Name: initial 3d cell cluster control in a hybrid gel cube device for repeatable pattern formations
Uploaded: 2019-03-21T14:30:00
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Este trabajo fue apoyado por KAKENHI JSPS (18H 04765) y el programa para difundir vía sistema, MEXT, Japón.

1. fabricación de híbrido gel cubo dispositivo
<ol><li>Preparar una estructura cúbica de policarbonato (PC) mediante un proceso de mecanizado o una impresora 3D. El tamaño de la estructura de PC depende del tamaño de la muestra. En este estudio, utilizamos un marco de 5 mm a cada lado para que las ramas tenían suficiente espacio para estirarse durante el cultivo.</li>
	<li>Coloque el marco de la PC en un portaobjeto previamente enfriado u otra superficie lisa en una caja de hielo (< 0 ° C) (...

<ol>
	<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosystems+dynamics+in+self-organization+of+tissue+architecture.">Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture.</a> Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-+cytoskeleton+linkages.">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin- cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li><li>Hannezo, E., Prost, J., Joanny, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+epithelial+sheet+morphology+in+three+dimensions.">Theory of epithelial sheet morphology in three dimensions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 27-32 (2014).</li><li>Tawk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mirror-symmetric+cell+division+that+orchestrates+neuroepithelial+morphogenesis.">A mirror-symmetric cell division that orchestrates neuroepithelial morphogenesis.</a> Nature. 446 (7137), 797-800 (2007).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-58 (2011).</li><li>Zegers, M. M. P., O&#8217;Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+polarity+and+tubulogenesis+in+vitro.">Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro.</a> Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).</li><li>Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tube+or+not+tube:+Remodeling+epithelial+tissues+by+branching+morphogenesis.">Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis.</a> Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).</li><li>Denk, W., Strickler, J., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Huisken, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy.">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. , 1007-1009 (2004).</li><li>Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+in+Cube:+In+Vitro+3D+Culturing+Platform+with+Hybrid+Gel+Cubes+for+Multidirectional+Observations.">Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).</li><li>Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+Scale+Imaging+by+Fine+Spatial+Alignment+of+Multi-Scanning+Data+with+Gel+Cube+Device.">Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device.</a> Applied Sciences. 8 (235), (2018).</li><li>Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+bioprinting+of+thick+vascularized+tissues.">Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).</li><li>Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+Tissue+spheroids+as+building+blocks.">Organ printing: Tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).</li><li>Onoe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metre-long+cell-laden+microfibres+exhibit+tissue+morphologies+and+functions.">Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions.</a> Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues.">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).</li><li>Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+repeatability+from+3D+experimental+platform+for+quantitative+analysis+of+cellular+branch+pattern+formations.">High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations.</a> Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems.">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li></ol>

El método presentado en este trabajo es simple y puede realizarse sin equipos de alta tecnología. Al mismo tiempo, puede obtenerse un resultado del control preciso de la célula cluster forma en el espacio 3D de hidrogel. Después del control inicial, las células pueden crecer en el HGC, tanto como se cultivan en un plato. La proyección de imagen multi-direccional se realiza girando la muestra con la HGC utilizando cualquier sistema de microscopía, y mejora significativamente la calidad de imagen. La elección de lo...

