Name: studying rna interactors of protein kinase rna-activated during the mammalian cell cycle
Uploaded: 2019-03-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על-ידי תוכנית מחקר מדעי בסיסי דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי ממשלת קוריאה משרד המדע ICT (ה-NRF-2016R1C1B2009886).

1. פתרון ותא הכנה
<ol><li>פתרון הכנה<ol>
<li>עבור המדיום התרבות תאים, היכונו בינוני תרבית תאים הלה על-ידי הוספת 50 מ של סרום שור עוברית (FBS) עד 500 מ"ל בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco). הערה: אנטיביוטיקה ניתן להוסיף המדיום התרבות תאים, אך אנחנו לא משתמשים אנטיביוטיקה.</li>
		<li>עבור paraformaldehyde 0.1%, להמיס 4% (w/v) para...

<ol>
	<li>Meurs, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+expression+of+human+double-stranded+RNA-activated+p68+kinase+in+murine+cells+mediates+phosphorylation+of+eukaryotic+initiation+factor+2+and+partial+resistance+to+encephalomyocarditis+virus+growth.">Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth.</a> Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).</li><li>Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interferon-inducible+double-stranded+RNA-activated+protein+kinase+self-associates+in+vitro+and+in+vivo.">The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).</li><li>Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAX/PACT-PKR+stress+response+pathway+promotes+p53+sumoylation+and+activation,+leading+to+G(1)+arrest.">The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest.</a> Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).</li><li>Yang, X., Nath, A., Opperman, M. J., Chan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+differentially+regulates+insulin+receptor+substrates+1+and+2+in+HepG2+cells.">The double-stranded RNA-dependent protein kinase differentially regulates insulin receptor substrates 1 and 2 in HepG2 cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (19), 3449-3458 (2010).</li><li>Zamanian-Daryoush, M., Mogensen, T. H., DiDonato, J. A., Williams, B. R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappa+B+Activation+by+Double-Stranded-RNA-Activated+Protein+Kinase+(PKR)+Is+Mediated+through+NF-kappa+B-Inducing+Kinase+and+Ikappa+B+Kinase.">NF-kappa B Activation by Double-Stranded-RNA-Activated Protein Kinase (PKR) Is Mediated through NF-kappa B-Inducing Kinase and Ikappa B Kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1278-1290 (2000).</li><li>Takada, Y., Ichikawa, H., Pataer, A., Swisher, S., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+deletion+of+PKR+abrogates+TNF-induced+activation+of+IkappaBalpha+kinase.">Genetic deletion of PKR abrogates TNF-induced activation of IkappaBalpha kinase.</a> JNK, Akt and cell proliferation but potentiates p44/p42 MAPK and p38 MAPK activation. Oncogene. 26 (8), 1201-1212 (2007).</li><li>Dabo, S., Meurs, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dsRNA-dependent+protein+kinase+PKR+and+its+role+in+stress,+signaling+and+HCV+infection.">dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection.</a> Viruses. 4 (11), 2598-2635 (2012).</li><li>Black, T. L., Safer, B., Hovanessian, A., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+68,000-Mr+Protein-Kinase+Is+Highly+Autophosphorylated+and+Activated+yet+Significantly+Degraded+during+Poliovirus+Infection+-+Implications+for+Translational+Regulation.">The Cellular 68,000-Mr Protein-Kinase Is Highly Autophosphorylated and Activated yet Significantly Degraded during Poliovirus Infection - Implications for Translational Regulation.</a> Journal of Virology. 63 (5), 2244-2251 (1989).</li><li>Bando, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+RNA+dependent+protein+kinase+(PKR)+is+involved+in+the+extrastriatal+degeneration+in+Parkinson's+disease+and+Huntington's+disease.">Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson's disease and Huntington's disease.</a> Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).</li><li>Onuki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-dependent+protein+kinase+is+involved+in+tunicamycin-induced+apoptosis+and+Alzheimer's+disease.">An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease.</a> The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).</li><li>Peel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+cell+stress+kinase+PKR+in+Alzheimer's+disease+and+human+amyloid+precursor+protein+transgenic+mice.">Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer's disease and human amyloid precursor protein transgenic mice.</a> Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).</li><li>Peel, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase,+PKR,+binds+preferentially+to+Huntington's+disease+(HD)+transcripts+and+is+activated+in+HD+tissue.">Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington's disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue.</a> Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).</li><li>Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upstream+signaling+pathways+leading+to+the+activation+of+double-stranded+RNA-dependent+serine/threonine+protein+kinase+in+beta-amyloid+peptide+neurotoxicity.">Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity.</a> Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+PKR+complexes+with+TRBP+in+Immunometabolic+regulation+and+eIF2alpha+phosphorylation+in+obesity.">A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity.</a> Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).</li><li>Saito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+the+interferon-induced+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+activity+by+Sindbis+virus+infection+and+heat-shock+stress.">Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress.</a> Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).</li><li>Youssef, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+for+snoRNAs+in+PKR+activation+during+metabolic+stress.">Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).</li><li>Murtha-Riel, P., Davies, M. V., Choi, S. Y., Hershey, J. W., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+Phosphorylation-resistant+Eukaryotic+Initiation+Factor+2+a-Subunit+Mitigates+Heat+Shock+Inhibition+of+Protein+Synthesis.">Expression of a Phosphorylation-resistant Eukaryotic Initiation Factor 2 a-Subunit Mitigates Heat Shock Inhibition of Protein Synthesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268, 12946-12951 (1993).</li><li>Benkirane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+potential+of+TAR+RNA+binding+protein+TRBP+and+its+regulatory+interaction+with+RNA-dependent+protein+kinase+PKR.">Oncogenic potential of TAR RNA binding protein TRBP and its regulatory interaction with RNA-dependent protein kinase PKR.</a> The EMBO Journal. 16 (3), 611-624 (1997).</li><li>Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+transformation+by+a+mutant+of+the+IFN-inducible+dsRNA-dependent+protein+kinase.">Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase.</a> Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKR+is+activated+by+cellular+dsRNAs+during+mitosis+and+acts+as+a+mitotic+regulator.">PKR is activated by cellular dsRNAs during mitosis and acts as a mitotic regulator.</a> Genes &amp; Development. 28 (12), 1310-1322 (2014).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+human+tarbp2+reveals+cellular+microRNA+targets+and+cell-cycle+function+of+TRBP.">Deletion of human tarbp2 reveals cellular microRNA targets and cell-cycle function of TRBP.</a> Cell Reports. 9 (3), 1061-1074 (2014).</li><li>Zhu, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+PKR+promotes+network+excitability+and+enhanced+cognition+by+interferon-gamma-mediated+disinhibition.">Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition.</a> Cell. 147 (6), 1384-1396 (2011).</li><li>Dagon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase,+PKR,+down-regulates+CDC2/cyclin+B1+and+induces+apoptosis+in+non-transformed+but+not+in+v-mos+transformed+cells.">Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells.</a> Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).</li><li>Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAU1+binding+3'+UTR+IRAlus+complements+nuclear+retention+to+protect+cells+from+PKR-mediated+translational+shutdown.">STAU1 binding 3' UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown.</a> Genes &amp; Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).</li><li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28A+is+a+suppressor+of+ER-associated+translation+in+embryonic+stem+cells.">LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells.</a> Cell. 151 (4), 765-777 (2012).</li><li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing.">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li><li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+(eCLIP).">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKR+Senses+Nuclear+and+Mitochondrial+Signals+by+Interacting+with+Endogenous+Double-Stranded+RNAs.">PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs.</a> Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).</li><li>Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Mapping+of+DROSHA+Cleavage+Sites+on+Primary+MicroRNAs+and+Noncanonical+Substrates.">Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates.</a> Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).</li><li>Ricci, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staufen1+senses+overall+transcript+secondary+structure+to+regulate+translation.">Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).</li><li>Kim, B., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fCLIP-seq+for+transcriptomic+footprinting+of+dsRNA-binding+proteins:+Lessons+from+DROSHA.">fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA.</a> Methods. , (2018).</li><li>Dhir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+double-stranded+RNA+triggers+antiviral+signalling+in+humans.">Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans.</a> Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).</li></ol>

באיור1 מודגם התהליך להכין בבידוד-שלב דגימות S או M. לעצור תאים בשלב S, השתמשנו שיטה בלוק זוגי תימידין שבו התייחסנו תאים עם תימידין פעמיים עם שחרורו 9 h בין כדי להבטיח יעילות גבוהה מעצר (איור 1 א'). מעצר שלב M, התייחסנו תאים פעם אחת עם תימידין ולאחריו שחרור 9 h, ואז נמ...

