Name: studying rna interactors of protein kinase rna-activated during the mammalian cell cycle
Uploaded: 2019-03-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle at JoVE.com

이 작품은 기본적인 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF) 한국 정부 교육부의 과학 및 ICT (NRF-2016R1C1B2009886)에 의해 자금에 의해 지원 되었다.

1. 솔루션 및 세포 준비
<ol><li>솔루션 준비<ol>
<li>세포 배양에 대 한 준비 매체 헬러 세포 배양에 대 한 소 태아 혈 청 (FBS) 50 mL를 추가 하 여 500 mL Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)의. 참고: 항생제는 세포 배양에 추가 될 수 있지만 우리는 항생제를 사용 하지 않습니다.</li>
		<li>0.1 %paraformaldehyde 대 1에서 4% (w/v) paraformaldehyde 분해 x Phosphate-Buffered 염 분 (PBS) 난방 및 희석 뜨거운 접시에 1 x PBS를 추가 ...

<ol>
	<li>Meurs, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+expression+of+human+double-stranded+RNA-activated+p68+kinase+in+murine+cells+mediates+phosphorylation+of+eukaryotic+initiation+factor+2+and+partial+resistance+to+encephalomyocarditis+virus+growth.">Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth.</a> Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).</li><li>Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interferon-inducible+double-stranded+RNA-activated+protein+kinase+self-associates+in+vitro+and+in+vivo.">The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).</li><li>Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAX/PACT-PKR+stress+response+pathway+promotes+p53+sumoylation+and+activation,+leading+to+G(1)+arrest.">The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest.</a> Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).</li><li>Yang, X., Nath, A., Opperman, M. J., Chan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+differentially+regulates+insulin+receptor+substrates+1+and+2+in+HepG2+cells.">The double-stranded RNA-dependent protein kinase differentially regulates insulin receptor substrates 1 and 2 in HepG2 cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (19), 3449-3458 (2010).</li><li>Zamanian-Daryoush, M., Mogensen, T. H., DiDonato, J. A., Williams, B. R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappa+B+Activation+by+Double-Stranded-RNA-Activated+Protein+Kinase+(PKR)+Is+Mediated+through+NF-kappa+B-Inducing+Kinase+and+Ikappa+B+Kinase.">NF-kappa B Activation by Double-Stranded-RNA-Activated Protein Kinase (PKR) Is Mediated through NF-kappa B-Inducing Kinase and Ikappa B Kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1278-1290 (2000).</li><li>Takada, Y., Ichikawa, H., Pataer, A., Swisher, S., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+deletion+of+PKR+abrogates+TNF-induced+activation+of+IkappaBalpha+kinase.">Genetic deletion of PKR abrogates TNF-induced activation of IkappaBalpha kinase.</a> JNK, Akt and cell proliferation but potentiates p44/p42 MAPK and p38 MAPK activation. Oncogene. 26 (8), 1201-1212 (2007).</li><li>Dabo, S., Meurs, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dsRNA-dependent+protein+kinase+PKR+and+its+role+in+stress,+signaling+and+HCV+infection.">dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection.</a> Viruses. 4 (11), 2598-2635 (2012).</li><li>Black, T. L., Safer, B., Hovanessian, A., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+68,000-Mr+Protein-Kinase+Is+Highly+Autophosphorylated+and+Activated+yet+Significantly+Degraded+during+Poliovirus+Infection+-+Implications+for+Translational+Regulation.">The Cellular 68,000-Mr Protein-Kinase Is Highly Autophosphorylated and Activated yet Significantly Degraded during Poliovirus Infection - Implications for Translational Regulation.</a> Journal of Virology. 63 (5), 2244-2251 (1989).</li><li>Bando, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+RNA+dependent+protein+kinase+(PKR)+is+involved+in+the+extrastriatal+degeneration+in+Parkinson's+disease+and+Huntington's+disease.">Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson's disease and Huntington's disease.</a> Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).</li><li>Onuki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-dependent+protein+kinase+is+involved+in+tunicamycin-induced+apoptosis+and+Alzheimer's+disease.">An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease.</a> The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).</li><li>Peel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+cell+stress+kinase+PKR+in+Alzheimer's+disease+and+human+amyloid+precursor+protein+transgenic+mice.">Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer's disease and human amyloid precursor protein transgenic mice.</a> Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).</li><li>Peel, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase,+PKR,+binds+preferentially+to+Huntington's+disease+(HD)+transcripts+and+is+activated+in+HD+tissue.">Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington's disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue.</a> Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).</li><li>Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upstream+signaling+pathways+leading+to+the+activation+of+double-stranded+RNA-dependent+serine/threonine+protein+kinase+in+beta-amyloid+peptide+neurotoxicity.">Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity.</a> Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+PKR+complexes+with+TRBP+in+Immunometabolic+regulation+and+eIF2alpha+phosphorylation+in+obesity.">A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity.</a> Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).</li><li>Saito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+the+interferon-induced+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+activity+by+Sindbis+virus+infection+and+heat-shock+stress.">Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress.</a> Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).</li><li>Youssef, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+for+snoRNAs+in+PKR+activation+during+metabolic+stress.">Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).</li><li>Murtha-Riel, P., Davies, M. V., Choi, S. Y., Hershey, J. W., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+Phosphorylation-resistant+Eukaryotic+Initiation+Factor+2+a-Subunit+Mitigates+Heat+Shock+Inhibition+of+Protein+Synthesis.">Expression of a Phosphorylation-resistant Eukaryotic Initiation Factor 2 a-Subunit Mitigates Heat Shock Inhibition of Protein Synthesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268, 12946-12951 (1993).</li><li>Benkirane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+potential+of+TAR+RNA+binding+protein+TRBP+and+its+regulatory+interaction+with+RNA-dependent+protein+kinase+PKR.">Oncogenic potential of TAR RNA binding protein TRBP and its regulatory interaction with RNA-dependent protein kinase PKR.</a> The EMBO Journal. 16 (3), 611-624 (1997).</li><li>Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+transformation+by+a+mutant+of+the+IFN-inducible+dsRNA-dependent+protein+kinase.">Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase.</a> Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKR+is+activated+by+cellular+dsRNAs+during+mitosis+and+acts+as+a+mitotic+regulator.">PKR is activated by cellular dsRNAs during mitosis and acts as a mitotic regulator.</a> Genes &amp; Development. 28 (12), 1310-1322 (2014).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+human+tarbp2+reveals+cellular+microRNA+targets+and+cell-cycle+function+of+TRBP.">Deletion of human tarbp2 reveals cellular microRNA targets and cell-cycle function of TRBP.</a> Cell Reports. 9 (3), 1061-1074 (2014).</li><li>Zhu, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+PKR+promotes+network+excitability+and+enhanced+cognition+by+interferon-gamma-mediated+disinhibition.">Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition.</a> Cell. 147 (6), 1384-1396 (2011).</li><li>Dagon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase,+PKR,+down-regulates+CDC2/cyclin+B1+and+induces+apoptosis+in+non-transformed+but+not+in+v-mos+transformed+cells.">Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells.</a> Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).</li><li>Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAU1+binding+3'+UTR+IRAlus+complements+nuclear+retention+to+protect+cells+from+PKR-mediated+translational+shutdown.">STAU1 binding 3' UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown.</a> Genes &amp; Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).</li><li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28A+is+a+suppressor+of+ER-associated+translation+in+embryonic+stem+cells.">LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells.</a> Cell. 151 (4), 765-777 (2012).</li><li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing.">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li><li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+(eCLIP).">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKR+Senses+Nuclear+and+Mitochondrial+Signals+by+Interacting+with+Endogenous+Double-Stranded+RNAs.">PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs.</a> Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).</li><li>Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Mapping+of+DROSHA+Cleavage+Sites+on+Primary+MicroRNAs+and+Noncanonical+Substrates.">Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates.</a> Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).</li><li>Ricci, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staufen1+senses+overall+transcript+secondary+structure+to+regulate+translation.">Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).</li><li>Kim, B., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fCLIP-seq+for+transcriptomic+footprinting+of+dsRNA-binding+proteins:+Lessons+from+DROSHA.">fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA.</a> Methods. , (2018).</li><li>Dhir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+double-stranded+RNA+triggers+antiviral+signalling+in+humans.">Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans.</a> Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).</li></ol>

S 또는 M 단계 체포 샘플을 준비 하는 과정은 그림 1에 나와 있습니다. S 단계에서 셀을 체포, 우리 어디 우리가 두 번 높은 체포 효율 (그림 1A)를 보장 하기 위해 사이 9 h 출시와 함께 티 미 딘과 세포 치료 티 미 딘 더블 블록 메서드를 사용 합니다. M 단계 체포, 우리 한번 티 미 딘과 세포 치료 9 h 릴리스 및 nocodazole prometaphase (그림 1B</strong...