La importancia de una cultura 3D, que mejor simula entornos biológicos que hace una cultura 2D, se acentúa considerablemente en el tejido de la célula cultura1,2,3. La interacción entre las células y matriz extracelular (ECM) proporciona pistas importantes sobre morfogénesis4,5. Muchas formaciones de tejido pueden surgir sólo en entornos 3D, como el plegamiento proceso6,7, invaginación8formación tubular9,10. Sin embargo, numerosas dificultades que los investigadores pasando a 3D experimentos de experimentos 2D en un plato. Una de las mayores dificultades en experimentos 3D es el tema de la proyección de imagen 3D muestras. Comparado con experimentos planares, adquisición de imágenes 3D adecuados es aún un desafío en muchos casos. En particular, obtener una imagen 3D adecuada es una tarea difícil cuando el tamaño de la muestra alcanza el rango de milímetros debido a la gran profundidad focal de lentes de bajo aumento. Por ejemplo, la profundidad focal alcanza más de 50 μm cuando 10 x lente de aumento se utiliza mientras que el tamaño de la célula es normalmente menos de 10 μm. Para mejorar la calidad de imagen, se están desarrollando sistemas de microscopía de alta tecnología (por ejemplo, microscopía de dos fotones11 y microscopía de luz hoja sistema12), pero su disponibilidad es limitada debido a su costoso precio. Como alternativa, previamente hemos desarrollado un híbrido gel cubo (HGC) dispositivo13. El dispositivo consta de dos tipos de hidrogeles: agarosa como un gel de soporte y un ECM como colágeno o Matrigel como un gel de cultura. La HGC nos permite recoger la muestra durante el cultivo y girar el cubo para lograr la proyección de imagen multi-direccional, que aborda el problema de profundidad focal14.
Otra dificultad en experimentos 3D es su repetibilidad baja debido a la pobre controlabilidad de los entornos 3D. A diferencia de una cultura planar en un plato de plástico, las variaciones en las condiciones de cultivo inicial se producen fácilmente en un espacio 3D rodeado por un material suave. Una variación significativa en los resultados experimentales deteriora el siguiente análisis y enmascara los mecanismos subyacentes. Se han desarrollado muchas tecnologías de ingeniería espacial alinear celdas individuales, tales como bioprinting15,16, fibra tejido17y18de andamios, pero requieren de procesamiento complejo o específicamente equipo de diseño. En cambio, hemos desarrollado una metodología para lograr un alineamiento celular 3D en una HGC19.
En este protocolo, ilustra un procedimiento simple con equipos utilizados para el control de la forma de racimo 3D de la célula inicial en un HGC. En primer lugar, se demostró el proceso de fabricación de la HGC. Micromolds fabricados por Fotolitografía o un proceso de mecanizado se colocan en la HGC para producir un bolsillo con una forma arbitraria en una ECM. Posteriormente, fueron inyectadas células altamente densas después de la centrifugación en el bolsillo para controlar la forma de racimo de células iniciales en el HGC. El cúmulo celular precisamente controlada podría ser reflejado desde todas las direcciones debido a la HGC. Células epiteliales bronquiales humanas normales (NHBE) fueron utilizadas para demostrar el control de la forma de racimo de células inicial y la proyección de imagen de las ramas de direcciones múltiples para mejorar la calidad de imagen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:673px;" width="673">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">12-well-plate</td>
			<td style="width:124px;">Corning&#160; Inc.</td>
			<td align="right" style="width:132px;">3513</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">2-Methoxy-1-methylethyl Acetate</td>
			<td style="width:124px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.</td>
			<td style="width:132px;">130-10505</td>
			<td>PGMEA, CAS: 108-65-6&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">4% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:124px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.</td>
			<td style="width:132px;">161-20141</td>
			<td>CAS: 30525-89-4</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:251px;">Agarose, low gelling temperature&#160; BioReagent</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Alexa fluor 488 phalloidin</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AZ1512</td>
			<td>Merck</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">BEGM bullet kit</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-3170</td>
			<td>Specialized medium for NHBE cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Bovine Serum Albumin solution (10 %)</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">A1595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">EGM-2 bullet kit</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-3162</td>
			<td>Specialized medium for endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Lipidure</td>
			<td style="width:124px;">NOF co.</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td>MPC polymer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix</td>
			<td style="width:124px;">Corning&#160; Inc.</td>
			<td style="width:132px;">354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">50197Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Normal human bronchial epithelial cells</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-2541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SILPOT 184 W/C</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning Co.</td>
			<td style="width:132px;">3255981</td>
			<td>Base resin and catalyst for PDMS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">SUEX D300</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:132px;">DJ MicroLaminates, Inc</td>
			<td>Thick negative photoresist (thichness: 300 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Triton X-100 (1%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">HFH10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">TWEEN 20</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

initial 3d cell cluster control in a hybrid gel cube device for repeatable pattern formations

La importancia de cultivos in vitro de 3D se acentúa considerablemente en cultura de célula y tejidos. Sin embargo, la falta de repetibilidad experimental es una de las restricciones. Produciendo pocos resultados repetibles de formación, deteriora el análisis de los mecanismos subyacentes a la propia organización. Reducción de la variación en las condiciones de cultivo inicial, como la densidad de la célula y la distribución en la matriz extracelular (ECM), es crucial para mejorar la repetibilidad de una cultura 3D. En este artículo, se demuestra un procedimiento sencillo pero robusto para el control de la forma de racimo de célula inicial en una matriz extracelular 3D para obtener las formaciones patrón altamente repetible. Micromold con forma deseada fue fabricado utilizando Fotolitografía o un proceso de mecanizado, y formó un bolsillo 3D en el ECM contenido en un cubo de gel híbrido (HGC). Células altamente concentradas entonces se inyectaron en el bolsillo de manera que la forma de racimo de células con la forma del molde fabricado. La HGC empleada permitió multidireccional de su rotación, lo que permitió la proyección de imagen de alta resolución y la captura de la estructura de tejido entero aunque se utilizó una lente de baja magnificación. Células epiteliales bronquiales humanas normales fueron utilizadas para demostrar la metodología.

Células epiteliales bronquiales humanas normales (NHBE) fueron utilizadas para demostrar la metodología ilustrada y control de la geometría de la celda colectiva inicial para lograr una forma de cilindro y una forma de prisma, respectivamente, en un ambiente de ECM. Se presentan los resultados imagenológicos multidireccionales por contraste de fases, así como phalloidin tinción de una forma del cilindro (Figura 4AB) y la forma de prisma...

