Name: initial 3d cell cluster control in a hybrid gel cube device for repeatable pattern formations
Uploaded: 2019-03-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations at JoVE.com

Este trabalho é apoiado financeiramente pela KAKENHI JSPS (18H 04765) e o programa para divulgar sistema de trilha de posse, MEXT, Japão.

1. fabricação de dispositivo de cubo híbrido gel
<ol><li>Prepare um quadro cúbicos de policarbonato (PC) usando um processo de usinagem ou uma impressora 3D. O tamanho da moldura PC varia de acordo com o tamanho da amostra. Neste estudo, usamos uma moldura de 5 mm de cada lado para que os ramos tinham espaço suficiente para alongar durante o cultivo.</li>
	<li>Coloque o quadro de PC sobre uma lâmina de vidro previamente resfriado ou outra superfície lisa em uma caixa de gelo (< 0 ° C) (figu...

<ol>
	<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosystems+dynamics+in+self-organization+of+tissue+architecture.">Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture.</a> Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. 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M. P., O&#8217;Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+polarity+and+tubulogenesis+in+vitro.">Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro.</a> Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).</li><li>Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. 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B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+bioprinting+of+thick+vascularized+tissues.">Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).</li><li>Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+Tissue+spheroids+as+building+blocks.">Organ printing: Tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).</li><li>Onoe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metre-long+cell-laden+microfibres+exhibit+tissue+morphologies+and+functions.">Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions.</a> Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues.">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).</li><li>Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+repeatability+from+3D+experimental+platform+for+quantitative+analysis+of+cellular+branch+pattern+formations.">High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations.</a> Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems.">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li></ol>

O método apresentado neste trabalho é simples e pode ser realizado sem equipamentos de alta tecnologia. Simultaneamente, pode ser obtido um resultado do controle precisos célula aglomerado forma no espaço 3D de hidrogel. Após o controle inicial, as células podem crescer na HGC tanto quanto eles são cultivados em um prato. A imagem multi direcional é executada girando-se a amostra com o HGC usando qualquer sistema de microscopia e melhora significativamente a qualidade de imagem. A escolha dos materiais para o fra...

A importância de uma cultura 3D, que melhor imita ambientes biológicos do que uma cultura 2D, é consideravelmente enfatizada em cultura de células/tecidos1,2,3. A interação entre as células e matriz extracelular (ECM) fornece pistas importantes sobre a morfogênese4,5. Muitas formações de tecido podem surgir apenas em ambientes 3D, como o dobramento processo6,7, invaginação8e formação tubular9,10. No entanto, inúmeras dificuldades impedem pesquisadores mudando a experiências 3D de experimentos 2D em um prato. Uma das principais dificuldades em experiências 3D é a questão da imagem 3D amostras. Em comparação com experimentos planares, aquisição de imagens 3D apropriadas é ainda um desafio em muitos casos. Em particular, a obtenção de uma imagem 3D é uma tarefa difícil quando o tamanho da amostra atinge o intervalo milímetros devido a grande profundidade focal das lentes de ampliação baixa. Por exemplo, a profundidade focal atinge mais de 50 µm quando uma lente de ampliação de 10x é usado enquanto o tamanho da célula única é normalmente inferior a 10 µm. Para melhorar a qualidade de imagem, sistemas de microscopia de alta tecnologia estão sendo desenvolvidos (por exemplo, dois fotões microscopia11 e sistema de microscopia de luz-folha12), mas sua disponibilidade é limitada devido ao seu preço caro. Como alternativa, temos desenvolvido anteriormente um híbrido gel de cubo (HGC) dispositivo13. O dispositivo é composto por dois tipos de hidrogel: agarose como um gel de apoio e um ECM como colágeno ou Matrigel como um gel de cultura. O HGC nos permite coletar a amostra durante o cultivo e girar o cubo para alcançar a imagem multi-direcional, que aborda o problema de profundidade focal14.
Outra dificuldade em experiências 3D é sua baixa repetibilidade devido a pobre controlabilidade dos ambientes 3D. Ao contrário de uma cultura planar sobre um prato de plástico, facilmente ocorrer variações nas condições de cultura inicial em um espaço 3D, rodeado por um material macio. Uma variação significativa nos resultados experimentais deteriora-se a seguinte análise e mascara os mecanismos subjacentes. Muitas tecnologias de engenharia têm sido desenvolvidas para alinhar espacialmente células únicas, tais como bioprinting15,16, fibra tecelagem17e andaimes18, mas eles exigem complexo pré-processamento ou especificamente equipamento projetado. Em contraste, nós desenvolvemos uma metodologia para atingir o alinhamento da célula 3D em uma HGC19.
Neste protocolo, ilustramos um procedimento simples com equipamentos comumente usados para controlar a forma de aglomerado de pilha inicial 3D em uma HGC. Demonstrou-se em primeiro lugar, o processo de fabricação do HGC. Então, micromolds fabricadas por fotolitografia ou um processo de usinagem foram colocados no HGC para produzir um bolso com uma forma arbitrária em um ECM. Posteriormente, células altamente densas após centrifugação foram injetadas no bolso para controlar a forma de aglomerado de pilha inicial no HGC. O cluster de célula precisamente controlada poderia ser fotografado partir de várias direções por causa do HGC. Normal humano brônquica (NHBE) células epiteliais foram usadas para demonstrar o controle da forma de aglomerado de pilha inicial e a imagem latente dos ramos de múltiplas direções para melhorar a qualidade de imagem.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:673px;" width="673">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">12-well-plate</td>
			<td style="width:124px;">Corning&#160; Inc.</td>
			<td align="right" style="width:132px;">3513</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">2-Methoxy-1-methylethyl Acetate</td>
			<td style="width:124px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.</td>
			<td style="width:132px;">130-10505</td>
			<td>PGMEA, CAS: 108-65-6&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">4% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:124px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.</td>
			<td style="width:132px;">161-20141</td>
			<td>CAS: 30525-89-4</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:251px;">Agarose, low gelling temperature&#160; BioReagent</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Alexa fluor 488 phalloidin</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AZ1512</td>
			<td>Merck</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">BEGM bullet kit</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-3170</td>
			<td>Specialized medium for NHBE cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Bovine Serum Albumin solution (10 %)</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">A1595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">EGM-2 bullet kit</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-3162</td>
			<td>Specialized medium for endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Lipidure</td>
			<td style="width:124px;">NOF co.</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td>MPC polymer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix</td>
			<td style="width:124px;">Corning&#160; Inc.</td>
			<td style="width:132px;">354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">50197Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Normal human bronchial epithelial cells</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-2541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SILPOT 184 W/C</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning Co.</td>
			<td style="width:132px;">3255981</td>
			<td>Base resin and catalyst for PDMS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">SUEX D300</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:132px;">DJ MicroLaminates, Inc</td>
			<td>Thick negative photoresist (thichness: 300 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Triton X-100 (1%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">HFH10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">TWEEN 20</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