단백질 키 니 아 제 RNA 활성화 (PKR), 일컬어 진 핵 개시 요인 2 알파 니 2 (EIF2AK2), RNAs에 의해 제공 된 정보를 전송 하는 특징이 잘 단백질 키 니 아가입니다. 그것은 진 핵 번역 개시 2 소 단위 알파 (eIF2α)에 속하는 키 가족 고 떠들고 51 글로벌 번역1을 억제 하는 감염에 대 한 응답에서에서 eIF2α phosphorylates. 이러한 맥락에서 PKR PKR 이합체 화 및 autophosphorylation2에 대 한 플랫폼을 제공 하는 바이러스 성 더블-좌초 RNAs (dsRNAs)에 의해 활성화 됩니다. EIF2α, 외 PKR 수 phosphorylate 또한 p53, 인슐린 수용 체 기질 1, 억제 물 κB, 및 c 6 월 N 맨끝 키 니 아 제 (설립) 수많은 신호 변환 통로3,,45의 활동을 규제 하 6.
PKR 원래 소아마비의 dsRNAs7,8를 인식 하 여 소아마비 감염 시 eIF2α phosphorylated 키로 확인 되었다. PKR은 점점 면역 반응을 넘어 다각적인 역할을 발견 하 고 그것의 탈 선 활성화 또는 오작동 수많은 인간의 질병에서 함축 된다. 활성화/Phosphorylated PKR (pPKR) 자주 apoptosis 동안 관찰 하 고 퇴행 성 질환, 헌팅턴의 같은 특히 신경 퇴행 성 질환, 파 킨 슨 병의, 그리고 알 츠 하이 머 병9 환자의 일반적인 특성은 ,,1011,,1213. 또한, PKR 대사 스트레스와 열 충격14,15,,1617등 다양 한 스트레스 조건 하에서 활성화 됩니다. 다른 한편으로, PKR의 금지 증가 세포 증식에도 악성 변환18,19결과입니다. PKR 함수는 또한 정상적인 뇌 기능에 중요 한 이며 pPKR의 수준으로 세포 주기 동안 높은 M 단계20,,2122동안. 이러한 맥락에서 pPKR와 글로벌 번역을 억제 키 mitotic 신호 시스템에 적절 한 세포 분열20에 필요한 단서를 제공 합니다. 또한, PKR의 장기간된 활성화 G2/M 단계에 중국 햄스터 난소 세포 주기 검거 세포23에서 결과. 따라서, PKR 인 산화는 M/g 1 전환21동안 빠른 비활성화 되도록 부정적인 피드백 루프에 의해 통제 된다.
PKR의 넓은 범위 기능에도 불구 하 고 PKR 활성화에 대 한 우리의 이해를 캡처하고 dsRNAs PKR 활성화할 수 있는 식별 표준화 높은 처리량 실험적인 접근의 부족으로 인해 제한 됩니다. 이전 학문은 보여주었다 PKR dsRNAs 두 거꾸로 Alu 반복 (IRAlus)20,24, 그러나 세포 주기 동안 또는 PKR을 활성화할 수 있는 추가 셀룰러 dsRNAs의 존재의 가능성에 의해 형성 된와 상호 작용할 수 있습니다. 인간 세포에 스트레스 조건 탐험 되지 않았습니다. RNA-인터 RNA 의무적인 단백질 (RBP)의 식별에 기존의 접근 crosslink RNA RBP 단지25,,2627에 UV 빛을 사용 합니다. 최근 연구 마우스 시스템에 자외선 가교 이렇게 적용 하 고 확인 작은 nucleolar RNAs 대사 스트레스16동안 PKR 활성화를 조절할 수 있습니다. 활용 하 여 포름알데히드의 높은 가교 효율, 우리는 HeLa 세포28에서 세포 주기 동안 상호 작용 하는 PKR RNAs를 식별 하는 대체 방법 제시. 비슷한 접근 방식은 공부 스타 우 펜 및 Drosha29,,3031같은 다른 dsRBPs에 적용 되었습니다. 우리와 같은 짧은 산재 된 핵 성분 (사인), 긴 interspersed 핵 요소 (선), 내 인 성 레트로 바이러스 요소 (ERV), 그리고 심지어 알파 위성 RNAs PKR noncoding RNAs의 다양 한 종류 상호 작용 수 있습니다 발견. 또한, 우리는 PKR 미토 콘 드 리아 RNAs (mtRNAs), 어떤 양식을 intermolecular dsRNAs 무거운 물가 빛 사이의 상호 보완 작용을 통해 물가 RNAs28와 상호 작용할 수 있습니다 보였다. 최근 간행물은 더 일부 mtRNAs 이중 형태로 존재 하 고 흑색 종 분화 관련 단백질 5 interferons32유도 등 dsRNA 센서를 활성화할 수 있습니다 우리의 데이터 지원. 더 중요 한 것은, 식 및 mtRNAs의 subcellular 지 방화는 변조와 다양 한 스트레스에 의해 세포 주기 동안는 PKR 활성화28을 조절 하는 기능에 중요 한 있을 수 있습니다.
이 문서에서는 최근에 개발 된 포름알데히드 가교 및 immunoprecipitation (fCLIP)에 대 한 자세한 프로토콜 소개 캡처 및 세포 주기 동안 상호 작용 하는 PKR RNAs를 분석 하는 방법. 티 미 딘 및 nocodazole를 사용 하 여 세포 주기 검거 샘플을 준비 하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 다음 PKR 바인딩된 RNAs 및 방법 이러한 RNAs를 식별 하기 위해 높은 처리량 시퀀싱 라이브러리를 준비 하 분리 fCLIP 프로세스를 제시. 또한, 우리는 PKR 바인딩된 RNAs qRT-PCR를 사용 하 여 분석 하는 자세한 절차를 나타냅니다. 특히, 우리는 mtRNAs의 strandedness를 분석 하는 물가 관련 반전 녹음 방송 절차 제시. 설명된 프로토콜은 HeLa 세포 및 PKR, 최적화 하지만 셀룰러 dsRNAs 공부 하거나 다른 dsRBPs의 RNA 인터 식별 키 단계의 세포 주기 샘플, fCLIP, 및 물가 관련 qRT-PCR 분석 준비 쉽게 수정할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris, pH 7.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Nonidet-p40 (NP-40)</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BN015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Urea-acrylamide gel solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7 M (w/v) Urea and 0.5X TBE, stored protected from light at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X DNA loading buffer</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; adaptor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M Sodium Acetate pH 5.5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; adaptor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-phenol chloroform, pH 4.5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Magnetic beads DNA/RNA clean up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic alkaline phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DGCR8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PKR (D7F7)</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>12297S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PKR (Milli)</td>
			<td>Millipore EMD</td>
			<td>07-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE27-2056-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue sodium salt</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>B5525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf intestinal alkaline phosphatase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2250A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper 25 cm 2-position</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMV promoter sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM001-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mixture (2.5 mM)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute, ACS Grade</td>
			<td>Alfa-Aesar</td>
			<td>A9951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M-TMS-013-BKR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>GB0235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.18766.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext rRNA Depletion Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6318</td>
