Name: initial 3d cell cluster control in a hybrid gel cube device for repeatable pattern formations
Uploaded: 2019-03-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations at JoVE.com

Dette arbeidet ble økonomisk støttet av JSPS KAKENHI (18H 04765) og skal spre tid sporet System, MEXT, Japan.

1. fabrikasjon av hybrid gel kube enhet
<ol><li>Forberede en polykarbonat (PC) kubikk ramme ved å bruke en maskinering prosess eller en 3D-skriver. Størrelsen på PC rammen avhenger av utvalgsstørrelsen. I denne studien brukte vi en ramme av 5 mm på hver side slik at greinene hadde nok plass til å forlenge under dyrking.</li>
	<li>Plasser PC rammen på et pre-avkjølt glass lysbilde eller en annen myk overflate i en isen boksen (< 0 ° C) (figur 1A).</li>
	<li>Legge til 12 µL av forv...

<ol>
	<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosystems+dynamics+in+self-organization+of+tissue+architecture.">Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture.</a> Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-+cytoskeleton+linkages.">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin- cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li><li>Hannezo, E., Prost, J., Joanny, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+epithelial+sheet+morphology+in+three+dimensions.">Theory of epithelial sheet morphology in three dimensions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 27-32 (2014).</li><li>Tawk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mirror-symmetric+cell+division+that+orchestrates+neuroepithelial+morphogenesis.">A mirror-symmetric cell division that orchestrates neuroepithelial morphogenesis.</a> Nature. 446 (7137), 797-800 (2007).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-58 (2011).</li><li>Zegers, M. M. P., O&#8217;Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+polarity+and+tubulogenesis+in+vitro.">Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro.</a> Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).</li><li>Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tube+or+not+tube:+Remodeling+epithelial+tissues+by+branching+morphogenesis.">Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis.</a> Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).</li><li>Denk, W., Strickler, J., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Huisken, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy.">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. , 1007-1009 (2004).</li><li>Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+in+Cube:+In+Vitro+3D+Culturing+Platform+with+Hybrid+Gel+Cubes+for+Multidirectional+Observations.">Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).</li><li>Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+Scale+Imaging+by+Fine+Spatial+Alignment+of+Multi-Scanning+Data+with+Gel+Cube+Device.">Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device.</a> Applied Sciences. 8 (235), (2018).</li><li>Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+bioprinting+of+thick+vascularized+tissues.">Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).</li><li>Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+Tissue+spheroids+as+building+blocks.">Organ printing: Tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).</li><li>Onoe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metre-long+cell-laden+microfibres+exhibit+tissue+morphologies+and+functions.">Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions.</a> Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues.">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).</li><li>Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+repeatability+from+3D+experimental+platform+for+quantitative+analysis+of+cellular+branch+pattern+formations.">High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations.</a> Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems.">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li></ol>

Metoden presentert i dette papiret er enkel og kan utføres uten høyteknologisk utstyr. Samtidig, kan en presis celle klynge figur kontroll resultatet i 3D-rom av hydrogel oppnås. Etter den innledende kontrollen, kan cellene vokse i HGC som de er kultivert på et fat. Flere retninger avbilding utføres av roterende prøven med HGC med noen mikroskopi-systemet, og det betydelig forbedrer tenkelig kvaliteten. Valget av materialer for HGC ramme og micromold er fleksible så lenge de er biokompatible. En 3D-skriver kan bru...