קינאז # פרוטאין קינאז מופעל RNA (PKR), הידוע גם בשם האיקריוטים חניכה פקטור 2-אלפא קינאז 2 (EIF2AK2), היא קינאז מאופיין היטב ששולחות מידע שסופק על-ידי RNAs. זה שייך האלפא יחידה משנית חניכה 2 תרגום האיקריוטים (eIF2α) המשפחה קינאז, phosphorylates eIF2α-סרין 51 בתגובה לזיהום לדכא את תרגום כללי1. בהקשר זה, PKR מופעל על ידי נגיפי RNAs גדילי כפול (dsRNAs), המספקים פלטפורמה PKR dimerization ו autophosphorylation2. בנוסף eIF2α, PKR יכול phosphorylate גם p53, המצע קולטן לאינסולין 1, מעכב κB וקינאז c-Jun N-מסוף (JNK) להסדיר את הפעילות של רבים האות התמרה חושית מסלולים3,4,5, 6.
PKR זוהה במקור קינאז זה phosphorylated eIF2α במהלך poliovirus זיהום על ידי זיהוי של poliovirus-dsRNAs-7,-8. PKR מצוי יותר ויותר כדי לשחק תפקידים רבת מעבר התגובה החיסונית, aberrant ההפעלה או תקלה שלה היא משתמעת אינספור מחלות אנושיות. PKR מופעל/Phosphorylated (pPKR) נצפית לעתים קרובות במהלך אפופטוזיס, היא מאפיין נפוץ של חולים עם מחלות ניווניות, במיוחד מחלות ניווניות כגון הנטינגטון, פרקינסון של, מחלת אלצהיימר9 ,10,11,12,13. בנוסף, PKR מופעלת בתנאים מתח שונים כגון מתח מטבולית, חום הלם14,15,16,17. מצד שני, עיכוב של PKR התוצאה התפשטות תאים מוגברת שינוי ממאיר אפילו18,19. PKR פונקציה חשובה גם בתפקוד מוח נורמלי, במהלך מחזור התא ככל שרמת pPKR גבוהות במהלך21,2220,שלב M. בהקשר זה, pPKR מעלימה תרגום גלובלית, מספקת רמזים כדי מערכות איתות mitotic מפתח הנדרשים עבור חלוקת התא המתאים20. יתר על כן, הפעלה ממושכת של PKR הביא בשלב G2/M מחזור התא מעצר בתוך השחלה אוגר סיני תאים23. כתוצאה מכך, זרחון PKR מוסדר על ידי הלופ משוב שלילי על מנת להבטיח שחרור משרות מהיר במהלך המעבר M/G121.
למרות הפונקציה טווח רחב של PKR, ההבנה שלנו של PKR ההפעלה מוגבלת בשל חוסר גישה ניסיוני מתוקננת של תפוקה גבוהה כדי ללכוד ולזהות dsRNAs לבצע הפעלה PKR. מחקרים קודמים הראו כי PKR יכול לקיים אינטראקציה עם dsRNAs הנוצרת על-ידי שני הפוך Alu חזרה (IRAlus)20,24, אבל האפשרות לקיומו של dsRNAs הסלולר נוספים לבצע הפעלה PKR במהלך מחזור התא, או תחת תנאי הלחץ בתאי אדם היה שאינו גלוי. הגישה המקובלת לזיהוי RNA-interactors של RNA מחייב חלבון (RBP) משתמש אור UV עד crosslink RNA-RBP מתחמי25,26,27. מחקר שנערך לאחרונה ליישם גישה זו crosslinking UV מערכת עכבר וזיהה RNAs nucleolar קטן יכול לווסת את הפעלת PKR במהלך מתח מטבולית16. על ידי ניצול היעילות crosslinking גבוהה של פורמלדהיד, הצגנו שיטה חלופית לזהות אינטראקציה-PKR RNAs במהלך מחזור התא הלה תאים28. בגישה דומה הוחל ללמוד dsRBPs אחרים כגון Staufen ו Drosha29,30,31. מצאנו כי PKR יכול לקיים אינטראקציה עם סוגים שונים של noncoding RNAs כגון קצר וביניהם גרעיני רכיב (סינוס), רב וביניהם רכיב גרעינית (קו), אלמנט הרטרווירוס אנדוגני (ארב) ו RNAs אפילו אלפא-לוויין. בנוסף, הראינו כי PKR יכול לקיים אינטראקציה עם RNAs מיטוכונדריאלי (mtRNAs), אשר dsRNAs הבין-מולקולרי של טופס דרך משלימים האינטראקציה בין סטרנד-הכבד את האור לנטישה של RNAs28. פרסום האחרונות תמיכה נוספת הנתונים שלנו כי כמה mtRNAs קיים בצורה דו-צדדית, והוא יכול להפעיל dsRNA חיישנים כגון מלנומה בידול-הקשורים חלבון 5 לזירוז האינטרפרונים32. חשוב מכך, הביטוי ואת subcellular לוקליזציה של mtRNAs מאופנן במהלך מחזור התא ועל ידי לחצים שונים, אשר עשוי להיות חשוב על היכולת לווסת את הפעלת PKR28.
במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט crosslinking פורמלדהיד שפותח לאחרונה, immunoprecipitation (fCLIP) שיטת לכידת וניתוח RNAs אינטראקציה-PKR במהלך מחזור התא. נדגים את השיטה כדי להכין דגימות מעצר מחזור התא באמצעות תימידין ו- nocodazole. לאחר מכן נציג את תהליך fCLIP כדי לבודד RNAs מאוגד-PKR, שיטה להכין ספריית רצף תפוקה גבוהה לזהות אלה RNAs. יתר על כן, אנו ניסחו הליכים מפורטים לנתח RNAs PKR מאוגד באמצעות לרביעיית-PCR. באופן ספציפי, אנו מציגים את הליך שעתוק במהופך סטרנד ספציפיים כדי לנתח את strandedness של mtRNAs. הפרוטוקול המתואר ממוטבת עבור הלה תאים ו- PKR, אך השלבים החשובים כגון הכנת לדוגמה מחזור התא, fCLIP, וניתוח סטרנד ספציפיים לרביעיית-PCR אפשר בקלות לשנות כדי ללמוד dsRNAs הסלולר או כדי לזהות רנ א interactors של אחרים dsRBPs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris, pH 7.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Nonidet-p40 (NP-40)</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BN015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Urea-acrylamide gel solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7 M (w/v) Urea and 0.5X TBE, stored protected from light at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X DNA loading buffer</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; adaptor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M Sodium Acetate pH 5.5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; adaptor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-phenol chloroform, pH 4.5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Magnetic beads DNA/RNA clean up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic alkaline phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DGCR8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PKR (D7F7)</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>12297S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PKR (Milli)</td>
			<td>Millipore EMD</td>
			<td>07-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE27-2056-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue sodium salt</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>B5525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf intestinal alkaline phosphatase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2250A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper 25 cm 2-position</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMV promoter sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM001-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mixture (2.5 mM)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute, ACS Grade</td>
