Name: initial 3d cell cluster control in a hybrid gel cube device for repeatable pattern formations
Uploaded: 2019-03-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations at JoVE.com

Bu eser mali JSP'ler KAKENHI (18 H 04765) ve görev süresi parça sistemi yaymak, MEXT, Japonya için Program tarafından desteklenmiştir.

1. melez jel küp cihaz imalatı
<ol><li>Polikarbonat (PC) küp çerçeve işleme işlemi veya bir 3D printerlere harcama maddeler kullanarak hazırlayın. PC çerçevesinin boyutunu örnek boyutuna bağlıdır. Dalları kültür sırasında uzatmak için yeterli alanı vardı ki bu çalışmada, biz her iki tarafta bir çerçeve 5 mm kullanılır.</li>
	<li>Önceden soğutulmuş cam slayt veya bir buz kutusuna başka bir pürüzsüz yüzey PC çerçevesini yerleştirin (< 0 ° C) (şekil 1A</stron...

<ol>
	<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension+-+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosystems+dynamics+in+self-organization+of+tissue+architecture.">Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture.</a> Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li><li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-+cytoskeleton+linkages.">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin- cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li><li>Hannezo, E., Prost, J., Joanny, J. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+epithelial+sheet+morphology+in+three+dimensions.">Theory of epithelial sheet morphology in three dimensions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 27-32 (2014).</li><li>Tawk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mirror-symmetric+cell+division+that+orchestrates+neuroepithelial+morphogenesis.">A mirror-symmetric cell division that orchestrates neuroepithelial morphogenesis.</a> Nature. 446 (7137), 797-800 (2007).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-58 (2011).</li><li>Zegers, M. M. P., O&#8217;Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+polarity+and+tubulogenesis+in+vitro.">Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro.</a> Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).</li><li>Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tube+or+not+tube:+Remodeling+epithelial+tissues+by+branching+morphogenesis.">Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis.</a> Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).</li><li>Denk, W., Strickler, J., Webb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Huisken, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy.">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. , 1007-1009 (2004).</li><li>Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+in+Cube:+In+Vitro+3D+Culturing+Platform+with+Hybrid+Gel+Cubes+for+Multidirectional+Observations.">Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).</li><li>Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+Scale+Imaging+by+Fine+Spatial+Alignment+of+Multi-Scanning+Data+with+Gel+Cube+Device.">Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device.</a> Applied Sciences. 8 (235), (2018).</li><li>Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+bioprinting+of+thick+vascularized+tissues.">Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).</li><li>Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+Tissue+spheroids+as+building+blocks.">Organ printing: Tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).</li><li>Onoe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metre-long+cell-laden+microfibres+exhibit+tissue+morphologies+and+functions.">Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions.</a> Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+casting+of+patterned+vascular+networks+for+perfusable+engineered+three-dimensional+tissues.">Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues.</a> Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).</li><li>Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+repeatability+from+3D+experimental+platform+for+quantitative+analysis+of+cellular+branch+pattern+formations.">High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations.</a> Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+Proteomic+Imaging+for+High-Dimensional+Profiling+of+Intact+Systems.">Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li></ol>

Bu raporda sunulan yöntem basit ve yüksek teknoloji ekipman yapılabilir. Aynı anda, kesin hücre küme şekil denetimi sonucunda hidrojel 3B alanda elde edilebilir. İlk kontrol sonra bir tabak üzerinde kültürlü oldukları gibi hücreleri HGC içinde büyüyebilir. Çok yönlü görüntüleme herhangi bir mikroskobu sistemi kullanılarak HGC ile örnek döndürerek gerçekleştirilir ve görüntüleme kalitesi önemli ölçüde artırır. Biyouyumlu oldukları gibi HGC çerçeve ve micromold için malzeme seçimi...