Betydningen av en 3D kultur, som bedre etterligner biologiske miljøer enn en 2D kultur, er betydelig vektlagt i cellen/vev kultur1,2,3. Samspillet mellom cellene og ekstracellulær matrix (EFM) gir viktig signaler om morphogenesis4,5. Mange vev formasjoner kan dukke opp under 3D-miljøer, som folding prosessen6,7, invagination8og rørformede formasjon9,10. Tallrike vanskelighetene forhindrer imidlertid forskere skifter til 3D eksperimenter fra 2D eksperimenter på et fat. En av de store vanskelighetene 3D eksperimenter er spørsmålet om tenkelig 3D prøver. Sammenlignet med planar eksperimenter, er oppkjøp av aktuelle 3D-bilder fortsatt utfordrende i mange tilfeller. Spesielt er å få en passende 3D image en vanskelig oppgave når utvalgsstørrelsen når millimeter området på grunn av den store fokal dybden av lav-forstørrelse linser. For eksempel når fokal dybde mer enn 50 µm når en 10 x forstørrelse linsen brukes mens den enkelt cellen er vanligvis mindre enn 10 µm. For å forbedre bildebehandling, høyteknologiske mikroskopi systemer blir utviklet (f.eks to-fotonet mikroskopi11 og lyset arks mikroskopi systemet12), men deres tilgjengelighet er begrenset på grunn av deres dyr pris. Som et alternativ, har vi tidligere utviklet en hybrid gel kuben (HGC) enheten13. Enheten består av to typer hydrogels: agarose som en støtte gel og en ECM som kollagen eller Matrigel som en kultur gel. HGC tillater oss å samle prøven under dyrking og rotere kuben for å oppnå flere retninger bildebehandling, hvilke adresser focal dybde problemet14.
En annen vanskelighet 3D eksperimenter er deres lave repeterbarhet på grunn av det dårlige controllability av 3D-miljøer. I motsetning til en plan kultur på en plast rett oppstår variasjoner i de første oppdrettsforholdene lett i et 3D-rom omgitt av et mykt materiale. En betydelig variasjon i de eksperimentelle resultatene forverres følgende analyse og masker de underliggende mekanismene. Mange tekniske teknologier er utviklet for å justere romlig enkelt celler, for eksempel bioprinting15,16, fiber veving17, og stillas18, men de krever kompleks forbehandling eller spesielt designet utstyr. I kontrast, har vi utviklet en metode for å oppnå 3D cellejustering i en HGC19.
I denne protokollen illustrert vi en enkel prosedyre med brukte utstyr kontrollerer 3D første celle klynge formen i en HGC. Først ble fabrikasjon prosessen med HGC demonstrert. Deretter ble micromolds fabrikkert av klima og jordsmonn eller en maskinering prosess plassert i HGC å produsere en lomme med en vilkårlig figur i en ECM. Deretter ble svært tette celler etter sentrifugering injisert i lommen kontrollere første celle klynge figuren i HGC. Nøyaktig regulert celle klyngen kan avbildes fra mange retninger på grunn av HGC. Normal menneskelig bronkial (NHBE) epitelceller ble brukt til å demonstrere kontroll av den første celle klynge figuren og bildebehandling grenene fra flere retninger for forbedring av tenkelig kvaliteten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:673px;" width="673">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">12-well-plate</td>
			<td style="width:124px;">Corning&#160; Inc.</td>
			<td align="right" style="width:132px;">3513</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">2-Methoxy-1-methylethyl Acetate</td>
			<td style="width:124px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.</td>
			<td style="width:132px;">130-10505</td>
			<td>PGMEA, CAS: 108-65-6&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">4% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:124px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.</td>
			<td style="width:132px;">161-20141</td>
			<td>CAS: 30525-89-4</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:251px;">Agarose, low gelling temperature&#160; BioReagent</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Alexa fluor 488 phalloidin</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AZ1512</td>
			<td>Merck</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">BEGM bullet kit</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-3170</td>
			<td>Specialized medium for NHBE cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Bovine Serum Albumin solution (10 %)</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">A1595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">EGM-2 bullet kit</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-3162</td>
			<td>Specialized medium for endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Lipidure</td>
			<td style="width:124px;">NOF co.</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td>MPC polymer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix</td>
			<td style="width:124px;">Corning&#160; Inc.</td>
			<td style="width:132px;">354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">50197Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Normal human bronchial epithelial cells</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-2541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SILPOT 184 W/C</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning Co.</td>
			<td style="width:132px;">3255981</td>
			<td>Base resin and catalyst for PDMS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">SUEX D300</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:132px;">DJ MicroLaminates, Inc</td>
			<td>Thick negative photoresist (thichness: 300 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Triton X-100 (1%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">HFH10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">TWEEN 20</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

initial 3d cell cluster control in a hybrid gel cube device for repeatable pattern formations