			<td>Alfa-Aesar</td>
			<td>A9951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M-TMS-013-BKR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>GB0235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.18766.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext rRNA Depletion Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6318</td>
			<td>rRNA Depletion Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal rabbit IgG</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>2729S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR forward primer (RP1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR index reverse primer (RPI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes with flat cap, 0.2 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate bufered saline (PBS) Tablet</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T9181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td>High-fidelity polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>c2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polynucleotide kinase (PNK)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2021A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail set III</td>
			<td>Merck</td>
			<td>535140-1MLCN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO1 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-GCCATAACCCAATACCAAACG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO1 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO2 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO2 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO3 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO3 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CYTB Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CYTB Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: GAPDH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND1 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND1 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND4 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND4 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND5 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND5 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND6 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND6 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random hexamer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SO142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/&#956;L)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2270A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rnase inhibitor (40 U/&#956;L)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribo-Zero rRNA Removal Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MRZH116</td>
			<td>rRNA Removal Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>FINEPCR, ROTATOR AG</td>
			<td>D1.5-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO1 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO1 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO2 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO2 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO3 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO3 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CYTB Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CYTB Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: GAPDH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND1 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND1 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND4 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND4 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND5 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND5 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND6 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND6 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube</td>
			<td>Bio Plas</td>
			<td>4167SLS50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dedecyl sulfate</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>S1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase In Rnase inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080093</td>
			<td>Reverse transcriptase for library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18090010</td>
			<td>Reverse transcriptase for qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR gold nucleic acid gl stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 2, truncated KQ</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-borate-EDTA buffer (TBE)</td>
			<td>TaKara</td>
			<td>T9122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultralink Protein A sepharose beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22810</td>
			<td>Protein A beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>Bioruptor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>UB0148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>VM-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-32P-ATP (10 &#956;Ci/&#956;L, 3.3 &#956;M)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>BLU502A100UC</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying rna interactors of protein kinase rna-activated during the mammalian cell cycle

