Name: studying rna interactors of protein kinase rna-activated during the mammalian cell cycle
Uploaded: 2019-03-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle at JoVE.com

Detta arbete stöds av grundläggande vetenskap forskningsprogram genom den nationella Research Foundation i Korea (NRF) finansieras av den koreanska regeringen ministeriet för vetenskap och IKT (NRF-2016R1C1B2009886).

1. lösning och cell förberedelse
<ol><li>Lösning förberedelse<ol>
<li>För cellodlingsmedium, förbereda medium för HeLa cellodling genom att lägga till 50 mL fetalt bovint serum (FBS) till 500 mL av Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM). Obs: Antibiotika kan läggas till i cellodlingsmedium, men vi använder inte antibiotika.</li>
		<li>För den 0,1% paraformaldehyd, lös 4% (w/v) paraformaldehyd i 1 x Phosphate-Buffered saltlösning (PBS) med uppvärmning på en värmeplatta och späd att göra 30 mL 0...

<ol>
	<li>Meurs, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+expression+of+human+double-stranded+RNA-activated+p68+kinase+in+murine+cells+mediates+phosphorylation+of+eukaryotic+initiation+factor+2+and+partial+resistance+to+encephalomyocarditis+virus+growth.">Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth.</a> Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).</li><li>Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interferon-inducible+double-stranded+RNA-activated+protein+kinase+self-associates+in+vitro+and+in+vivo.">The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).</li><li>Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAX/PACT-PKR+stress+response+pathway+promotes+p53+sumoylation+and+activation,+leading+to+G(1)+arrest.">The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest.</a> Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).</li><li>Yang, X., Nath, A., Opperman, M. J., Chan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+differentially+regulates+insulin+receptor+substrates+1+and+2+in+HepG2+cells.">The double-stranded RNA-dependent protein kinase differentially regulates insulin receptor substrates 1 and 2 in HepG2 cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (19), 3449-3458 (2010).</li><li>Zamanian-Daryoush, M., Mogensen, T. H., DiDonato, J. A., Williams, B. R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappa+B+Activation+by+Double-Stranded-RNA-Activated+Protein+Kinase+(PKR)+Is+Mediated+through+NF-kappa+B-Inducing+Kinase+and+Ikappa+B+Kinase.">NF-kappa B Activation by Double-Stranded-RNA-Activated Protein Kinase (PKR) Is Mediated through NF-kappa B-Inducing Kinase and Ikappa B Kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1278-1290 (2000).</li><li>Takada, Y., Ichikawa, H., Pataer, A., Swisher, S., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+deletion+of+PKR+abrogates+TNF-induced+activation+of+IkappaBalpha+kinase.">Genetic deletion of PKR abrogates TNF-induced activation of IkappaBalpha kinase.</a> JNK, Akt and cell proliferation but potentiates p44/p42 MAPK and p38 MAPK activation. Oncogene. 26 (8), 1201-1212 (2007).</li><li>Dabo, S., Meurs, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dsRNA-dependent+protein+kinase+PKR+and+its+role+in+stress,+signaling+and+HCV+infection.">dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection.</a> Viruses. 4 (11), 2598-2635 (2012).</li><li>Black, T. L., Safer, B., Hovanessian, A., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+68,000-Mr+Protein-Kinase+Is+Highly+Autophosphorylated+and+Activated+yet+Significantly+Degraded+during+Poliovirus+Infection+-+Implications+for+Translational+Regulation.">The Cellular 68,000-Mr Protein-Kinase Is Highly Autophosphorylated and Activated yet Significantly Degraded during Poliovirus Infection - Implications for Translational Regulation.</a> Journal of Virology. 63 (5), 2244-2251 (1989).</li><li>Bando, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+RNA+dependent+protein+kinase+(PKR)+is+involved+in+the+extrastriatal+degeneration+in+Parkinson's+disease+and+Huntington's+disease.">Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson's disease and Huntington's disease.</a> Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).</li><li>Onuki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-dependent+protein+kinase+is+involved+in+tunicamycin-induced+apoptosis+and+Alzheimer's+disease.">An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease.</a> The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).</li><li>Peel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+cell+stress+kinase+PKR+in+Alzheimer's+disease+and+human+amyloid+precursor+protein+transgenic+mice.">Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer's disease and human amyloid precursor protein transgenic mice.</a> Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).</li><li>Peel, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase,+PKR,+binds+preferentially+to+Huntington's+disease+(HD)+transcripts+and+is+activated+in+HD+tissue.">Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington's disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue.</a> Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).</li><li>Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upstream+signaling+pathways+leading+to+the+activation+of+double-stranded+RNA-dependent+serine/threonine+protein+kinase+in+beta-amyloid+peptide+neurotoxicity.">Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity.</a> Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+PKR+complexes+with+TRBP+in+Immunometabolic+regulation+and+eIF2alpha+phosphorylation+in+obesity.">A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity.</a> Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).</li><li>Saito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+the+interferon-induced+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+activity+by+Sindbis+virus+infection+and+heat-shock+stress.">Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress.</a> Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).</li><li>Youssef, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+for+snoRNAs+in+PKR+activation+during+metabolic+stress.">Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).</li><li>Murtha-Riel, P., Davies, M. V., Choi, S. Y., Hershey, J. W., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+Phosphorylation-resistant+Eukaryotic+Initiation+Factor+2+a-Subunit+Mitigates+Heat+Shock+Inhibition+of+Protein+Synthesis.">Expression of a Phosphorylation-resistant Eukaryotic Initiation Factor 2 a-Subunit Mitigates Heat Shock Inhibition of Protein Synthesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268, 12946-12951 (1993).</li><li>Benkirane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+potential+of+TAR+RNA+binding+protein+TRBP+and+its+regulatory+interaction+with+RNA-dependent+protein+kinase+PKR.">Oncogenic potential of TAR RNA binding protein TRBP and its regulatory interaction with RNA-dependent protein kinase PKR.</a> The EMBO Journal. 16 (3), 611-624 (1997).</li><li>Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+transformation+by+a+mutant+of+the+IFN-inducible+dsRNA-dependent+protein+kinase.">Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase.</a> Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKR+is+activated+by+cellular+dsRNAs+during+mitosis+and+acts+as+a+mitotic+regulator.">PKR is activated by cellular dsRNAs during mitosis and acts as a mitotic regulator.</a> Genes &amp; Development. 28 (12), 1310-1322 (2014).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+human+tarbp2+reveals+cellular+microRNA+targets+and+cell-cycle+function+of+TRBP.">Deletion of human tarbp2 reveals cellular microRNA targets and cell-cycle function of TRBP.</a> Cell Reports. 9 (3), 1061-1074 (2014).</li><li>Zhu, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+PKR+promotes+network+excitability+and+enhanced+cognition+by+interferon-gamma-mediated+disinhibition.">Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition.</a> Cell. 147 (6), 1384-1396 (2011).</li><li>Dagon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase,+PKR,+down-regulates+CDC2/cyclin+B1+and+induces+apoptosis+in+non-transformed+but+not+in+v-mos+transformed+cells.">Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells.</a> Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).</li><li>Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAU1+binding+3'+UTR+IRAlus+complements+nuclear+retention+to+protect+cells+from+PKR-mediated+translational+shutdown.">STAU1 binding 3' UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown.</a> Genes &amp; Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).</li><li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28A+is+a+suppressor+of+ER-associated+translation+in+embryonic+stem+cells.">LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells.</a> Cell. 151 (4), 765-777 (2012).</li><li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing.">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li><li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+(eCLIP).">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKR+Senses+Nuclear+and+Mitochondrial+Signals+by+Interacting+with+Endogenous+Double-Stranded+RNAs.">PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs.</a> Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).</li><li>Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Mapping+of+DROSHA+Cleavage+Sites+on+Primary+MicroRNAs+and+Noncanonical+Substrates.">Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates.</a> Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).</li><li>Ricci, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staufen1+senses+overall+transcript+secondary+structure+to+regulate+translation.">Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).</li><li>Kim, B., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fCLIP-seq+for+transcriptomic+footprinting+of+dsRNA-binding+proteins:+Lessons+from+DROSHA.">fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA.</a> Methods. , (2018).</li><li>Dhir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+double-stranded+RNA+triggers+antiviral+signalling+in+humans.">Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans.</a> Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).</li></ol>

Processen att förbereda S eller M fas-greps prover illustreras i figur 1. För att arrestera celler på S fasen, använde vi en tymidinanalog dubbel block metod där vi behandlade celler med tymidin två gånger med en 9 h release emellan för att säkerställa hög gripandet effektivitet (figur 1A). För M fas gripande, vi behandlade celler en gång med tymidin följt av en 9 h release och sedan tillämpas nocodazole block celler på metafasen (<strong class="...

