Name: studying rna interactors of protein kinase rna-activated during the mammalian cell cycle
Uploaded: 2019-03-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle at JoVE.com

وأيد هذا العمل "برنامج بحوث العلوم الأساسية" عبر الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) الممولة من الحكومة الكورية وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات (جبهة الخلاص الوطني-2016R1C1B2009886).

1-حل وخلية إعداد
<ol><li>إعداد الحل<ol>
<li>لخلية الثقافة المتوسطة، إعداد المتوسطة لثقافة الخلية هيلا بإضافة 50 مل مصل البقري الجنين (FBS) إلى 500 مل من المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو). ملاحظة: يمكن إضافة المضادات الحيوية إلى مستنبت الخلية، ولكن نحن لا نستخدم المضادات الحيوية.</li>
		<li>بارافورمال...

<ol>
	<li>Meurs, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+expression+of+human+double-stranded+RNA-activated+p68+kinase+in+murine+cells+mediates+phosphorylation+of+eukaryotic+initiation+factor+2+and+partial+resistance+to+encephalomyocarditis+virus+growth.">Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth.</a> Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).</li><li>Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interferon-inducible+double-stranded+RNA-activated+protein+kinase+self-associates+in+vitro+and+in+vivo.">The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).</li><li>Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAX/PACT-PKR+stress+response+pathway+promotes+p53+sumoylation+and+activation,+leading+to+G(1)+arrest.">The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest.</a> Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).</li><li>Yang, X., Nath, A., Opperman, M. J., Chan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+differentially+regulates+insulin+receptor+substrates+1+and+2+in+HepG2+cells.">The double-stranded RNA-dependent protein kinase differentially regulates insulin receptor substrates 1 and 2 in HepG2 cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (19), 3449-3458 (2010).</li><li>Zamanian-Daryoush, M., Mogensen, T. H., DiDonato, J. A., Williams, B. R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappa+B+Activation+by+Double-Stranded-RNA-Activated+Protein+Kinase+(PKR)+Is+Mediated+through+NF-kappa+B-Inducing+Kinase+and+Ikappa+B+Kinase.">NF-kappa B Activation by Double-Stranded-RNA-Activated Protein Kinase (PKR) Is Mediated through NF-kappa B-Inducing Kinase and Ikappa B Kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1278-1290 (2000).</li><li>Takada, Y., Ichikawa, H., Pataer, A., Swisher, S., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+deletion+of+PKR+abrogates+TNF-induced+activation+of+IkappaBalpha+kinase.">Genetic deletion of PKR abrogates TNF-induced activation of IkappaBalpha kinase.</a> JNK, Akt and cell proliferation but potentiates p44/p42 MAPK and p38 MAPK activation. Oncogene. 26 (8), 1201-1212 (2007).</li><li>Dabo, S., Meurs, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dsRNA-dependent+protein+kinase+PKR+and+its+role+in+stress,+signaling+and+HCV+infection.">dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection.</a> Viruses. 4 (11), 2598-2635 (2012).</li><li>Black, T. L., Safer, B., Hovanessian, A., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+68,000-Mr+Protein-Kinase+Is+Highly+Autophosphorylated+and+Activated+yet+Significantly+Degraded+during+Poliovirus+Infection+-+Implications+for+Translational+Regulation.">The Cellular 68,000-Mr Protein-Kinase Is Highly Autophosphorylated and Activated yet Significantly Degraded during Poliovirus Infection - Implications for Translational Regulation.</a> Journal of Virology. 63 (5), 2244-2251 (1989).</li><li>Bando, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+RNA+dependent+protein+kinase+(PKR)+is+involved+in+the+extrastriatal+degeneration+in+Parkinson's+disease+and+Huntington's+disease.">Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson's disease and Huntington's disease.</a> Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).</li><li>Onuki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-dependent+protein+kinase+is+involved+in+tunicamycin-induced+apoptosis+and+Alzheimer's+disease.">An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease.</a> The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).</li><li>Peel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+cell+stress+kinase+PKR+in+Alzheimer's+disease+and+human+amyloid+precursor+protein+transgenic+mice.">Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer's disease and human amyloid precursor protein transgenic mice.</a> Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).</li><li>Peel, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase,+PKR,+binds+preferentially+to+Huntington's+disease+(HD)+transcripts+and+is+activated+in+HD+tissue.">Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington's disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue.</a> Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).