קינאז # פרוטאין קינאז מופעל RNA (PKR) חברה של החלבונים תגובה חיסונית מולדת, מזהה את המבנה משני גדילי כפול של RNAs ויראלי. PKR כאשר הוא מאוגד כדי כפול גדילי ויראלי RNAs (dsRNAs), עובר dimerization ו- autophosphorylation הבאים. PKR phosphorylated (pPKR) הופכת לפעילה ומשרה זירחון של יחידת משנה אלפא של חניכה האיקריוטים פקטור 2 (eIF2α) כדי לדכא את התרגום גלובלית. הגדלת הראיות עולה כי יכול להיות מופעל PKR בתנאים פיזיולוגיים כגון במהלך מחזור התא או בתנאים מתח שונים ללא זיהום. לעומת זאת, ההבנה שלנו של רנ א. תנתק של PKR מוגבל בשל חוסר שיטה ניסיונית מתוקננת לכידת וניתוח dsRNAs אינטראקציה-PKR. כאן, אנו מציגים את ניסיוני פרוטוקול במיוחד להעשיר ולנתח PKR מאוגד RNAs במהלך מחזור התא באמצעות תאים הלה. אנו מנצלים את הפעילות crosslinking יעיל של פורמלדהיד כדי לתקן את מתחמי PKR-RNA ולבודד אותם באמצעות immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs ואז יעובד נוספת כדי ליצור ספריה רצף תפוקה גבוהה. אחד כיתת אינטראקציה-PKR dsRNAs הסלולר העיקרי הוא RNAs מיטוכונדריאלי (mtRNAs), אשר יכולה להתקיים בתור dsRNAs הבין-מולקולרי כתהליכי משלימים בין סטרנד-הכבד את RNAs אור-strand. ללמוד את strandedness של אלה mtRNAs דופלקס, אנו מציגים גם עבור סטרנד ספציפיים לרביעיית-PCR פרוטוקול. פרוטוקול שלנו ממוטב עבור הניתוח של RNAs מאוגד-PKR, אך שניתן יהיה לשנותה בקלות ללמוד dsRNAs הסלולר או RNA-interactors של אחרים dsRNA מחייב חלבונים.