Proteinkinas RNA-aktiverat (PKR), även känd som eukaryota inledande faktor 2-alpha kinase 2 (EIF2AK2), är en välkarakteriserad proteinkinas som överför information från RNAs. Det hör hemma till den eukaryota översättning inledande 2 subenhet alpha (eIF2α) Kinas familj och phosphorylates eIF2α på Serin 51 svar på infektion att undertrycka globala översättning1. I detta sammanhang aktiveras PKR genom viral dubbelsträngat RNA (dsRNAs), som tillhandahåller en plattform för PKR dimerization och autophosphorylation2. Förutom eIF2α, kan PKR också fosforylera p53, insulin receptor substrate 1, hämmare κB och c-Jun N-terminal kinase (JNK) att reglera aktiviteten hos många signaltransduktion vägar3,4,5, 6.
PKR identifierades ursprungligen som en Kinas som fosforyleras eIF2α under poliovirus infektion genom att erkänna poliovirus' dsRNAs7,8. PKR är alltmer hittade för att spela mångfacetterade roller utöver immunsvar och dess avvikande aktivering eller funktionsfel är underförstått i talrika mänskliga sjukdomar. Aktiveras/Phosphorylated PKR (pPKR) observeras ofta under apoptos och är ett gemensamt kännetecken för patienter med degenerativa sjukdomar, särskilt neurodegenerativa sjukdomar som Huntingtons, Parkinsonss och Alzheimers sjukdom9 ,10,11,12,13. Dessutom aktiveras PKR villkor olika stress såsom metabol stress och värme chock14,15,16,17. Däremot, resulterar hämning av PKR i ökad cellproliferation och även elakartad omformning18,19. PKR funktion är också viktigt för normal hjärnfunktion och under cellcykeln som nivån på pPKR är förhöjd under M fas20,21,22. I detta sammanhang pPKR dämpar globala översättning och ger ledtrådar till viktiga mitotiska signalering system som krävs för korrekt celldelningen20. Dessutom resulterade långvarig aktivering av PKR i G2/M fas cellcykelarrest i Chinese hamster ovary cells23. PKR fosforylering regleras följaktligen den negativ feedback-slingan för att säkerställa snabb inaktivering under M/G1 övergången21.
Trots den breda utbud av PKR funktionen är vår förståelse av PKR aktiveringen begränsad på grund av avsaknaden av en standardiserad hög genomströmning experimentell metod att fånga och identifiera dsRNAs kan aktivera PKR. Tidigare studier har visat att PKR kan interagera med dsRNAs bildas av två inverterad Alu repetitioner (IRAlus)20,24, men möjligheten att förekomsten av ytterligare cellulära dsRNAs kan aktivera PKR under cellcykeln eller under stress villkor i mänskliga celler var outforskat. Den konventionella metoden att identifiera RNA-interactmedlemmar av en RNA-bindande protein (RBP) använder UV-ljus till crosslink RNA-RBP komplex25,26,27. En nyligen genomförd studie tillämpas detta UV crosslinking tillvägagångssätt i ett mus-system och identifierat att små nukleolära RNAs kan reglera PKR aktivering under metabol stress16. Genom att utnyttja hög crosslinking effektivitet av formaldehyd, presenterade vi en alternativ metod för att identifiera PKR-interagera RNAs under cellcykeln i HeLa celler28. En liknande metod har tillämpats för att studera andra dsRBPs såsom Staufen och Drosha29,30,31. Vi hittade att PKR kan interagera med olika typer av icke-kodande RNAs såsom kort interspersed nukleära element (sinus), lång interspersed nukleära element (linje), endogena retrovirus element (ERV) och även alpha-satellit RNAs. Dessutom visade vi att PKR kan interagera med mitokondriell RNAs (mtRNAs), vilken form intermolekylära dsRNAs genom kompletterande interaktion mellan de tunga-strand och ljuset strand RNAs28. En ny publikation stöds ytterligare våra data att vissa mtRNAs finns i en dubbelsidig form och kan aktivera dsRNA sensorer såsom melanom differentiering-associerade protein 5 att inducera interferoner32. Viktigare, moduleras uttryck och subcellulär lokalisering av mtRNAs under cellcykeln och av olika stressfaktorer, som kan vara viktiga i deras förmåga att reglera PKR aktiveringen28.