Betydningen av i vitro 3D kulturer er betydelig vektlagt i cellen/vev kultur. Mangel på eksperimentell repeterbarhet er imidlertid en av sine begrensninger. Noen repeterbare resultater av mønster formasjon forverres analyse av mekanismene bak selv-organisering. Redusere variasjonen i første oppdrettsforholdene, som cellen tetthet og distribusjon i den ekstracellulære matrisen (EFM), er avgjørende for å forbedre repeatability av en 3D kultur. I denne artikkelen viser vi en enkel men robust prosedyre for å kontrollere den første celle klynge figuren i en 3D ekstracellulær matrix å få svært repeterbare mønster formasjoner. En micromold med en ønsket form ble fabrikkert med klima og jordsmonn eller en maskinering prosess, og det dannet en 3D lomme i ECM i en hybrid gel kube (HGC). Høykonsentrert celler ble deretter injisert i lommen slik at celle klynge figuren fabrikkerte mold figuren. Den ansatt HGC tillatt multi-directional skanning av roteringen, som aktivert høyoppløselig bildebehandling og erobringen av hele vev strukturen selv om en lav forstørrelse objektiv ble brukt. Normal menneskelig bronkial epitelceller ble brukt til å demonstrere metodikken.

Normal menneskelig bronkial (NHBE) epitelceller ble brukt til å demonstrere illustrert metodikken og kontrollere første kollektive celle geometrien for å oppnå en sylinder form og et prisme form, henholdsvis i ECM miljø. Flere retninger tenkelig resultatene av kontrast samt phalloidin farging av en sylinder form (figur 4AB) og prisme figuren (figur 4CD) presenteres. Cellene justeres passende...

Watch this Scientific Journal Video about Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations at JoVE.com

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

Første 3D celle klynge kontroll i en Hybrid Gel kube enhet for repeterbare mønster formasjoner

Vi presenterer en prosedyre for å kontrollere den første celle klynge figuren i en 3D ekstracellulær matrix å få en repeterbar mønster formasjon. En kubikk enhet som inneholder to forskjellige hydrogels er ansatt å oppnå flere retninger bildebehandling for vev mønster formasjonen.