</li><li>Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upstream+signaling+pathways+leading+to+the+activation+of+double-stranded+RNA-dependent+serine/threonine+protein+kinase+in+beta-amyloid+peptide+neurotoxicity.">Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity.</a> Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+PKR+complexes+with+TRBP+in+Immunometabolic+regulation+and+eIF2alpha+phosphorylation+in+obesity.">A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity.</a> Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).</li><li>Saito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+the+interferon-induced+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+activity+by+Sindbis+virus+infection+and+heat-shock+stress.">Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress.</a> Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).</li><li>Youssef, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+for+snoRNAs+in+PKR+activation+during+metabolic+stress.">Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).</li><li>Murtha-Riel, P., Davies, M. V., Choi, S. Y., Hershey, J. W., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+Phosphorylation-resistant+Eukaryotic+Initiation+Factor+2+a-Subunit+Mitigates+Heat+Shock+Inhibition+of+Protein+Synthesis.">Expression of a Phosphorylation-resistant Eukaryotic Initiation Factor 2 a-Subunit Mitigates Heat Shock Inhibition of Protein Synthesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268, 12946-12951 (1993).</li><li>Benkirane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+potential+of+TAR+RNA+binding+protein+TRBP+and+its+regulatory+interaction+with+RNA-dependent+protein+kinase+PKR.">Oncogenic potential of TAR RNA binding protein TRBP and its regulatory interaction with RNA-dependent protein kinase PKR.</a> The EMBO Journal. 16 (3), 611-624 (1997).</li><li>Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+transformation+by+a+mutant+of+the+IFN-inducible+dsRNA-dependent+protein+kinase.">Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase.</a> Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKR+is+activated+by+cellular+dsRNAs+during+mitosis+and+acts+as+a+mitotic+regulator.">PKR is activated by cellular dsRNAs during mitosis and acts as a mitotic regulator.</a> Genes &amp; Development. 28 (12), 1310-1322 (2014).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+human+tarbp2+reveals+cellular+microRNA+targets+and+cell-cycle+function+of+TRBP.">Deletion of human tarbp2 reveals cellular microRNA targets and cell-cycle function of TRBP.</a> Cell Reports. 9 (3), 1061-1074 (2014).</li><li>Zhu, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+PKR+promotes+network+excitability+and+enhanced+cognition+by+interferon-gamma-mediated+disinhibition.">Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition.</a> Cell. 147 (6), 1384-1396 (2011).</li><li>Dagon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase,+PKR,+down-regulates+CDC2/cyclin+B1+and+induces+apoptosis+in+non-transformed+but+not+in+v-mos+transformed+cells.">Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells.</a> Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).</li><li>Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAU1+binding+3'+UTR+IRAlus+complements+nuclear+retention+to+protect+cells+from+PKR-mediated+translational+shutdown.">STAU1 binding 3' UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown.</a> Genes &amp; Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).</li><li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28A+is+a+suppressor+of+ER-associated+translation+in+embryonic+stem+cells.">LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells.</a> Cell. 151 (4), 765-777 (2012).</li><li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing.">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li><li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+(eCLIP).">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKR+Senses+Nuclear+and+Mitochondrial+Signals+by+Interacting+with+Endogenous+Double-Stranded+RNAs.">PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs.</a> Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).</li><li>Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Mapping+of+DROSHA+Cleavage+Sites+on+Primary+MicroRNAs+and+Noncanonical+Substrates.">Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates.</a> Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).</li><li>Ricci, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staufen1+senses+overall+transcript+secondary+structure+to+regulate+translation.">Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).</li><li>Kim, B., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fCLIP-seq+for+transcriptomic+footprinting+of+dsRNA-binding+proteins:+Lessons+from+DROSHA.">fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA.</a> Methods. , (2018).</li><li>Dhir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+double-stranded+RNA+triggers+antiviral+signalling+in+humans.">Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans.</a> Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).</li></ol>