			<td>rRNA Depletion Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal rabbit IgG</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>2729S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR forward primer (RP1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR index reverse primer (RPI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes with flat cap, 0.2 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate bufered saline (PBS) Tablet</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T9181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td>High-fidelity polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>c2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polynucleotide kinase (PNK)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2021A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail set III</td>
			<td>Merck</td>
			<td>535140-1MLCN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO1 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-GCCATAACCCAATACCAAACG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO1 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO2 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO2 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO3 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO3 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CYTB Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CYTB Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: GAPDH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND1 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND1 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND4 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND4 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND5 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND5 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND6 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND6 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random hexamer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SO142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/&#956;L)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2270A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rnase inhibitor (40 U/&#956;L)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribo-Zero rRNA Removal Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MRZH116</td>
			<td>rRNA Removal Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>FINEPCR, ROTATOR AG</td>
			<td>D1.5-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO1 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO1 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO2 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO2 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO3 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO3 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CYTB Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CYTB Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: GAPDH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND1 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND1 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND4 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND4 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND5 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND5 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND6 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND6 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube</td>
			<td>Bio Plas</td>
			<td>4167SLS50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dedecyl sulfate</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>S1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase In Rnase inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080093</td>
			<td>Reverse transcriptase for library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18090010</td>
			<td>Reverse transcriptase for qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR gold nucleic acid gl stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 2, truncated KQ</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-borate-EDTA buffer (TBE)</td>
			<td>TaKara</td>
			<td>T9122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultralink Protein A sepharose beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22810</td>
			<td>Protein A beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>Bioruptor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>UB0148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>VM-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-32P-ATP (10 &#956;Ci/&#956;L, 3.3 &#956;M)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>BLU502A100UC</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying rna interactors of protein kinase rna-activated during the mammalian cell cycle