מפרטים טכניים עבור התהליך לעצור הלה תאים בשלב S או M של מחזור התא מוצג באיור1. עבור דוגמה מ' בבידוד-שלב, שאנו יכולים לדמיין בבירור עגול בצורת התאים במיקרוסקופ (איור 2 א). לבחון את היעילות של המעצר מחזור התא, התוכן הגרעיני של התא יכול להיות מנותח באמצעות FACS (<st...

Watch this Scientific Journal Video about Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle at JoVE.com

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

אנו מציגים גישות ניסיוניות של RNA-interactors לימוד של זוגיות גדילי RNA מחייב חלבון קינאז מופעל RNA (PKR) במהלך מחזור התא יונקים באמצעות תאים הלה. שיטה זו משתמשת פורמלדהיד קומפלקסים crosslink RNA-PKR, immunoprecipitation להעשיר PKR מכורך RNAs. אלה RNAs ניתן לנתח נוסף דרך רצף תפוקה גבוהה או לרביעיית-PCR.

לומד RNA Interactors של חלבון ה-RNA-מופעל במהלך מחזור התא בתרבית

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

פרוטוקול זה מספק שיטה לזיהוי אינטראקציות RNA של PKR חלבון מחייב RNA באופן גנום רחב. זה עוזר לנו להבין טוב יותר את הרגולציה שלאחר שעתוק של ביטוי גנים על ידי חלבון מחייב RNA. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מנצלת crosslinking יעיל של פורמלדהיד כדי לתקן RNase קשור חלבונים מחייב RNA ולהעשיר אותם באמצעות immunoprecipitation.PKR פעיל נצפתה בחולים עם מחלה ניוונית, כגון פרקינסון ואלצהיימר. זיהוי PKR-אינטראקציה כפולה תקוע RNase יעזור לנו להבין טוב יותר את הפתוגנזה של מחלות ניווניות אלה. שיטה זו יכולה לשמש לחקר אינטראקציות RNA של כל חלבונים מחייבי RNA.בפרט, אנו מאמינים כי שיטה זו שימושית ללמוד חלבונים המזהים את RNase מובנה, כגון RNase כפול תקוע. בדוק את ההומוגניות של המדגם שנעצר במחזור לפני קצירת תאים. בנוסף, חיוני לייעל את יעילות immunoprecipitation באמצעות הנוגדן הטוב ביותר הזמין.כדי להתחיל, זרע 750, 000 או מיליון תאי HeLa עבור דגימות S-או M-פאזה נעצר, בהתאמה. לגדל תאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 24 שעות. לטפל בתאים עם תימידין שני מילימולרים, ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות.לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. לאחר מכן, מוסיפים מדיה טרייה, ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך תשע שעות. עבור תאים שנעצרו בשלב S, לטפל בתאים עם תימידין שני מילימולר.עבור תאים שנעצרו M-פאזה, לטפל בתאים עם 100 ננוגרם למיליליטר של nocodazole. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 שעות. לקבלת דגימת S-phase, לאסוף תאים עם מגרד תאים, ולהעביר לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר.לקבלת דגימת M-phase, הקש על הצד של צלחת תרבות התאים כדי לנתק תאים שנעצרו על-ידי M-phase, והעבר אותם לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה התאים ב 380 גרם בטמפרטורת החדר במשך שלוש דקות. הסר את על-טבעי, ו resuspend התאים עם מיליליטר אחד של PBS קר.מעבירים תאים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה התאים ב 10, 000 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 שניות, ולהסיר את supernatants לחלוטין. כדי לבצע הצלבה פורמלדהיד, תחילה להוסיף 750 microliters של 0.1% paraformaldehyde לתאים, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות כדי לתקן את התאים.לאחר מכן, מוסיפים 250 מיקרוליטרים של גליצין אחד טוחן ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות נוספות כדי לרוות את התגובה. צנטריפוגה התאים ב 10, 000 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 שניות. הסר את העל-טבעיים לחלוטין.לאחר מכן, תן שימוש חוזר עם מיליליטר אחד של PBS. צנטריפוגה התאים ב 10, 000 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 שניות, ולהסיר את supernatant. תן מחדש עם 400 microliters של מאגר תזה fCLIP בתוספת 0.2 נפח אחוז מעכב פרוטאז ושני אחוז נפח מעכב RNase.דגירה על קרח במשך 10 דקות, ו sonicate באמצעות ultrasonicator. לאחר מכן, להוסיף 11 microliters של חמישה כלוריד נתרן טוחן כדי להתאים את ריכוז נתרן כלורי ל 150 מילימולר, ומערבולת לזמן קצר. ואז, צנטריפוגה ב 21, 130 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.