ويتضح في عملية إعداد العينات القبض على المرحلة S أو M في الشكل 1. إلقاء القبض على الخلايا في مرحلة ثانية، استخدمنا أسلوب كتلة مزدوجة thymidine حيث أننا تعامل الخلايا مع thymidine مرتين مع إطلاق سراح 9 ح بينهما لضمان اعتقال عالية الكفاءة (الشكل 1A). م مرحلة الاعتقال، نحن ?...

كيناز البروتين المنشط الحمض النووي الريبي (PKR)، بدء التوكسينات تعرف أيضا باسم عامل 2-ألفا كيناز 2 (EIF2AK2)، هو كيناز بروتين تتسم جيدا أن ينقل المعلومات المقدمة من الكشف. وهو ينتمي إلى ترجمة حقيقية النواة بدء 2 ألفا فرعية (eIF2α) الأسرة كيناز وفوسفوريلاتيس eIF2α في سيرين 51 استجابة للعدوى لقمع الترجمة العالمي1. وفي هذا السياق، يتم تفعيل الكشف مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل الفيروسية (دسرناس)، التي توفر منبرا لروبية باكستانية ثنائي وأوتوفوسفوريليشن2روبية باكستانية. بالإضافة إلى eIF2α، يمكن أيضا أن فوسفوريلاتي روبية باكستانية كيناز ج-ن يونيو--المحطة الطرفية (جنك) بتنظيم أنشطة عديدة إشارة توصيل مسارات3،،من45، و κB المانع، p53 والركيزة مستقبلات الأنسولين 1 6.
واعتبرت روبية باكستانية الأصل كيناز التي فوسفوريلاتيد eIF2α أثناء الإصابة بفيروس شلل الأطفال بالاعتراف بفيروس شلل الأطفال دسرناس7،8. متزايدة وجدت روبية باكستانية لتلعب أدواراً متعددة الأوجه تتجاوز الاستجابة المناعية، وضمنا التنشيط الشاذة أو عطل في العديد من الأمراض البشرية. تنشيط فوسفوريلاتيد روبية باكستانية (بكر) وكثيراً ما لوحظ خلال المبرمج وهو سمة مشتركة للمرضى الذين يعانون من الأمراض التنكسية، لا سيما أمراض الأعصاب مثل هنتنغتون، باركنسون في، ومرض الزهايمر9 ،،من1011،،من1213. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تنشيط روبية باكستانية تحت ظروف الإجهاد المختلفة مثل الإجهاد الأيضية والحرارة صدمة14،15،،من1617. من ناحية أخرى، يؤدي تثبيط روبية باكستانية في الخلية زيادة الانتشار والتحول الخبيث حتى18،19. مهم أيضا في وظيفة المخ المعتادة الدالة روبية باكستانية وأثناء دورة الخلية كمستوى بكر هو مرتفعة خلال المرحلة م20،،من2122. وفي هذا السياق، بكر يمنع الترجمة العالمية ويوفر إشارات إلى نظم الإشارات الانقسامية الرئيسية اللازمة لانقسام الخلايا السليمة20. وعلاوة على ذلك، أدى التنشيط المطول من روبية باكستانية المرحلة G2/M زنزانات الاعتقال دورة الخلية في مبيض الهمستر الصيني23. ونتيجة لذلك، ينظم حلقة ردود الفعل السلبية لضمان التعطيل السريع خلال مرحلة انتقالية M/G121الفسفرة روبية باكستانية.
على الرغم من وظيفة طائفة واسعة من روبية باكستانية، فهمنا للتنشيط روبية باكستانية محدودة بسبب عدم وجود نهج موحد تجريبي الفائق لالتقاط وتحديد دسرناس التي يمكن تنشيط روبية باكستانية. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن بكر يمكن أن تتفاعل مع دسرناس التي شكلتها المقلوب الو يكرر (إيرالوس)،من2024، ولكن إمكانية وجود دسرناس الخلوية الإضافية التي يمكن تنشيط روبية باكستانية خلال دورة الخلية أو تحت وكانت ظروف الإجهاد في الخلايا البشرية لم تكتشف بعد. ويستخدم النهج التقليدية في تحديد الحمض النووي الريبي-التمثيلات بروتين الحمض النووي الريبي (الممارسات التجارية التقييدية) الأشعة فوق البنفسجية إلى التشعب الجيش الملكي النيبالي-الممارسات التجارية التقييدية مجمعات25،،من2627. دراسة أجريت مؤخرا تطبيق هذا النهج crosslinking الأشعة فوق البنفسجية في نظام ماوس وحدد أن الكشف النوية الصغيرة يمكن أن تنظم التنشيط روبية أثناء الإجهاد الأيضي16. عن طريق استخدام كفاءة عالية crosslinking فورمالدهايد، قدمنا طريقة بديلة لتحديد الكشف التفاعل روبية باكستانية خلال دورة الخلية في خلايا هيلا28. طبق نهج مماثل لدراسة أخرى دسرببس مثل شتاوفن ودروشا29،،من3031. ووجدنا أن بكر يمكن أن تتفاعل مع أنواع مختلفة من الكشف فضله مثل قصيرة العنصر النووي اينتيرسبيرسيد (شرط)، طويلة ويتخلل العنصر النووي (الخط)، وعنصر لفي الذاتية (ايرف)، والكشف حتى ألفا-الأقمار الصناعية. وباﻹضافة إلى ذلك، أظهرنا أن بكر يمكن أن تتفاعل مع الكشف الميتوكوندريا (مترناس)، الذي شكل دسرناس الجزيئات من خلال التفاعل التكميلية بين الثقيلة-حبلا وعلى ضوء حبلا الكشف28. كذلك أيد منشور صدر مؤخرا البيانات المتوفرة لدينا أن بعض مترناس موجودة في نموذج الطباعة على الوجهين ويمكن تنشيط أجهزة الاستشعار دسرنا مثل سرطان الجلد المرتبط بالتمايز البروتين 5 لحمل تداخلين32. الأهم من ذلك، التعبير والترجمة سوبسيلولار من مترناس يتم التضمين أثناء دورة الخلية، وعوامل الإجهاد المختلفة، التي قد تكون هامة في قدرتها على تنظيم روبية باكستانية التنشيط28.
في هذه المقالة، نقدم بروتوكول مفصل crosslinking فورمالدهايد المطورة حديثا وإيمونوبريسيبيتيشن (فكليب) طريقة التقاط وتحليل التفاعل روبية باكستانية الكشف أثناء دورة الخلية. علينا أن نظهر الأسلوب لإعداد دورة الخلية اعتقال العينات باستخدام thymidine ونوكودازولي. ثم نقدم عملية فكليب لعزل الكشف روبية باكستانية زمنياً وطريقة إعداد مكتبة التسلسل الفائق لتحديد هذه الكشف. وعلاوة على ذلك، نحن تحدد الإجراءات التفصيلية لتحليل الكشف روبية باكستانية زمنياً باستخدام PCR قرة. على وجه التحديد، فإننا نعرض إجراء نسخ عكسي حبلا محددة لتحليل سترانديدنيس مترناس. وصف البروتوكول هو الأمثل لخلايا هيلا وروبية باكستانية، ولكن يمكن تعديل الخطوات الرئيسية مثل إعداد نموذج دورة الخلية، فكليب، وتحليل محددة حبلا qRT-PCR بسهولة لدراسة دسرناس الخلوية أو لتحديد التمثيلات الحمض النووي الريبي لأخرى دسرببس.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris, pH 7.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Nonidet-p40 (NP-40)</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BN015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Urea-acrylamide gel solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7 M (w/v) Urea and 0.5X TBE, stored protected from light at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X DNA loading buffer</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; adaptor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M Sodium Acetate pH 5.5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; adaptor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-phenol chloroform, pH 4.5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Magnetic beads DNA/RNA clean up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic alkaline phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DGCR8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PKR (D7F7)</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>12297S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PKR (Milli)</td>
			<td>Millipore EMD</td>