단백질 키 니 아 제 RNA 활성화 (PKR) 타고 난 면역 반응 단백질의 회원 이며, 바이러스 성 RNAs의 더블-좌초 이차 구조를 인식 합니다. 때 바이러스 이중 가닥 RNAs (dsRNAs)에 바인딩된, PKR는 이합체 화 및 후속 autophosphorylation를 겪 습. Phosphorylated PKR (pPKR) 활성화 되 고 진 핵 개시 요인 2 (eIF2α) 글로벌 번역 억제의 알파 소 단위의 인 산화를 유도 한다. PKR 세포 주기 동안과 같은 생리 적인 조건 하에서 또는 감염 없이 다양 한 스트레스 조건 하에서 활성화 될 수 있다 제안 증거를 증가. 그러나, PKR의 RNA 활성 제에 대 한 우리의 이해를 캡처하고 dsRNAs PKR 상호 작용 분석 표준화 된 실험 방법의 부족으로 인해 제한 됩니다. 여기, 우리는 실험 현재 구체적으로 풍부 하 고 PKR 분석 프로토콜 바인딩된 RNAs HeLa 세포를 사용 하 여 세포 주기 동안. 우리는 PKR RNA 복합물을 수정 하 고 immunoprecipitation를 통해 그들을 격리 포름알데히드의 효율적인 가교 활동을 활용 합니다. PKR 공동 immunoprecipitated RNAs 높은 처리량 시퀀싱 라이브러리를 생성 하기 위해 추가 처리 수 다음. 세포질 dsRNAs PKR 상호 작용의 1 개의 주요 클래스는 미토 콘 드 리아 RNAs (mtRNAs), 무거운 가닥 빛 가닥 RNAs는 보완 상호작용을 통해 intermolecular dsRNAs 존재할 수 있습니다. 공부 하 고 이러한 이중 mtRNAs의 strandedness, 또한 선물이 가닥 특정 qRT-PCR를 위한 프로토콜. PKR 바인딩된 RNAs의 분석을 위해 우리의 프로토콜 최적화 하지만 셀룰러 dsRNAs 또는 다른 dsRNA 바인딩 단백질의 RNA 인터 공부를 쉽게 수정할 수 있습니다.

