Name: initial 3d cell cluster control in a hybrid gel cube device for repeatable pattern formations
Uploaded: 2019-03-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations at JoVE.com

이 작품은 JSP KAKENHI (18 H 04765) 및 임기 추적 시스템 보급, 문 부 과학성, 일본 프로그램에 의해 재정적으로 지원 되었다.

1입니다. 하이브리드 젤 큐브 장치 제조
<ol><li>폴 리카 보 네이트 (PC) 큐빅 프레임 가공 공정 또는 3D 프린터를 사용 하 여 준비 합니다. PC 프레임의 크기는 샘플의 크기에 따라 달라 집니다. 이 연구에서 우리가 사용 5mm의 프레임 양쪽에 분기 했다 경작 하는 동안 길게 하기에 충분 한 공간.</li>
	<li>사전 냉각된 유리 슬라이드 또는 얼음 상자에 다른 부드러운 표면에 PC 프레임을 배치 (< 0 ° C) (<strong...

<ol>
	<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosystems+dynamics+in+self-organization+of+tissue+architecture.">Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture.</a> Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-+cytoskeleton+linkages.">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin- cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li><li>Hannezo, E., Prost, J., Joanny, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+epithelial+sheet+morphology+in+three+dimensions.">Theory of epithelial sheet morphology in three dimensions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 27-32 (2014).</li><li>Tawk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mirror-symmetric+cell+division+that+orchestrates+neuroepithelial+morphogenesis.">A mirror-symmetric cell division that orchestrates neuroepithelial morphogenesis.</a> Nature. 446 (7137), 797-800 (2007).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-58 (2011).</li><li>Zegers, M. M. P., O&#8217;Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+polarity+and+tubulogenesis+in+vitro.">Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro.</a> Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).</li><li>Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tube+or+not+tube:+Remodeling+epithelial+tissues+by+branching+morphogenesis.">Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis.</a> Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).</li><li>Denk, W., Strickler, J., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Huisken, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy.">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. , 1007-1009 (2004).</li><li>Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+in+Cube:+In+Vitro+3D+Culturing+Platform+with+Hybrid+Gel+Cubes+for+Multidirectional+Observations.">Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).</li><li>Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+Scale+Imaging+by+Fine+Spatial+Alignment+of+Multi-Scanning+Data+with+Gel+Cube+Device.">Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device.</a> Applied Sciences. 8 (235), (2018).</li><li>Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+bioprinting+of+thick+vascularized+tissues.">Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).</li><li>Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+Tissue+spheroids+as+building+blocks.">Organ printing: Tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).</li><li>Onoe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metre-long+cell-laden+microfibres+exhibit+tissue+morphologies+and+functions.">Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions.</a> Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues.">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).</li><li>Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+repeatability+from+3D+experimental+platform+for+quantitative+analysis+of+cellular+branch+pattern+formations.">High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations.</a> Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems.">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li></ol>

이 문서에 소개 된 방법은 간단 하 고 높은-기술 장비 없이 수행할 수 있습니다. 동시에, 히드로의 3D 공간에서 정확한 셀 클러스터 모양을 제어 결과 얻을 수 있습니다. 초기 제어 후 셀 만큼 그들은 접시에 교양으로 HGC에서 성장할 수 있다. 다 방향 영상 HGC 어떤 현미경 시스템을 사용 하 여 함께 샘플을 회전 하 여 수행 되 고 크게 이미징 품질을 향상 시킵니다. HGC 프레임 및 micromold에 대 한 자료의...