			<td>07-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE27-2056-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue sodium salt</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>B5525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf intestinal alkaline phosphatase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2250A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper 25 cm 2-position</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMV promoter sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM001-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mixture (2.5 mM)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute, ACS Grade</td>
			<td>Alfa-Aesar</td>
			<td>A9951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M-TMS-013-BKR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>GB0235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.18766.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext rRNA Depletion Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6318</td>
			<td>rRNA Depletion Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal rabbit IgG</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>2729S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR forward primer (RP1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR index reverse primer (RPI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes with flat cap, 0.2 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate bufered saline (PBS) Tablet</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T9181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td>High-fidelity polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>c2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polynucleotide kinase (PNK)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2021A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail set III</td>
			<td>Merck</td>
			<td>535140-1MLCN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO1 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-GCCATAACCCAATACCAAACG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO1 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO2 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO2 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO3 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO3 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CYTB Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CYTB Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: GAPDH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND1 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND1 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND4 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND4 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND5 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND5 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND6 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND6 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random hexamer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SO142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/&#956;L)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2270A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rnase inhibitor (40 U/&#956;L)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribo-Zero rRNA Removal Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MRZH116</td>
			<td>rRNA Removal Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>FINEPCR, ROTATOR AG</td>
			<td>D1.5-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO1 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO1 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO2 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO2 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO3 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO3 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CYTB Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CYTB Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: GAPDH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND1 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND1 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND4 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND4 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND5 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND5 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND6 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND6 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube</td>
			<td>Bio Plas</td>
			<td>4167SLS50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dedecyl sulfate</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>S1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase In Rnase inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080093</td>
			<td>Reverse transcriptase for library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18090010</td>
			<td>Reverse transcriptase for qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR gold nucleic acid gl stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 2, truncated KQ</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-borate-EDTA buffer (TBE)</td>
			<td>TaKara</td>
			<td>T9122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultralink Protein A sepharose beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22810</td>
			<td>Protein A beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>Bioruptor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>UB0148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>VM-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-32P-ATP (10 &#956;Ci/&#956;L, 3.3 &#956;M)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>BLU502A100UC</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying rna interactors of protein kinase rna-activated during the mammalian cell cycle