2D bir kültür ondan çok daha iyi taklit eden biyolojik ortamlar, 3D bir kültür önemi oldukça hücre/doku kültürü1,2,3' te vurgulanmaktadır. Hücreleri ve hücre dışı Matriks (ECM) arasındaki etkileşimi morfogenez4,5ile ilgili önemli ipuçları sağlar. Birçok doku oluşumları katlama işlemi6,7, invagination8ve borulu oluşumu9,10gibi 3D ortamlar yalnızca altında ortaya çıkabilir. Ancak, çok sayıda zorluklar 3D deneyler için 2D deneylerden bir tabak üzerinde değişen gelen araştırmacılar önlemek. 3D deneylerde büyük zorluklar birini görüntüleme 3D örnekleri konudur. Düzlemsel deneyler ile karşılaştırıldığında, uygun 3D görüntü edinimi birçok durumda hala meydan okuyor. Örnek boyutu milimetre aralığı düşük-büyütme lensler büyük odak derinliği sayesinde ulaştığında özellikle, uygun bir 3D görüntü elde etmek zor bir iştir. Örneğin, tek hücre boyutu normalde az 10 µm ise 10 x büyütme objektif kullanıldığında odak derinliği 50'den fazla µm ulaşır. Görüntü kalitesini artırmak için yüksek teknoloji mikroskobu sistemleri geliştirilmektedir (örneğin, İki fotonlu mikroskobu11 ve ışık sayfalık mikroskobu sistem12), ama onların durumu onların pahalı fiyat nedeniyle sınırlıdır. Alternatif olarak, daha önce bir melez jel küp (HGC) aygıt13geliştirdik. Hydrogels iki tür aygıt oluşur: özel bir destek jel ve kollajen gibi bir ECM ya da Matrigel bir kültür jel olarak olarak. HGC kültür sırasında örnek toplamak ve odak derinliği sorun14adresleri çok yönlü görüntüleme elde etmek için küp döndürmek için bize izin verir.
Başka bir zorluk 3D deneylerde onların düşük tekrarlanabilirlik zavallı kontrol edilebilirlik 3D ortamlar sayesinde olduğunu. Bir plastik tabak bir düzlemsel kültür farklı olarak ilk kültür koşullarında varyasyonları kolayca yumuşak bir malzeme tarafından çevrili 3 boyutlu uzayda meydana gelir. Deneysel sonuçlar önemli bir varyasyon aşağıdaki analizi bozulur ve temel mekanizmaları maskeler. Pek çok mühendislik teknoloji tek hücreleri, bioprinting15,16,17ve İskele18, dokuma fiber gibi dağınık şekilde hizalamak için geliştirilmiştir ancak karmaşık ön işleme gerektirir veya özel olarak tasarlanmış ekipman. Buna ek olarak, 3D hücre hizalama HGC19ulaşmak için bir yöntem geliştirdik.
Bu protokol için bir HGC 3D ilk hücre kümesi şeklinde denetlemek için yaygın olarak kullanılan ekipman ile basit bir yordam gösterilmektedir. İlk olarak, HGC imalat sürecinin gösterilmiştir. Sonra micromolds fotolitografi veya işleme işlemi tarafından fabrikasyon bir cep bir ECM rasgele bir şekli ile üretmeye HGC yerleştirildi. Daha sonra son derece yoğun hücreler Santrifüjü sonra HGC ilk hücre kümesi şeklinde denetlemek için cep içine enjekte edildi. Tam kontrollü hücre kümesi birçok yönden nedeniyle HGC görüntüsü. Normal insan bronş epitel (NHBE) hücreleri görüntü kalitesini arttırmak için birden çok yönden gelen ilk hücre kümesi şekil kontrolünü ve görüntüleme şube göstermek için kullanılmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:673px;" width="673">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">12-well-plate</td>
			<td style="width:124px;">Corning&#160; Inc.</td>
			<td align="right" style="width:132px;">3513</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">2-Methoxy-1-methylethyl Acetate</td>
			<td style="width:124px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.</td>
			<td style="width:132px;">130-10505</td>
			<td>PGMEA, CAS: 108-65-6&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">4% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:124px;">FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.</td>
			<td style="width:132px;">161-20141</td>
			<td>CAS: 30525-89-4</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:251px;">Agarose, low gelling temperature&#160; BioReagent</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Alexa fluor 488 phalloidin</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AZ1512</td>
			<td>Merck</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">BEGM bullet kit</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-3170</td>
			<td>Specialized medium for NHBE cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Bovine Serum Albumin solution (10 %)</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">A1595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">EGM-2 bullet kit</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-3162</td>
			<td>Specialized medium for endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Lipidure</td>
			<td style="width:124px;">NOF co.</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td>MPC polymer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix</td>
			<td style="width:124px;">Corning&#160; Inc.</td>
			<td style="width:132px;">354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Normal Goat Serum (10%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">50197Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Normal human bronchial epithelial cells</td>
			<td style="width:124px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">CC-2541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SILPOT 184 W/C</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning Co.</td>
			<td style="width:132px;">3255981</td>
			<td>Base resin and catalyst for PDMS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">SUEX D300</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:132px;">DJ MicroLaminates, Inc</td>
			<td>Thick negative photoresist (thichness: 300 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Triton X-100 (1%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">HFH10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:132px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">TWEEN 20</td>
			<td style="width:124px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

initial 3d cell cluster control in a hybrid gel cube device for repeatable pattern formations