2D 문화 보다 더 나은 생물 환경 모방, 3D 문화의 중요성은 세포/조직 문화1,2,3에 상당히 강조 했다. 세포와 세포 외 기질 (ECM) 간의 상호 작용 morphogenesis4,5에 관한 중요 한 단서를 제공합니다. 많은 조직 형성 접는 과정6,7, invagination8, 관 형성9,10등 3D 환경 아래 에서만 나타날 수 있습니다. 그러나, 수많은 어려움 2D 실험에서 3D 실험 접시에 이동에서 연구원을 방지 합니다. 3D 실험에 큰 어려움 중 하나는 이미징 3D 샘플 문제입니다. 평면 실험에 비해, 적절 한 3D 이미지의 수집 아직도 많은 경우에 도전 이다. 특히, 적절 한 3D 이미지를 얻는 때 어려운 작업 샘플 크기 때문에 낮은 확대 렌즈의 큰 초점 깊이 밀리미터 범위에 도달. 단일 셀의 크기는 일반적으로 10 µ m 10 배 확대 렌즈를 사용할 때 예를 들어 초점 깊이 50 µ m에 도달 합니다. 이미지 품질을 향상 시키기 위해, 높은-기술 현미경 시스템 개발 되 고 있다 (예를 들어, 두 광자 현미경11 및 빛 시트 현미경 시스템12), 하지만 그들의 가용성 때문에 그들의 비싼 가격 제한 됩니다. 대신, 우리는 이전 하이브리드 젤 큐브 (HGC) 장치13를 개발 했습니다. 장치 hydrogels 두 가지 유형의 구성: 지원 젤과 콜라겐 등 ECM 또는 문화 젤으로 Matrigel agarose. HGC는 경작 하는 동안 샘플을 수집 하 고14의 초점 깊이 문제 해결 하는 다 방향 영상을 달성 하기 위해 큐브를 회전 수 있습니다.
3D 실험에서 또 다른 어려움은 그들의 낮은 반복성 3D 환경의 가난한 제어력 때문 이다. 플라스틱 접시에 평면 문화와 달리 초기 문화 조건에 변화는 쉽게 부드러운 소재에 의해 포위 하는 3D 공간에서 발생 합니다. 실험 결과에 중요 한 변화 악화 다음 분석 하 고 근본적인 메커니즘을 마스크. 많은 공학 기술 공간 bioprinting15,16,17과 비 계18, 섬유와 같은 단일 셀에 맞게 개발 되었습니다 하지만 그들은 복잡 한 전처리 필요 하거나 특별히 설계 된 장비입니다. 반면, 우리 HGC19에서 3D 셀 맞춤을 달성 하기 위한 방법론을 개발 했습니다.
이 프로토콜에서 우리는 HGC에 3D 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하기 위한 일반적으로 사용된 하는 장비와 간단한 절차 설명. 첫째, HGC는의 제작 과정을 시연 했다. 다음, 사진 평판 또는 가공 공정에 의해 조작 하는 micromolds는 ECM에서 임의의 모양 가진 주머니 생산 HGC에 배치 했다. 그 후, 원심 분리 후 고집적 세포는 HGC에서 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하는 주머니에 주입 했다. 정확 하 게 제어 셀 클러스터는 HGC 때문에 여러 방향에서 몇 군데 될 수 있습니다. 정상적인 인간의 기관지 상피 (NHBE) 세포 이미징 품질 향상을 위한 여러 방향에서 초기 셀 클러스터 모양 제어 및 이미징의 보여 주기 위해 사용 되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:673px;" width="673">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">12-well-plate</td>
			<td style="width:124px;">Corning&#160; Inc.</td>
			<td align="right" style="width:132px;">3513</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">2-Methoxy-1-methylethyl Acetate</td>
			<td style="width:124px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.</td>
			<td style="width:132px;">130-10505</td>
			<td>PGMEA, CAS: 108-65-6&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">4% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:124px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.</td>
			<td style="width:132px;">161-20141</td>
			<td>CAS: 30525-89-4</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:251px;">Agarose, low gelling temperature&#160; BioReagent</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Alexa fluor 488 phalloidin</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AZ1512</td>
			<td>Merck</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">BEGM bullet kit</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-3170</td>
			<td>Specialized medium for NHBE cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Bovine Serum Albumin solution (10 %)</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">A1595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">EGM-2 bullet kit</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-3162</td>
			<td>Specialized medium for endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Lipidure</td>
			<td style="width:124px;">NOF co.</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td>MPC polymer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix</td>
			<td style="width:124px;">Corning&#160; Inc.</td>
			<td style="width:132px;">354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">50197Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Normal human bronchial epithelial cells</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-2541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SILPOT 184 W/C</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning Co.</td>
			<td style="width:132px;">3255981</td>
			<td>Base resin and catalyst for PDMS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">SUEX D300</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:132px;">DJ MicroLaminates, Inc</td>
			<td>Thick negative photoresist (thichness: 300 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Triton X-100 (1%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">HFH10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">TWEEN 20</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

initial 3d cell cluster control in a hybrid gel cube device for repeatable pattern formations