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

Denne protokollen bruker en enkel metode for å forbedre påliteligheten til en 3D-cellekulturmodell uten bruk av spesialutstyr. Den største fordelen med denne teknikken er at vi kan gjennomføre det repeterbare 3D-kultureksperimentet ved å kontrollere den opprinnelige kulturtilstanden i kubikkenheten. Etter å ha forberedt en fem og fem millimeter polykarbonat kubikkramme, plasser rammen på en forkjølt lysbilde og en isboks og bruk en pipette til å legge til 12 mikroliter forvarmede 1,5% agarose fra øverste ansikt av kubikkrammen til bunnoverflaten.Spred agarose for å oppnå en flat overflate og la polymeren kurere. Bruk pinsett til å skyve rammen til kanten av glasset og rotere rammen slik at den åpne siden vender ned før du plasserer rammen tilbake på lysbildet. Etter å ha fylt de neste to overflatene av rammen med mer agarose, som nettopp demonstrert, slipp agarose i en beholder fra et åpent ansikt for å danne en agarose vegg på fjerde og femte side.For å sette opp en innledende celleklyngeform, injiser du en passende ekstracellulær matrise for cellekulturen av interesse i hybrid gel kube kultur plass og sette en fabrikkert mikroform på kuben. Legg deretter kuben i en karbondioksidinkubator i 25 minutter ved 37 grader Celsius. Når den ekstracellulære matrisen er herdet, løft forsiktig ut mikroformen slik at matrisen ikke forverres.En lomme i ønsket form vil bli fabrikkert i den ekstracellulære matrisen. For å laste cellene konsentrere eksperimentell celle suspensjon etter sentrifugering i riktig eksperimentell celle kultur medium og injisere cellene i lommen i den ekstracellulære matrisen. Plasser kuben i karbondioksidinkubatoren i 20 minutter ved 37 grader Celsius for å la cellene falle inn i den ekstracellulære matriselommen, og fyll plassen som er skapt av mikroformen.På slutten av inkubasjonen plasserer du kuben i en brønn av en 24-brønnplate og legger til 100 mikroliter av riktig cellekulturmedium til brønnen. Injiser ekstracellulær matrise for å lukke lommen og returnere kuben til inkubatoren i 25 minutter. Når den ekstracellulære matrisen er herdet, faller ca. 10 mikroliter på 20 grader Celsius på den øverste overflaten til kuben for å lukke overflaten og kurere fallet i 10 til 20 minutter ved 37 grader Celsius.Dekk deretter hele kuben med friskt medium for å fremme osmotisk trykk for å lette overføringen av ernæring til cellene i kuben. For ikke-invasiv 3D-formgjenkjenning ved flerveis observasjon, plasser platen på et mikroskopstadium og få bilder av hver side av kuben ved lysfelt eller fasekontrastmikroskopi, ved hjelp av pinsett for å rotere kubetjenesten som skal avbildes mellom opptak. For immunofluorescent imaging ved flerveis observasjon, først aspirere supernatant fra brønnen som inneholder kuben og fikse kuben i 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved romtemperatur.På slutten av fikseringen vasker du kuben to ganger med PBS i 10 minutter per vask. Impermeabilize kuben med 0,5% triton x-100 og PBS i 10 minutter ved fire grader Celsius. Vask deretter kuben tre ganger i PBS i 10 minutter per vask, før du blokkerer noen uspesifikk binding med geiteserum og immunofluorescence buffer i 60 minutter ved romtemperatur.Deretter flekker cellene med riktig primær antistoff av interesse i henhold til standard antistoff farging protokoller. Deretter bilde alle seks sidene av kuben på en laser eller fluorescerende mikroskop som nettopp demonstrert. I dette representative eksperimentet viser flerveis avbildning av hybridgelkuber, kultivert med normale humane bronkiale epitelceller, generasjonen av en innledende sylindrisk eller prismeformet cellekultur ved fasekontrast og immunofluorescent avbildning av kulturene.Her immuno farging av normale menneskelige epitelceller først kontrollert til en sylindrisk form i hybrid gel kube, etter generering av bronkial treet er vist. Grenene demonstrerer vinkelrett på den sylindriske aksen, som avslørt av flerdimensjonal bildebehandling. Det er viktig å injisere en høy tetthet av celler i den ekstracellulære matriselommen, da en lav tetthet av celler kan føre til forverring av den cellekvaliteten etter inkubasjon.Dette metodemønsteret er den repeterbare dannelsen av et 3D-cellulært mønster med en kvantitativ måling ved flerveis bildebehandling for å studere mekanismen for parabolutvikling.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Bestilling av enkeltceller og enkelt Embryoet i 3D Confinement: En ny enhet for høyt innhold Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Utarbeidelse av 3D kollagen Gels og mikro for studier av 3D Interaksjoner<em&gt; I Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning og montering av 3D microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Ligand Nano-gruppe Arrays i et støttet lipidbilag

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Fleksibel Hydrogeler fra Lunge ekstracellulær matriks for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

En Microcontroller drives enhet for generering av flytende ekstrakter fra konvensjonelle sigarett røyk og elektronisk sigarett Aerosol

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

A Human 3D ekstracellulære Matrix-Adipocyte kultur modell for å studere Matrix-Cell metabolsk crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Generering av dynamiske miljøforhold ved hjelp av en mikrofluidisk enhet med høy gjennomstrømning

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...