كيناز البروتين المنشط الحمض النووي الريبي (PKR) هو عضو من البروتينات الاستجابة المناعية الفطرية ويعترف هيكل الفيروسية الكشف الثانوي مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل. عندما تلتزم بالكشف مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل الفيروسية (دسرناس)، يخضع روبية باكستانية ثنائي وأوتوفوسفوريلاتيون لاحقاً. فوسفوريلاتيد روبية باكستانية (بكر) تصبح نشطة، ويستحث الفسفرة فرعية ألفا عامل بدء حقيقية النواة 2 (eIF2α) لقمع الترجمة العالمية. أدلة متزايدة تشير إلى أن يمكن تنشيط روبية باكستانية تحت الظروف الفسيولوجية مثل أثناء دورة الخلية أو تحت ظروف الإجهاد المختلفة دون الإصابة. فهمنا لتفعيل الجيش الملكي النيبالي من روبية باكستانية غير محدودة بسبب عدم وجود أسلوب موحد التجريبية التقاط وتحليل التفاعل روبية باكستانية دسرناس. هنا، فإننا نقدم تجريبية البروتوكول تحديداً إثراء وتحليل روبية باكستانية ملزمة الكشف أثناء دورة الخلية باستخدام خلايا هيلا. فنحن نستخدم نشاط crosslinking كفاءة فورمالدهايد إصلاح المجمعات روبية باكستانية-الجيش الملكي النيبالي، وعزلها عن طريق إيمونوبريسيبيتيشن. يمكن ثم معالجة PKR co-إيمونوبريسيبيتاتيد الكشف كذلك إنشاء مكتبة تسلسل الفائق. فئة رئيسية واحدة من التفاعل روبية باكستانية دسرناس الخلوية هو الكشف الميتوكوندريا (مترناس)، التي يمكن أن توجد دسرناس الجزيئات من خلال التفاعل التكميلية بين الثقيلة-حبلا والكشف حبلا الضوء. لدراسة سترانديدنيس لهذه مترناس المزدوجة، نقدم أيضا بروتوكولا لمحددة حبلا qRT-PCR. أن البروتوكول هو الأمثل للتحليل للكشف روبية باكستانية زمنياً، ولكن يمكن تعديلها بسهولة لدراسة دسرناس الخلوية أو التمثيلات الحمض النووي الريبي للبروتينات ملزمة دسرنا الأخرى.