Tüp Bebek 3D kültürler önemini hücre/doku kültürü içinde önemli ölçüde vurguladı. Ancak, deneysel tekrarlanabilirlik eksikliği kendi kısıtlamaları biridir. Desen oluşumu kaç tekrarlanabilir sonuçlar üreten kendi kendine organizasyon altında yatan mekanizmaları analizini bozulur. Hücre yoğunluğu ve hücre dışı Matriks (ECM), dağıtım gibi ilk kültür koşulları varyasyon azaltarak tekrarlanabilirlik 3D bir kültür geliştirmek çok önemlidir. Bu makalede, biz son derece tekrarlanabilir model oluşumları elde etmek için 3D bir hücre dışı matriks ilk hücre kümesi şeklinde denetlemek için basit ama güçlü bir yordamı göstermek. İstenen şeklinde bir micromold fotolitografi veya işleme işlemi kullanılarak imal edilmiştir ve bir melez jel küp (HGC) bulunan ECM, bir 3D cep kurulmuş. Yüksek konsantrasyonlu hücreleri böylece hücre kümesi şekil fabrikasyon kalıp şekli ile eşleşen, cebinde sonra enjekte edildi. İstihdam HGC rağmen düşük-büyütme objektif kullanılan, yüksek çözünürlüklü görüntü ve tüm doku yapısı yakalama etkin onun rotasyon tarafından tarama çok yönlü izin. Normal insan bronş epitel hücreleri metodoloji göstermek için kullanılmıştır.

Normal insan bronş epitel (NHBE) hücreleri resimli metodoloji göstermek ve bir silindir şekli ve sırasıyla ECM ortamında bir prizma şekil elde etmek için ilk toplu hücre geometri denetlemek için kullanılmıştır. Faz kontrast yanı sıra tarafından bir silindir şekli (şekil 4AB) ve (şekil 4 cD) prizma şekli phalloidin boyama elde edilen çok yönlü görüntüleme sonuçları su...

Watch this Scientific Journal Video about Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations at JoVE.com

Initial 3D Cell Cluster Control in a Hybrid Gel Cube Device for Repeatable Pattern Formations

İlk 3D hücre küme denetimi içinde a Hybrid jel küp aygıt için tekrarlanabilir model oluşumları

Biz bir tekrarlanabilir model formasyonu elde etmek için 3D bir hücre dışı matriks ilk hücre kümesi şeklinde kontrol etmek için bir yordam mevcut. İki farklı hydrogels içeren bir küp aygıtı doku Desen oluşumu için çok yönlü görüntüleme elde etmek için istihdam edilmektedir.

The importance of in vitro 3D cultures is considerably emphasized in cell/tissue culture. However, the lack of experimental repeatability is one of its ...