HeLa 세포의 세포 주기 S 또는 M 단계에서 체포 하는 과정에 대 한 개략도 그림 1에 표시 됩니다. M 단계 체포 샘플, 우리 명확 하 게 둥근 모양의 세포 (그림 2A) 현미경을 시각화할 수 있습니다. 세포 주기 검거의 효율성 검토, FACS (그림 2B)를 사용 하 여 셀의 핵 콘텐츠를 분석 수 있습니다. 그림 3 은 D7F7 항 체 immunoprecipitate PKR?...

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Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

우리는 HeLa 세포를 사용 하 여 포유류 세포 주기 동안 이중 가닥 RNA 바인딩 단백질 키 니 아 제 RNA 활성화 (PKR)의 공부 RNA-인터에 대 한 실험적인 접근을 제시. 이 방법은 포름알데히드 crosslink RNA PKR 단지 및 PKR 바인딩된 RNAs를 풍부 하 게 하는 immunoprecipitation를 사용 합니다. 이러한 RNAs는 더 높은 처리량 시퀀싱 또는 qRT-PCR을 통해 분석할 수 있습니다.

공부 하는 단백질 키 니 아 제 RNA 포유류 세포 주기 동안 활성의 RNA 인터

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

이러한 프로토콜은 게놈 전체 방식으로 RNA 결합 단백질 PKR의 RNA 인터액터를 식별하는 방법을 제공한다. 그것은 우리가 RNA 결합 단백질에 의한 유전자 발현의 전사 후 조절을 더 잘 이해하는 데 도움이됩니다. 이 기술의 주요 장점은 포름알데히드의 효율적인 교차 연결을 활용하여 RNA 결합 단백질에 결합된 RNase를 고치고 면역 침전을 통해 이를 풍부하게 한다는 것입니다.활성화된 PKR는 파킨슨병과 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환 환자에서 관찰된다. PKR 상호 작용 이중 좌초 RNase를 확인하면 이러한 퇴행성 질환의 발병을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 이 방법은 RNA 결합 단백질의 RNA 인터액터를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.특히, 우리는 이 방법이 이중 좌초 RNase와 같은 구조화된 RNase를 인식하는 단백질을 연구하는 데 유용하다고 믿습니다. 세포를 수확하기 전에 주기 체포 된 샘플의 균질성을 확인하십시오. 또한, 사용 가능한 최상의 항체를 사용하여 면역 침전 효율을 최적화하는 것이 중요합니다.시작하려면, S-또는 M 상 체포 견본을 위한 750, 000 또는 백만 HeLa 세포를 각각 종자합니다. 세포는 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 증가합니다. 2 밀리머 티미딘으로 세포를 치료하고 18 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오.PBS로 셀을 두 번 씻으시면 됩니다. 그런 다음 신선한 미디어를 추가하고 9 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. S 상 체포 세포의 경우, 2 밀리머 리 미딘으로 세포를 치료하십시오.M-위상 체포 세포의 경우, 노코다졸의 밀리리터 당 100 나노그램으로 세포를 치료하십시오. 15시간 동안 섭씨 37도에서 배양하세요. S-phase 샘플의 경우 세포 스크레이퍼로 세포를 수집하고 15밀리리터 원문 튜브로 이송합니다.M-위상 샘플의 경우 세포 배양 접시의 측면을 탭하여 M 상 체포 세포를 분리하고 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮겨냅니다. 다음으로 실온에서 380g의 세포를 3분간 원심분리합니다. 상체를 제거하고 차가운 PBS의 1 밀리리터로 세포를 다시 중단합니다.세포를 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 이송합니다. 세포를 섭씨 4도에서 10, 000g에서 30초 동안 원심분리하고 수퍼나티를 완전히 제거합니다. 포름알데히드 교차 연결을 수행하기 위해 먼저 세포에 0.1 % 파라 포름 알데히드의 750 마이크로 리터를 추가하고 세포를 해결하기 위해 10 분 동안 실온에서 배양합니다.그런 다음, 1-어금니 글리신 250 마이크로리터를 추가하고 실온에서 10분 동안 배양하여 반응을 담금질합니다. 세포를 섭씨 4도에서 10, 000g에서 30초 동안 원심분리합니다. 수퍼네이너트는 완전히 제거합니다.다음으로, PBS의 1 밀리리터로 다시 일시 중단. 세포를 섭씨 4도에서 10, 000g에서 30초 동안 원심분리하고 상체를 제거합니다. 0.2 부피 % 프로테아제 억제제와 2 부피 퍼센트 RNase 억제제로 보충 fCLIP 용해 버퍼의 400 마이크로 리터로 다시 중단.10 분 동안 얼음에 배양하고 초음파 를 사용하여 초음파 처리합니다. 다음으로 염화나트륨 농도를 150밀리알로 조정하고, 소용돌이를 짧게 조절하기 위해 염화나트륨 5음류 11마이크로리터를 첨가한다. 그런 다음 15 분 동안 섭씨 4도에서 21, 130 g의 원심분리기.초나타제를 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮춥니다. 면역 침전을 수행하기 위해 먼저 단백질 A 비드 20 마이크로 리터를 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브에 추가하십시오. 