ويرد في الشكل 1تخطيطي لعملية إلقاء القبض على خلايا هيلا إلى المرحلة S أو M من دورة الخلية. لنموذج القبض على المرحلة M، نحن وضوح تصور الخلايا على شكل جولة تحت المجهر (الشكل 2A). دراسة كفاءة القبض على دورة الخلية، يمكن تحليل محتوى الخلية النووية باستخدام نظام ...

Watch this Scientific Journal Video about Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle at JoVE.com

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

نقدم النهج التجريبي لدراسة الحمض النووي الريبي-التمثيلات من مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي ملزمة البروتين كيناز تنشيط الحمض النووي الريبي (PKR) أثناء دورة الخلية الثديية باستخدام خلايا هيلا. ويستخدم هذا الأسلوب فورمالدهايد مجمعات التشعب الجيش الملكي النيبالي-روبية باكستانية وإيمونوبريسيبيتيشن لإثراء الكشف روبية باكستانية زمنياً. يمكن تحليل هذه الكشف كذلك من خلال التسلسل الفائق أو قرة-بكر.

دراسة التمثيلات الحمض النووي الريبي للبروتين كيناز المنشط الجيش الملكي النيبالي خلال دورة الخلية الثديية

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

يوفر هذا البروتوكول طريقة لتحديد التفاعلات الحمض النووي الريبي من البروتين RNA ملزمة PKR بطريقة الجينوم على نطاق واسع. يساعدنا على فهم أفضل للتنظيم بعد النسخ من التعبير الجيني عن طريق البروتين الملزم للرنا. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم الربط المتبادل الفعال للفورمالديهايد لإصلاح RNase ملزمة للبروتينات RNA ملزمة وإثراء لهم من خلال المناعة.ويلاحظ تنشيط PKR في المرضى الذين يعانون من مرض التنكس العصبي, مثل مرض باركنسون ومرض الزهايمر. إن تحديد RNASE المتفاعلة بين PKR وثنائية الخيوط سيساعدنا على فهم أفضل للأمراض لهذه الأمراض التنكسية. يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة تفاعل الحمض النووي الريبي لأي بروتينات RNA ملزمة.على وجه الخصوص، ونحن نعتقد أن هذه الطريقة مفيدة لدراسة البروتينات التي تعترف RNase منظم، مثل RNase مزدوجة تقطعت بهم السبل. تحقق من تجانس العينة التي تم القبض عليها من الدورة قبل حصاد الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم تحسين كفاءة المناعة باستخدام أفضل الأجسام المضادة المتاحة.للبدء، بذور 750، 000 أو مليون خلية هيلا لعينات S-أو M-المرحلة اعتقلت، على التوالي. تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. علاج الخلايا مع thymidine مليمولار اثنين، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.اغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. ثم، إضافة وسائل الإعلام الطازجة، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة تسع ساعات. بالنسبة للخلايا التي تم القبض عليها من مرحلة S، عالج الخلايا التي تحتوي على thymidine من ميليمترين.بالنسبة للخلايا التي تم القبض عليها من M-phase، عالج الخلايا التي تحتوي على 100 نانوغرام لكل ملليلتر من النوكودازول. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 ساعة. للحصول على عينة من مرحلة S، قم بجمع الخلايا مع مكشطة الخلية، ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.للحصول على عينة M-phase، انقر على جانب طبق ثقافة الخلية لفصل الخلايا التي تم القبض عليها من مرحلة M، ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. بعد ذلك، الطرد المركزي الخلايا في 380 غرام في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق. إزالة ناظر، وإعادة تعليق الخلايا مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني الباردة.