Bu protokol, herhangi bir özel ekipman kullanmadan bir 3B hücre kültürü modelinin güvenilirliğini artırmak için basit bir yöntem kullanır. Bu tekniğin en büyük avantajı, kübik cihaz içindeki ilk kültür durumunu kontrol ederek tekrarlanabilir 3B kültür deneyi yapabilmemizdir. Beşe beş milimetrelik polikarbonat kübik çerçeve hazırladıktan sonra, çerçeveyi önceden soğutulmuş bir kaydırağa ve bir buz kutusuna yerleştirin ve kübik çerçevenin üst yüzeyinden önceden ısıtılmış 1,5%agarose 12 mikrolitre eklemek için bir pipet kullanın.Düz bir yüzey elde etmek ve polimer tedavi etmek için izin agarose yayıldı. Çerçeveyi camın kenarına kaydırmak için cımbız kullanın ve çerçeveyi, çerçeveyi slayta geri yerleştirmeden önce açık tarafın aşağı bakacak şekilde döndürün. Çerçevenin sonraki iki yüzeyini daha agarose ile doldurduktan sonra, az önce gösterildiği gibi, agarose'u açık bir yüzden bir kap içine düşürerek dördüncü ve beşinci tarafta agarose bir duvar oluşturun.Bir ilk hücre kümesi şekli kurmak için hibrid jel küp kültür alanı içine ilgi hücre kültürü için uygun bir hücre dışı matris enjekte ve küp üzerine bir fabrikasyon mikro kalıp ayarlayın. Sonra 37 santigrat derece 25 dakika boyunca bir karbondioksit kuluçka küpü yerleştirin. Hücre dışı matris tedavi edildiğinde, matrisin bozulmaması için mikro kalıbı dikkatlice kaldırın.İstenilen kalıp şeklinde bir cep ekstrasellüler matris imal edilecektir. Hücreleri yüklemek için uygun deneysel hücre kültürü orta santrifüj sonra deneysel hücre süspansiyon konsantre ve ekstrasellüler matris içinde cebine hücreleri enjekte. 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca karbondioksit inkübatör içine küp yerleştirin hücrelerin hücre dışı matris cebine düşmesine izin vermek için, mikro kalıp tarafından oluşturulan alanı doldurarak.Kuluçka sonunda, bir 24 kuyu plaka bir kuyu içine küp yerleştirin ve kuyuya uygun hücre kültürü orta 100 mikrolitre ekleyin. Cebi kapatmak için ekstra hücre dışı matris enjekte edin ve küpü 25 dakika boyunca kuvöze geri verin. Hücre dışı matriks tedavi edildiğinde yüzeyi kapatmak ve 37 santigrat derece 10 ila 20 dakika boyunca damla tedavi küp üst yüzeye yaklaşık 10 mikrolitre 20 santigrat damla.Sonra küp içinde hücrelere beslenme transferini kolaylaştırmak için ozmotik basınç teşvik etmek için taze orta ile tüm küp kapağı. Çok yönlü gözlem ile noninvaziv 3D şekil tanıma için, bir mikroskop aşamasıüzerine plaka yerleştirin ve parlak alan veya faz kontrast mikroskobu ile küpher iki tarafında görüntüleri elde, yakalar arasında görüntülenecek küp hizmeti döndürmek için cımbız kullanarak. Çok yönlü gözlem ile immünofloresan görüntüleme için, ilk küp içeren kuyudan supernatant aspire ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit küp düzeltmek.Fiksasyon sonunda, yıkama başına 10 dakika pbs ile iki kez küp yıkayın. Küpü %0,5 triton x-100 ve PBS ile 10 dakika boyunca dört santigrat derecede geçirgenleştirin. Daha sonra, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca keçi serumu ve immünofloresan tampon ile herhangi bir nonspesifik yapıştırma engellemeden önce, yıkama başına 10 dakika PBS üç kez küp yıkayın.Daha sonra standart antikor boyama protokollerine göre uygun birincil antikor ile hücreleri lekeleyin. Daha sonra küpün altı tarafını lazer veya floresan mikroskobun üzerinde görüntüleyin. Bu temsili deneyde, normal insan bronşiyal epitel hücreleri ile kültürlendirilen melez jel küplerinin çok yönlü görüntülemesi, faz kontrastı ve kültürlerin immünororesan görüntülemesi ile ilk silindirik veya prizma şeklindeki hücre kültürünün oluşumunu göstermektedir.Burada normal insan epitel hücrelerinin immün boyanması başlangıçta hibrid jel küp silindirik bir şekle kontrol, bronşiyal ağaç nesil sonra gösterilir. Dallar silindirik eksene dik gösterir, çok boyutlu görüntüleme ile ortaya. Hücre dışı matris cebine yüksek yoğunlukta hücre enjekte etmek önemlidir, çünkü hücrelerin düşük yoğunluğu kuluçkadan sonra hücre kalitesinin bozulmasına neden olabilir.Bu yöntem deseni, çanak geliştirme mekanizmasını incelemek için çok yönlü görüntüleme ile nicel ölçüm ile 3Boyutlu hücresel desenin tekrarlanabilir oluşumudur.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Bir Tümör Mikroçevre yeniden oluşturmak için mikroakışkan Cihazı<em&gt; In vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Protein ve hücre Etrafının İki Boyutlu Desenli Yüzeyler Oluşturma

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Tek Hücreleri ve 3D Sınırlaması Tek Embriyolar Sipariş: Yüksek İçerik Tarama için Yeni Bir Cihaz

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması<em&gt; İn Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Bir Desteklenen lipit iki tabakalı içinde Ligand Nano küme Diziler

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

Sıvı özleri geleneksel sigara duman ve elektronik sigara Aerosol gelen nesil için aygıt mikroişlemci işletilen

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Bir İnsan 3D Ekstrasellüler Matrix-Adiposit Kültür Modeli Matrix-Hücre Metabolik Crosstalk Çalışma için

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...