생체 외에서 3D 문화의 중요성은 세포/조직 문화에 상당히 강조 했다. 그러나, 실험적인 반복성의 부족의 제한 중 하나입니다. 패턴 형성의 몇 반복 결과 악화 자기 조직 기본 메커니즘의 분석. 셀 밀도 등은 세포 외 기질 (ECM)에 배포 초기 문화 조건에 변화를 줄이는 것은 3D 문화의 반복성을 향상 시키기 위해 중요 한. 이 문서에서는 높은 반복 패턴 형성을 얻기 위해 3 차원 기질에서 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하기 위한 간단 하지만 강력한 절차를 설명 합니다. 원하는 모양으로 micromold 사진 평판 또는 머시닝 프로세스를 사용 하 여 조립 되었다 그리고 그것은 하이브리드 젤 큐브 (HGC)에 포함 된 ECM에서 3D 포켓을 형성. 셀 클러스터 모양이 조작된 형 모양으로 일치 되도록 농축된 셀 했다 다음 주머니에 주입 됩니다. 고용된 HGC 허용 다 방향 회전, 저 배율 렌즈를 사용 하더라도 고해상도 이미징 및 전체 조직 구조의 캡처를 사용 하도록 설정 하 여 검색. 정상적인 인간의 기관지 상피 세포는 방법론을 설명 하기 위해 사용 되었다.

정상적인 인간의 기관지 상피 (NHBE) 셀 그림된 방법론을 설명 하 고 실린더 모양 및 ECM 환경에서 각각 프리즘 모양 초기 집단 셀 형상을 제어 하 사용 되었다. 단계 대조로 phalloidin 실린더 모양 (그림 4AB)와 (그림 4CD) 프리즘 모양의 얼룩 다 방향 이미징 결과 표시 됩니다. 셀은 ECM 환경에서 원하는 3D 형태?...

Watch this Scientific Journal Video about Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations at JoVE.com

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

반복 패턴 형성을 위한 하이브리드 젤 큐브 장치에 초기 3D 셀 클러스터 제어

우리는 반복 패턴 형성을 얻기 위해 3 차원 기질에서 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하기 위한 절차를 제시. 포함 하는 두 개의 다른 hydrogels 입방 장치 다 방향 영상 조직 패턴 형성에 대 한 달성 하기 위해 채택 된다.