نقل الخلايا إلى 1.5 ملليلتر microcentrifuge أنبوب. الطرد المركزي الخلايا في 10، 000 غرام في أربع درجات مئوية لمدة 30 ثانية، وإزالة المواد الفوقية تماما. لأداء الفورمالديهايد crosslinking، أولا إضافة 750 ميكرولترات من 0.1٪ paraformaldehyde إلى الخلايا، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لإصلاح الخلايا.ثم، إضافة 250 ميكرولترات من الجليسين واحد المولر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق إضافية لإخماد رد الفعل. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 10،000 غرام في أربع درجات مئوية لمدة 30 ثانية. إزالة عظمى تماما.بعد ذلك، resuspend مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي الخلايا في 10،000 غرام في أربع درجات مئوية لمدة 30 ثانية، وإزالة فائقة. Resuspend مع 400 ميكرولترات من fCLIP تحلل العازلة تستكمل مع 0.2 حجم في المئة مثبط البروتياز واثنين من مثبطات RNase حجم في المئة.احتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة، و sonicate باستخدام أوفوق الصوتيات. بعد ذلك، أضف 11 ميكرولترات من كلوريد الصوديوم الخماسي الضرس لضبط تركيز كلوريد الصوديوم إلى 150 ملليمولار، ودوامة لفترة وجيزة. ثم، الطرد المركزي في 21، 130 غرام في أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.نقل supernatants إلى ما قبل مبردة 1.5 ملليلتر microcentrifuge أنبوب. لأداء المناعة، أولا إضافة 20 ميكرولتر من البروتين الخرز في أنبوب microcentrifuge 1.5 ملليلتر. ثم، وغسل الخرز مع 400 ميكرولترات من عازلة تحلل fCLIP.الطرد المركزي الخرز في 1،000 غرام في أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. المقبل، وإزالة عظمى، إضافة 400 ميكرولترات من عازلة تحلل fCLIP بعناية، وإعادة بلطف حبات عن طريق عكس ثلاث إلى أربع مرات. كرر خطوة الغسيل ثلاث مرات.بعد الغسيل النهائي، إزالة االنبات تماما. Resuspend الخرز في 300 ميكرولترات من عازلة تحلل fCLIP. إضافة 8.3 ميكرولترات من كلوريد الصوديوم خمسة المولار لضبط تركيز كلوريد الصوديوم إلى 150 ملليمولار.إضافة 10 ميكرولترات من البروتين كيناز رنا تنشيط الأجسام المضادة، واحتضان على دوار في أربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات. بعد ذلك، الطرد المركزي الخرز في 1،000 غرام في أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. إزالة supernatant، إضافة 400 ميكرولترات من المخزن المؤقت غسيل fCLIP، وبلطف resuspend الخرز عن طريق عكس ثلاث إلى أربع مرات.كرر خطوة الغسيل مرتين. بعد الغسيل النهائي، إزالة االنبات تماما. بعد ذلك، إضافة 300 ميكرولترات من lysate، واحتضان في أربع درجات مئوية على دوار لمدة ثلاث ساعات.ثم، الطرد المركزي الخرز في 1،000 غرام في أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. إزالة supernatant، إضافة 400 ميكرولترات من المخزن المؤقت غسيل fCLIP، وبلطف resuspend الخرز عن طريق عكس ثلاث إلى أربع مرات. كرر خطوة الغسيل ثلاث مرات.بعد الغسيل النهائي، وإزالة ناظر تماما. المقبل، إضافة 300 ميكرولترات من fCLIP العازلة للتقليل من الانبعاثات. احتضان في ThermoMixer في 25 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات لteute البروتين كيناز RNA تنشيط من الخرز.