그런 다음, 400 마이크로 리터의 fCLIP 리시스 버퍼로 구슬을 씻는다.1분 동안 섭씨 4도에서 1, 000g의 구슬을 원심분리합니다. 다음으로, 상체를 제거하고, 400 마이크로리터의 fCLIP 리시스 버퍼를 신중하게 추가하고, 3~4회 반전하여 구슬을 부드럽게 재보냅니다. 세면단계를 세 번 반복합니다.마지막 세척 후, 슈퍼 네이넌트는 완전히 제거합니다. 구슬을 fCLIP 리시스 버퍼300 마이크로리터로 재연합니다. 염화나트륨 농도를 150밀리알로 조정하기 위해 염화나트륨 5마리의 마이크로리터 8.3마이크로리터를 첨가합니다.단백질 키나아제 RNA 활성화 항체의 10 마이크로리터를 추가하고, 3시간 동안 섭씨 4도에서 회전자에 배양한다. 다음으로, 1분 동안 섭씨 4도에서 1, 000g의 구슬을 원심분리합니다. 상체를 제거하고, 400 마이크로리터의 fCLIP 세척 버퍼를 추가하고, 3~4회 반전하여 구슬을 부드럽게 재보페킹합니다.워시 스텝을 두 번 반복합니다. 마지막 세척 후, 슈퍼 네이넌트는 완전히 제거합니다. 다음으로 300마이크로리터의 용액을 추가하고 회전자에 섭씨 4도에서 3시간 동안 배양합니다.그런 다음 1 분간 섭씨 4도에서 1, 000g의 구슬을 원심분리합니다. 상체를 제거하고, 400 마이크로리터의 fCLIP 세척 버퍼를 추가하고, 3~4회 반전하여 구슬을 부드럽게 재보페킹합니다. 세면단계를 세 번 반복합니다.마지막 세척 후, 상체를 완전히 제거합니다. 다음으로 fCLIP 용출 버퍼 300 마이크로리터를 추가합니다. 25도의 ThermoMixer에서 3시간 동안 온도25도의 인큐베이션을 사용하여 구슬에서 활성을 사용하는 단백질 키나제 RNA를 엘ute합니다.상온에서 1, 000g의 원심분리기와 수퍼네이츠를 깨끗한 실리콘 튜브로 옮긴다. 마지막으로, 300 마이크로리터의 Proteinase K를 추가하고 섭씨 65도에서 하룻밤 동안 배양합니다. S 또는 M 상에서 HeLa 세포의 세포 주기 체포의 효율은 FACS를 사용하여 검토되었다.D7F7 항체는 면역 침전 단백질 키나아제 RNA 활성화에 우수한 능력을 보였다. PKR 면역 침전 또는 총 HeLa lysate의 서양 얼룩 분석은 PKR의 크기에 대응하는 단 하나의 강한 밴드를 보여주었으며, 이는 D7F7 항체가 PKR을 인식하는 데 매우 특이적임을 나타낸다. 다른 면역 강수 효율을 가진 다른 PKR 항체를 사용하여, 지도 시퀀싱 읽기의 상이한 클래스 분포귀착됩니다.PKR 공동 면역 침전RNase에 대한 방사성 동위원소 신호의 감소는 성공적인 rRNA 제거 시 관찰되었다. PKR 공동 면역 침전 RNA 샘플은 부정적인 대조군과 비교하여 미토콘드리아 RNase의 강한 농축을 보였다. 가닥 특이적 역전사는 S 또는 M상 체포 세포를 위해 PKR과 공동 면역침전된 중경량 가닥 미토콘드리아 RNase를 구별하기 위해 사용되었다.세포 주기 체포 견본을 준비하는 에서 가장 중요한 단계는 PBS로 세포를 두 번 세척해야 하고 균질성을 위해 세포 파스텔만 수집해야 하거나 샘플이 손상될 것입니다. 윤리적으로 공정을 위해 가장 중요한 단계는 포름알데히드 교차 연결 및 수량입니다. 이 절차 후 에로테드 된 RNA는 북부 블로팅, qRT PCR 또는 높은 처리량 시퀀싱을 사용하여 분석 될 수 있습니다.이러한 실험은 PKR에 바인딩된 RNase의 유형 및 상대적 양을 식별할 수 있습니다. 이 기술은 RNA 결합 단백질에 의해 중재된 유전자 발현의 포스트 전사 조절에 대한 우리의 이해를 향상시키는 RNA 결합 단백질의 RNA 인터액터를 연구하고 확인하기 위하여 적용될 수 있습니다. 포름알데히드는 위험하므로 고정, 용액 및 초기 세척 버퍼를 신중하게 처리해야합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

연구

생화학

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

방사성 표지 된 ATP로 단백질 키나아제 활성 측정

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

번역 개시 포유류 mRNAs에 복잡 한 대형의 Toeprinting 분석

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

형광 라이브 셀 이미징의 완전 한 식물 세포의 주기 느린 성장 사회 박테리아 Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Protoplasts를 사용 하 여 엽록체로 공부 단백질 가져오기

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Rab10 인산화를 평가하여 파킨슨병 관련 LRRK2 키나아제 경로를 심문하기 위한 인간 말초 혈액 호중구 격리

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

전사에서 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 생체층 간섭측정기(BLI) 적용

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

새로운 키나제 단백질의 강력한 생화학 적 접근법을 사용하여 분자 수준에서특성화

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

자체 조립된 인간 단백질 마이크로어레이에서 키나제 억제제 스크리닝

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...