מעבירים את העל-טבעיים לצינור מיקרוצנטריפוגה מקורר מראש של 1.5 מיליליטר. כדי לבצע immunoprecipitation, תחילה להוסיף 20 microliters של חלבון A חרוזים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, לשטוף את חרוזים עם 400 microliters של מאגר תזה fCLIP.צנטריפוגה את חרוזים ב 1, 000 גרם בארבע מעלות צלזיוס לדקה אחת. לאחר מכן, הסר את העל-טבעי, הוסף 400 מיקרוליטרים של מאגר תיזה fCLIP בזהירות, ולחץ בעדינות על חרוזים על-ידי היפוך שלוש עד ארבע פעמים. חזור על שלב הכביסה שלוש פעמים.לאחר הכביסה הסופית, להסיר את supernatants לחלוטין. התן מחדש את חרוזים ב 300 microliters של מאגר תזה fCLIP. הוסף 8.3 microliters של חמישה כלוריד נתרן טוחן כדי להתאים את ריכוז נתרן כלורי ל 150 מילימולר.מוסיפים 10 מיקרוליטרים של נוגדן המופעל על ידי RNA של חלבון קינאז, ודורגים על מסובב בארבע מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות. לאחר מכן, צנטריפוגה את חרוזים ב 1, 000 גרם בארבע מעלות צלזיוס לדקה אחת. הסר את העל-טבעי, הוסף 400 מיקרוליטרים של מאגר שטיפת fCLIP, ולחץ בעדינות על חרוזים על-ידי היפוך שלוש עד ארבע פעמים.חזור על שלב הכביסה פעמיים. לאחר הכביסה הסופית, להסיר את supernatants לחלוטין. לאחר מכן, מוסיפים 300 מיקרוליטרים של ליט, ו דגירה בארבע מעלות צלזיוס על מסובב במשך שלוש שעות.לאחר מכן, צנטריפוגה את חרוזים ב 1, 000 גרם בארבע מעלות צלזיוס לדקה אחת. הסר את העל-טבעי, הוסף 400 מיקרוליטרים של מאגר שטיפת fCLIP, ולחץ בעדינות על חרוזים על-ידי היפוך שלוש עד ארבע פעמים. חזור על שלב הכביסה שלוש פעמים.לאחר הכביסה הסופית, להסיר את העל טבעי לחלוטין. לאחר מכן, הוסף 300 מיקרוליטרים של מאגר אלוט fCLIP. דגירה ב ThermoMixer ב 25 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות כדי לשאוב חלבון קינאז RNA מופעל מן חרוזים.צנטריפוגה ב 1, 000 גרם בטמפרטורת החדר, ולהעביר את supernatants לצינור סיליקון נקי. לבסוף, מוסיפים 300 מיקרוליטרים של Proteinase K ו דגירה לילה ב 65 מעלות צלזיוס. היעילות של מעצר מחזור התא של תאי HeLa בשלב S או M נבדקו באמצעות FACS.נוגדן D7F7 הראה יכולת מעולה לזרז RNA קינאז חלבון מופעל. ניתוח כתם מערבי של אימונו PKR זירז או סך HeLa lysate הראה רק רצועה חזקה אחת המתאימה לגודל של PKR, המציין כי הנוגדן D7F7 הוא ספציפי מאוד בזיהוי PKR. שימוש בנוגדני PKR שונים עם יעילות משקעים חיסונית שונה, הביא להתפלגות מעמדית שונה של קריאות רצף מפות.ירידה באות radioisotope עבור PKR שיתוף immunoprecipitated RNase נצפתה על הסרת rRNA מוצלחת. PKR שיתוף immunoprecipitated מדגם RNA, הראה העשרה חזקה של RNase המיטוכונדריאלי לעומת הפקדים השליליים. שעתוק הפוך ספציפי סטרנד שימש כדי להבחין RNase מיטוכונדריאלי גדיל כבד וקל שהיו יחד עם PKR עבור תאים שנעצרו שלב S או M.השלב הקריטי ביותר בהכנת מדגם מעצר מחזור התא הם שבו אתה חייב לשטוף את התאים פעמיים עם PBS ואיפה אתה חייב לאסוף רק תאים פסטל עבור הומוגניות או יהיה מדגם לקוי. עבור תהליך אתי, הצעדים הקריטיים ביותר הם הצלבה פורמלדהיד וכמות. לאחר הליך זה ניתן לנתח את RNAs eluted באמצעות כתמים בצפון, PCR qRT או רצף תפוקה גבוהה.ניסויים אלה יכולים לזהות את הסוג ואת הכמות היחסית של RNase מאוגד PKR. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד ולזהות אינטראקציות RNA של חלבונים מחייבים RNA אשר ישפרו את ההבנה שלנו של ויסות שלאחר שעתוק של ביטוי גנים, מתווך על ידי חלבונים מחייבים RNA. פורמלדהיד מסוכן ולכן יש לטפל בזהירות בהקבעה, בפתרון ובאגר הכביסה הראשוני.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

ניתוח Toeprinting של תרגום חניכה היווצרות מורכבות על יונקים mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

קרינה פלואורסצנטית Live-תא הדמיה של שלמה וגטטיבי תא מחזור של חיידק חברתית גידול איטי Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

לומד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט באמצעות Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

דם היקפי הדם נויטרופילים בידוד עבור חקירת פרקינסון הקשורים LRRK2 קינאז מסלול על ידי הערכת Rab10 זירחון

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

יישום של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) ללימוד אינטראקציות חלבונים-חלבונים בתמלול

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

הקרנת מעכבי קינאז במיקרוערכים של חלבון אנושי מורכב בעצמו

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...