initial 3d cell cluster control in a hybrid gel cube device for repeatable pattern formations

A importância das culturas in vitro de 3D é consideravelmente enfatizada em cultura de células/tecidos. No entanto, a falta de reprodutibilidade experimental é uma das suas restrições. Produzir alguns resultados reproduzíveis de formação padrão deteriora-se a análise dos mecanismos subjacentes a auto-organização. Reduzir a variação em condições de cultura inicial, tais como a densidade celular e distribuição na matriz extracelular (ECM), é crucial para melhorar a repetibilidade de uma cultura 3D. Neste artigo, vamos demonstrar um procedimento simples mas eficiente para controlar a forma de cluster inicial célula em uma matriz extracelular 3D para obter formações padrão altamente repetitivo. Um micromold com uma forma desejada foi fabricado usando fotolitos ou um processo de usinagem, e formou-se um bolso 3D em ECM contido em um cubo de gel de híbrido (HGC). Células altamente concentradas então foram injetadas no bolso, para que a forma de aglomerado celular combinado com a forma do molde fabricado. O trabalhador assalariado HGC permitido multi-direcional digitalização por sua rotação, o que permitiu a geração de imagens de alta resolução e captura a todo da estrutura do tecido mesmo que utilizou-se uma lente de ampliação baixa. Normais células epiteliais brônquicas humanas foram usadas para demonstrar a metodologia.

Normal humano brônquica (NHBE) células epiteliais foram usadas para demonstrar a metodologia ilustrada e controlar a geometria inicial célula coletiva para alcançar uma forma do cilindro e uma forma de prisma, respectivamente, em um ambiente de ECM. São apresentados os resultados de imagem multi-direcional obtidos por contraste de fase, bem como a faloidina coloração de uma forma de cilindro (Figura 4AB) e a forma de prisma (<strong cl...

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Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

Controle de Cluster inicial célula 3D em um dispositivo de cubo híbrido Gel para formações padrão repetitivo

Apresentamos um procedimento para controlar a forma de cluster inicial célula em uma matriz extracelular 3D para obter uma formação de padrão repetitivo. Um dispositivo cúbico contendo dois diferentes hidrogel é empregado para conseguir imagens multi-direcional para formação de padrão de tecido.