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Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

Celular 3D inicial grupo Control en un dispositivo híbrido Gel cubo para formaciones de patrón repetible

Presentamos un procedimiento para el control de la forma de racimo de célula inicial en una matriz extracelular 3D para obtener una formación de patrón repetible. Un dispositivo cúbico que contiene dos diferentes hidrogeles se emplea para lograr la proyección de imagen multi-direccional para la formación de patrones de tejido.

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

Este protocolo utiliza un método simple para mejorar la fiabilidad de un modelo de cultivo celular 3D sin el uso de ningún equipo especial. La principal ventaja de esta técnica es que podemos llevar a cabo el experimento de cultivo 3D repetible controlando la condición de cultivo inicial dentro del dispositivo cúbico. Después de preparar un marco cúbico de policarbonato de cinco por cinco milímetros, coloque el marco en una diapositiva preenfriada y una caja de hielo y utilice una pipeta para agregar 12 microlitros de 1.5% de aguantó previamente desde la cara superior del marco cúbico a la superficie inferior.Esparce la agarosa para obtener una superficie plana y permitir que el polímero se cure. Utilice pinzas para deslizar el marco hasta el borde del cristal y gire el marco de modo que el lado abierto esté mirando hacia abajo antes de volver a colocar el marco en la diapositiva. Después de llenar las siguientes dos superficies del marco con más agarosa, como se acaba de demostrar, deje caer la agarosa en un recipiente de una cara abierta para formar una pared de agarosa en los lados cuarto y quinto.Para configurar una forma de clúster de celdas inicial, inyecte una matriz extracelular adecuada para el cultivo celular de interés en el espacio de cultivo de cubo de gel híbrido y establezca un micromolde fabricado en el cubo. A continuación, coloque el cubo en una incubadora de dióxido de carbono durante 25 minutos a 37 grados centígrados. Cuando se cure la matriz extracelular, levante cuidadosamente el micromolde para que la matriz no se deteriore.Un bolsillo en la forma de molde deseada se fabricará en la matriz extracelular. Para cargar las células concentrar la suspensión celular experimental después de la centrifugación en el medio de cultivo celular experimental apropiado e inyectar las células en el bolsillo dentro de la matriz extracelular. Coloque el cubo en la incubadora de dióxido de carbono durante 20 minutos a 37 grados Celsius para permitir que las células caigan en el bolsillo de la matriz extracelular, llenando el espacio creado por el micromolde.Al final de la incubación, coloque el cubo en un pozo de una placa de 24 pozos y agregue 100 microlitros del medio de cultivo celular apropiado al pozo. Inyecte matriz extracelular adicional para cerrar el bolsillo y devolver el cubo a la incubadora durante 25 minutos. Cuando se cura la matriz extracelular, deja caer aproximadamente 10 microlitros de 20 grados Celsius agarrose sobre la superficie superior del cubo para cerrar la superficie y curar la caída durante 10 a 20 minutos a 37 grados celsius.Luego cubre todo el cubo con medio fresco para promover la presión osmótica para facilitar la transferencia de nutrición a las células dentro del cubo. Para el reconocimiento de formas 3D no invasivo mediante observación multidireccional, coloque la placa en una etapa del microscopio y obtenga imágenes de cada lado del cubo mediante una microscopía de contraste de fase o de campo brillante, utilizando pinzas para rotar el servicio de cubo que se va a tomar imágenes entre capturas. Para la toma de imágenes inmunofluorescentes por observación multidireccional, primero aspirar el sobrenadante del pozo que contiene el cubo y fijar el cubo en 4%paraformaldehído durante 20 minutos a temperatura ambiente.Al final de la fijación, lave el cubo dos veces con PBS durante 10 minutos por lavado. Impermeabilizar el cubo con 0.5%tritón x-100 y PBS durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. A continuación, lave el cubo tres veces en PBS durante 10 minutos por lavado, antes de bloquear cualquier unión inespecífica con suero de cabra y tampón de inmunofluorescencia durante 60 minutos a temperatura ambiente.A continuación, manche las células con el anticuerpo primario adecuado de interés de acuerdo con los protocolos estándar de tinción de anticuerpos. A continuación, imagine los seis lados del cubo en un microscopio láser o fluorescente como se acaba de demostrar. En este experimento representativo, las imágenes multidireccionales de cubos de gel híbridos, cultivadas con células epiteliales bronquiales humanas normales, demuestran la generación de un cultivo celular cilíndrico o en forma de prisma inicial por contraste de fase e imágenes inmunofluorescentes de los cultivos.Aquí se muestra la tinción inmunodemos de células epiteliales humanas normales inicialmente controladas a una forma cilíndrica en el cubo de gel híbrido, después de la generación del árbol bronquial. Las ramas muestran la perpendicular al eje cilíndrico, como se revela por imágenes multidimensionales. Es importante inyectar una alta densidad de células en el bolsillo de la matriz extracelular, ya que una baja densidad de células puede resultar en el deterioro de esa calidad celular después de la incubación.Este patrón de método es la formación repetible de un patrón celular 3D con una medición cuantitativa por imágenes multidireccionales para estudiar el mecanismo de desarrollo de platos.

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