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

이 프로토콜은 특수 장비를 사용하지 않고 3D 세포 배양 모델의 신뢰성을 향상시키는 간단한 방법을 사용합니다. 이 기술의 주요 장점은 입방 장치 내의 초기 배양 상태를 제어하여 반복 가능한 3D 배양 실험을 수행할 수 있다는 것입니다. 5 mm 5 mm 폴리 카보네이트 입방 프레임을 준비 한 후, 미리 냉각 된 슬라이드와 얼음 상자에 프레임을 배치하고 피펫을 사용하여 입방 프레임의 상단 면에서 1.5 % 아가로즈의 12 마이크로 리터를 하단 표면에 추가합니다.아가로즈를 확산하여 평평한 표면을 얻고 중합체가 치료할 수 있도록 한다. 핀셋을 사용하여 프레임을 유리 가장자리로 밀어 넣고 프레임을 회전하여 프레임을 슬라이드에 다시 배치하기 전에 열린 쪽을 아래로 향하도록 합니다. 프레임의 다음 두 표면을 더 많은 아가로즈로 채운 후, 방금 설명했듯이, 아가로즈를 열린 얼굴에서 용기에 떨어뜨려 네 번째와 다섯 번째 면에 아가로즈 벽을 형성합니다.초기 세포 클러스터 형상을 설정하려면 하이브리드 젤 큐브 배양 공간에 관심 있는 세포 배양에 적합한 세포외 매트릭스를 주입하고 조각된 마이크로 몰드를 큐브에 설정한다. 그런 다음 큐브를 이산화탄소 인큐베이터에 넣고 섭씨 37도에서 25분 동안 배치합니다. 세포 외 매트릭스가 경화되면 매트릭스가 악화되지 않도록 마이크로 몰드를 조심스럽게 들어 올립니다.원하는 금형 모양의 포켓은 세포 외 매트릭스에서 제작됩니다. 세포를 로드하기 위해 적절한 실험 세포 배양 배지에서 원심분리 후 실험 세포 현탁액을 농축하고 세포 외 매트릭스 내의 포켓에 세포를 주입한다. 큐브를 이산화탄소 인큐베이터에 넣고 섭씨 37도에서 20분 동안 큐브를 배치하여 세포가 세포외 매트릭스 주머니에 빠질 수 있도록 하여 마이크로 몰드에 의해 생성된 공간을 채웁니다.인큐베이션의 끝에, 큐브를 24웰 플레이트의 1웰에 넣고 적절한 세포 배양 배지의 100 마이크로리터를 우물에 첨가한다. 추가 세포 외 매트릭스를 주입하여 주머니를 닫고 큐브를 인큐베이터로 25 분 동안 반환합니다. 세포외 매트릭스가 경화되면 섭씨 20도의 약 10 마이크로리터가 큐브에 상부 표면에 떨어뜨려 표면을 닫고 섭씨 37도에서 10~20분 동안 낙하를 치료한다.그런 다음 큐브 내의 세포에 영양전달을 용이하게 하기 위한 삼투압을 촉진하기 위해 신선한 배지로 큐브 전체를 덮습니다. 다방향 관찰에 의한 비침습적 3D 형상 인식의 경우, 플레이트를 현미경 단계에 배치하고 핀셋을 사용하여 큐브 서비스를 회전시켜 캡처 사이에 이미지화하여 밝은 필드 또는 위상 대비 현미경으로 큐브의 각 측면의 이미지를 얻습니다. 다방향 관찰에 의한 면역형성 이미징의 경우, 먼저 큐브를 함유하는 우물에서 상류체를 흡습하고 실온에서 20분 동안 4%파라포름알데히드로 큐브를 고정시한다.고정이 끝나면 PBS로 큐브를 두 번 세척한 후 10분간 세척합니다. 큐브를 0.5% 트리톤 x-100, PBS는 섭씨 4도에서 10분 동안 접종합니다. 다음으로, PBS에서 세척당 10분 동안 큐브를 세 번 세척한 후, 상온에서 염소 혈청 및 면역 형광 완충제와의 비특이적 결합을 차단합니다.그런 다음 표준 항체 염색 프로토콜에 따라 관심있는 적절한 1 차 항체로 세포를 얼룩지게한다. 그런 다음 레이저 또는 형광 현미경으로 큐브의 모든 6 면을 이미지화합니다. 이러한 대표적인 실험에서 정상적인 인간 기관지 상피 세포로 배양된 하이브리드 젤 큐브의 다방향 이미징은 배양물의 위상 대비 및 면역형이미징에 의한 초기 원통형 또는 프리즘 형 세포 배양의 생성을 보여준다.여기서 는 하이브리드 겔 큐브에서 원통형 형상으로 처음 조절된 정상 인간 상피 세포의 면역 염색이, 기관지 나무의 생성 후 나타난다. 가지는 다차원 이미징에 의해 드러난 원통형 축에 수직을 보여줍니다. 세포의 낮은 밀도가 인큐베이션 후 세포 품질의 저하를 초래할 수 있기 때문에 세포 외 매트릭스 포켓에 세포의 고밀도를 주입하는 것이 중요합니다.이러한 방법 패턴은 다방향 이미징에 의한 정량적 측정을 통해 3D 세포 패턴의 반복 형성으로 식기 개발 메커니즘을 연구한다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

종양 Microenvironment를 재현을위한 마이크로 유체 장치<em&gt; 체외에서</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

연구

생체공학

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

단백질과 세포 교도소에 대한 2 차원 문양의 기판 만들기

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

단일 세포 및 3D 감금 단일 배아 주문 : 하이 콘텐츠 스크리닝을위한 새로운 장치

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비<em&gt; 생체</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

지원되는 지질 이중층에 리간드 나노 클러스터의 배열

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

전통적인 담배 연기와 전자 담배 연 무질에서 액체 추출의 세대에 대 한 장치를 운영 하는 마이크로컨트롤러

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

매트릭스 세포 대사 크로스토크 연구를 위한 인간 3D 세포외 세포외 매트릭스-세포세포 배양 모델

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

고처리량 미세 유체 장치를 사용하여 동적 환경 조건의 생성

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...