנת מסגרת מעוקב פוליקרבונט של חמישה על חמישה מילימטרים, מניחים את המסגרת על מגלשה מקורר מראש ותיבת קרח ולהשתמש פיפטה להוסיף 12 microliters של 1.5% שחומם מראש התעורר מהפנים העליונות של המסגרת מעוקב אל פני השטח התחתון.להפיץ את agarose כדי לקבל משטח שטוח ולאפשר פולימר לרפא. השתמש פינצטה כדי להחליק את המסגרת לקצה הזכוכית ולסובב את המסגרת כך הצד הפתוח פונה כלפי מטה לפני הצבת המסגרת בחזרה על השקופית. לאחר מילוי שני המשטחים הבאים של המסגרת עם יותר agarose, כפי שהודגם רק, טיפת agarose לתוך מיכל מפנים פתוחות כדי ליצור קיר אגרוז בצד הרביעי והחמישי.כדי להגדיר צורת אשכול תאים ראשונית להזריק מטריצה חוץ תאית מתאימה לתרבות התאים של עניין לתוך שטח תרבות קוביית ג'ל היברידית ולהגדיר תבנית מיקרו מפוברק על הקוביה. ואז למקם את הקובייה באינקובטור פחמן דו חמצני במשך 25 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כאשר המטריצה החוץ-תאית נרפאת, יש להרים בזהירות את תבנית המיקרו כך שהמטריצה לא תתדרדר.כיס בצורת התבנית הרצויה יהיה מפוברק במטריצה החוץ-תאית. כדי לטעון את התאים לרכז את ההשעיה תא ניסיוני לאחר צנטריפוגה במדיום תא הניסוי המתאים להזריק את התאים לכיס בתוך מטריצה חוץ תאית. מניחים את הקובייה לתוך אינקובטור פחמן דו חמצני במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לתאים ליפול לתוך כיס מטריצה חוץ תאית, מילוי החלל שנוצר על ידי עובש מיקרו.בסוף הדגירה, מניחים את הקובייה לתוך באר אחת של צלחת 24 באר ולהוסיף 100 microliters של מדיום תרבות התא המתאים ל הבאר. להזריק מטריצה חוץ תאית נוספת כדי לסגור את הכיס ולהחזיר את הקובייה לאנקובטור במשך 25 דקות. כאשר מטריצה חוץ תאית נרפא טיפה כ 10 microliters של 20 מעלות צלזיוס התעורר על פני השטח העליונים לקוביה כדי לסגור את פני השטח לרפא את הירידה במשך 10 עד 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן מכסים את הקובייה כולה במדיום טרי כדי לקדם לחץ אוסמוטי להקלה על העברת התזונה לתאים בתוך הקובייה. לזיהוי צורה תלת-ממדית לא פולשנית על ידי התבוננות רב-כיוונית, הנח את הלוח על שלב מיקרוסקופ והשג תמונות של כל צד של הקוביה באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר או ניגודיות פאזה, באמצעות פינצטה כדי לסובב את שירות הקוביה כדי לדמיין אותו בין לכידות. להדמיה אימונופלואורסצננטית על ידי התבוננות רב-כיוונית, ישאף תחילה את העל-טבעי מהקלפיה המכילה את הקובייה ותקן את הקובייה ב-4% פרפורמלדהיד למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.בסוף קיבעון, לשטוף את הקובייה פעמיים עם PBS במשך 10 דקות לכל לשטוף. ערערו את הקובייה עם 0.5% טריטון x-100 ו-PBS למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף את הקובייה שלוש פעמים PBS במשך 10 דקות לכל לשטוף, לפני חסימת כל מליטה לא ספציפית עם סרום עזים חיץ immunofluorescence במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.ואז להכתים את התאים עם הנוגדן העיקרי המתאים של עניין על פי פרוטוקולי הכתמת נוגדנים סטנדרטיים. ואז תמונה כל ששת הצדדים של הקובייה על לייזר או מיקרוסקופ פלואורסצנטי כפי שהוכח רק. בניסוי מייצג זה הדמיה רב-כיוונית של קוביות ג'ל היברידיות, המתורבתות בתאי אפיתל אנושיים רגילים, מדגימה את הדור של תרבות תאים גלילית או פריזמה ראשונית בצורת ניגודיות פאזה והדמיה אימונופלואורסצנטית של התרבויות.כאן כתמים חיסוניים של תאי אפיתל אנושיים נורמליים נשלט בתחילה לצורה גלילית בקוביית הג'ל ההיברידית, לאחר הדור של עץ הסופתנות מוצג. הענפים מדגימים את הניצב לציר הגלילי, כפי שנחשף בהדמיה רב-ממדית. חשוב להזריק צפיפות גבוהה של תאים לכיס מטריצה חוץ תאית, כמו צפיפות נמוכה של תאים עלול לגרום להידרדרות של איכות התא לאחר הדגירה.תבנית שיטה זו היא היווצרות חוזרת של תבנית תאית תלת-ממדית עם מדידה כמותית על ידי הדמיה רב-כיוונית כדי לחקור את המנגנון של פיתוח כלים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

מכשיר microfluidic ליצירה מחדש של גידול microenvironment<em&gt; במבחנה</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

הזמנת תאים בודדים עוברים יחיד מאסר 3D: התקן חדש עבור הקרנת תוכן גבוהה

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

הכנת ג&#39;לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D<em&gt; In vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

מערכי ננו-אשכול ליגנד בתוך bilayer שומנים נתמך

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

מיקרו-בקר המופעל התקן לדור של נוזלי תמציות קונבנציונאלי סיגריה סיגריה עשן ואלקטרוניקה תרסיס

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

שלושה תלת-ממד של מטריקס-Adipocyte מודל תרבות המודל ללימוד תא מטריקס-מטבולית הסלולר

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

יצירת תנאי סביבה דינמיים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...