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

Este protocolo usa um método simples para melhorar a confiabilidade de um modelo de cultura celular 3D sem o uso de qualquer equipamento especial. A principal vantagem dessa técnica é que podemos realizar o experimento de cultura 3D repetitivo controlando a condição de cultura inicial dentro do dispositivo cúbico. Depois de preparar uma estrutura cúbica de policarbonato de cinco por cinco milímetros, coloque o quadro em um slide pré-resfriado e uma caixa de gelo e use uma pipeta para adicionar 12 microliters de 1,5% de agarose pré-aquecido da face superior do quadro cúbico para a superfície inferior.Espalhe a agarose para obter uma superfície plana e permitir que o polímero cure. Use pinças para deslizar a moldura até a borda do vidro e girar a moldura para que o lado aberto fique virado para baixo antes de colocar a moldura de volta no slide. Depois de encher as duas superfícies seguintes do quadro com mais agarose, como apenas demonstrado, solte a agarose em um recipiente de um rosto aberto para formar uma parede agarose no quarto e quinto lados.Para configurar uma forma inicial de cluster celular, injete uma matriz extracelular apropriada para a cultura celular de interesse no espaço de cultura do cubo de gel híbrido e coloque um micro molde fabricado no cubo. Em seguida, coloque o cubo em uma incubadora de dióxido de carbono por 25 minutos a 37 graus Celsius. Quando a matriz extracelular estiver curada, levante cuidadosamente o micro molde para que a matriz não se deteriore.Um bolso na forma de molde desejado será fabricado na matriz extracelular. Para carregar as células concentram a suspensão celular experimental após a centrifugação no meio de cultura celular experimental apropriada e injetam as células no bolso dentro da matriz extracelular. Coloque o cubo na incubadora de dióxido de carbono por 20 minutos a 37 graus Celsius para permitir que as células caiam no bolso da matriz extracelular, preenchendo o espaço criado pelo micro molde.No final da incubação, coloque o cubo em um poço de uma placa de 24 poços e adicione 100 microliters do meio de cultura celular adequado ao poço. Injete matriz extracelular adicional para fechar o bolso e devolver o cubo à incubadora por 25 minutos. Quando a matriz extracelular é curada, queda de aproximadamente 10 microliters de 20 graus Celsius surgiu na superfície superior do cubo para fechar a superfície e curar a queda por 10 a 20 minutos a 37 graus Celsius.Em seguida, cubra todo o cubo com meio fresco para promover a pressão osmótica para facilitar a transferência de nutrição para as células dentro do cubo. Para reconhecimento de forma 3D não invasiva por observação multidirecional, coloque a placa em um estágio de microscópio e obtenha imagens de cada lado do cubo por microscopia de contraste de campo brilhante ou fase, usando pinças para girar o serviço cubo a ser imageado entre capturas. Para imagens imunofluorescentes por observação multidirecional, primeiro aspire o supernascido do poço que contém o cubo e fixe o cubo em 4% de paraformaldeído por 20 minutos à temperatura ambiente.No final da fixação, lave o cubo duas vezes com PBS por 10 minutos por lavagem. Impermeabiliza o cubo com 0,5%triton x-100 e PBS por 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, lave o cubo três vezes em PBS por 10 minutos por lavagem, antes de bloquear qualquer ligação inespecífica com soro de cabra e tampão de imunofluorescência por 60 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, colori as células com o anticorpo primário apropriado de interesse de acordo com protocolos padrão de coloração de anticorpos. Em seguida, imagine todos os seis lados do cubo em um laser ou microscópio fluorescente como apenas demonstrado. Neste experimento representativo, a imagem multidirecional de cubos de gel híbridos, cultivada com células epiteliais brônquicas humanas normais, demonstra a geração de uma cultura celular cilíndrica ou prisma inicial por contraste de fase e imagem imunofluorescente das culturas.Aqui a coloração imuno de células epiteliais humanas normais inicialmente controladas a uma forma cilíndrica no cubo de gel híbrido, após a geração da árvore brônquica é mostrada. Os ramos demonstram o perpendicular ao eixo cilíndrico, conforme revelado pela imagem multidimensional. É importante injetar uma alta densidade de células no bolso da matriz extracelular, pois uma baixa densidade de células pode resultar em deterioração da qualidade dessa célula após a incubação.Este padrão de método é a formação repetível de um padrão celular 3D com uma medição quantitativa por imagem multidirecional para estudar o mecanismo de desenvolvimento de pratos.

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Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Geração de Condições Ambientais Dinâmicas usando um dispositivo microfluido de alto rendimento

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...