جهاز طرد مركزي في 1،000 غرام في درجة حرارة الغرفة، ونقل super إلى أنبوب سيليكوني نظيفة. وأخيرا، إضافة 300 ميكرولترات من البروتينات K واحتضان بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية. وتم فحص كفاءة عملية القبض على خلايا هيلا في مرحلة S أو M باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية.أظهرت الأجسام المضادة D7F7 قدرة متفوقة على الترسب البروتين كيناز RNA تنشيط. أظهر تحليل البقعة الغربية لـ PKR المناعي المترسب أو الكلي HeLa lysate نطاقًا قويًا واحدًا فقط يتوافق مع حجم PKR ، مما يشير إلى أن الأجسام المضادة D7F7 محددة للغاية في التعرف على PKR. باستخدام الأجسام المضادة PKR مختلفة مع كفاءة مختلفة مناعية لهطول الأمطار، أدى إلى توزيع فئة مختلفة من خريطة تسلسل يقرأ.ولوحظ انخفاض في إشارة النظائر المشعة لـ RNase المُنَوَّزة بالـ PKR عند الإزالة الناجحة للرحم. PKR العينة الحمض النووي الريبي المشترك، وأظهرت إثراء قوي من RNase الميتوكوندريا مقارنة مع الضوابط السلبية. تم استخدام النسخ العكسي المحدد لـ STRAND للتمييز بين الخيط الثقيل والخفيف RNase الميتوكوندريا الذي كان مُناعيًا مشتركًا مع PKR للخلايا الموقوفة على مراحل S أو M.الخطوة الأكثر أهمية في إعداد عينة القبض دورة الخلية هي المكان الذي يجب غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وحيث يجب جمع فقط الخلايا الباستيل للتجانس أو سيكون ضعف العينة. بالنسبة للعملية الأخلاقية ، فإن الخطوات الأكثر أهمية هي الربط المتبادل للفورمالديهايد والكمية. بعد هذا الإجراء يمكن تحليل RNAs مائل باستخدام النشاف الشمالية، qRT PCR أو تسلسل الإنتاجية العالية.ويمكن لهذه التجارب أن تحدد نوع وكميات RNase النسبية المرتبطة بـ PKR. ويمكن تطبيق هذه التقنية لدراسة وتحديد التفاعلات الحمض النووي الريبي من البروتينات ملزمة RNA التي من شأنها أن تعزز فهمنا للتنظيم ما بعد النسخ من التعبير الجيني، بوساطة البروتينات ملزمة RNA. الفورمالديهايد خطرة لذلك التثبيت، والحل، ومخزن الغسيل الأولي تحتاج إلى التعامل معها بحذر.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

البروتين مجمع القبض على الانجذاب من خلايا الثدييات Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

فحص البروتين كيناس النشاط مع راديولابيلد أتب

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

تحليل توبرينتينج "الترجمة بدء تشكيل معقدة" في مرناس الثدييات

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

الأسفار خلايا حية تصوير "دورة الخلية الخضري كاملة" من "بكتيريا الاجتماعية" بطيئة النمو إكسانثوس ميكسوكوككوس

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

دراسة البروتين استيراد المعايشة باستخدام بروتوبلاستس

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

الإنسان المحيطية عزل العدلات الدم لاستجواب باركنسون المرتبطة LRRK2 مسار كيناز من خلال تقييم Rab10 الفوسفور

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

تطبيق قياس التداخل الحيوي (BLI) لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في النسخ

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

توصيف على المستوى الجزيئي باستخدام نهج كيميائية حيوية قوية لبروتين كيناز جديد

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

فحص مثبطات كيناز في ميكروصفائف البروتين البشري المجمعة ذاتيا

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...