I denna artikel presenterar vi ett detaljerat protokoll för en nyligen utvecklad formaldehyd crosslinking och immunoprecipitation (fCLIP) metod för att fånga och analysera PKR-interagera RNAs under cellcykeln. Vi visar metoden för att förbereda cellcykeln gripandet prover med tymidin och nocodazole. Vi presenterar sedan fCLIP processen för att isolera PKR-bundna RNAs och en metod för att förbereda hög genomströmning sekvensering bibliotek för att identifiera dessa RNAs. Dessutom avgränsa vi detaljerade förfaranden för att analysera PKR-bundna RNAs med qRT-PCR. Specifikt, presenterar vi en strand-specifika omvänd transkription procedur för att analysera strandedness av mtRNAs. Protokollet beskrivs är optimerad för HeLa cells och PKR, men viktiga steg såsom utarbetandet av cellcykeln prov, fCLIP och strand-specifika qRT-PCR-analys kan enkelt modifieras att studera cellulära dsRNAs eller för att identifiera RNA interactmedlemmar av andra dsRBPs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris, pH 7.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Nonidet-p40 (NP-40)</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BN015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Urea-acrylamide gel solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7 M (w/v) Urea and 0.5X TBE, stored protected from light at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X DNA loading buffer</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; adaptor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M Sodium Acetate pH 5.5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; adaptor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-phenol chloroform, pH 4.5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Magnetic beads DNA/RNA clean up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic alkaline phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DGCR8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PKR (D7F7)</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>12297S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PKR (Milli)</td>
			<td>Millipore EMD</td>
			<td>07-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE27-2056-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue sodium salt</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>B5525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf intestinal alkaline phosphatase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2250A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper 25 cm 2-position</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMV promoter sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM001-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mixture (2.5 mM)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute, ACS Grade</td>
			<td>Alfa-Aesar</td>
			<td>A9951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M-TMS-013-BKR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>GB0235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.18766.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext rRNA Depletion Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6318</td>
			<td>rRNA Depletion Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal rabbit IgG</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>2729S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR forward primer (RP1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR index reverse primer (RPI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes with flat cap, 0.2 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate bufered saline (PBS) Tablet</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T9181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td>High-fidelity polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>c2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polynucleotide kinase (PNK)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2021A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail set III</td>
			<td>Merck</td>
			<td>535140-1MLCN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO1 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-GCCATAACCCAATACCAAACG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO1 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO2 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO2 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO3 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO3 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CYTB Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CYTB Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: GAPDH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND1 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND1 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND4 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND4 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND5 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND5 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND6 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND6 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random hexamer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SO142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/&#956;L)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2270A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rnase inhibitor (40 U/&#956;L)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribo-Zero rRNA Removal Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MRZH116</td>
			<td>rRNA Removal Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>FINEPCR, ROTATOR AG</td>
			<td>D1.5-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO1 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO1 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO2 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO2 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO3 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO3 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CYTB Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CYTB Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: GAPDH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND1 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND1 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND4 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND4 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND5 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND5 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND6 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND6 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube</td>
			<td>Bio Plas</td>
			<td>4167SLS50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dedecyl sulfate</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>S1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase In Rnase inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080093</td>
			<td>Reverse transcriptase for library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18090010</td>
			<td>Reverse transcriptase for qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR gold nucleic acid gl stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 2, truncated KQ</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-borate-EDTA buffer (TBE)</td>
			<td>TaKara</td>
			<td>T9122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultralink Protein A sepharose beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22810</td>
			<td>Protein A beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>Bioruptor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>UB0148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>VM-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-32P-ATP (10 &#956;Ci/&#956;L, 3.3 &#956;M)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>BLU502A100UC</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying rna interactors of protein kinase rna-activated during the mammalian cell cycle

Proteinkinas RNA-aktiverat (PKR) är medlem i de medfödda immunförsvaret proteinerna och erkänner det dubbelsträngat sekundära strukturerar av viral RNAs. PKR när bunden till viral dubbelsträngat RNA (dsRNAs), och genomgår dimerization och efterföljande autophosphorylation. Fosforyleras PKR (pPKR) blir aktiv och inducerar fosforylering av den alfa subuniten av eukaryota inledande faktor 2 (eIF2α) att undertrycka globala översättning. Ökande bevis föreslår att PKR kan aktiveras under fysiologiska betingelser såsom under cellcykeln eller olika stress villkor utan infektion. Vår förståelse av de RNA aktivatorer av PKR är dock begränsad på grund av en standardiserad experimentell metod att fånga och analysera PKR-interagera dsRNAs. Här presenterar vi en experimentell protokollet att specifikt berika och analysera PKR bundet RNAs under cellcykeln använder HeLa cells. Vi använder effektiv crosslinking aktiviteten av formaldehyd att fixa PKR-RNA komplex och isolera dem via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs kan sedan bearbetas vidare för att generera en hög genomströmning sekvensering bibliotek. En stor klass av PKR-interagera cellulär dsRNAs är mitokondriell RNAs (mtRNAs), som kan existera som intermolekylära dsRNAs genom kompletterande interaktion mellan de tunga-strand och ljus-strand RNASEN. För att studera strandedness av dessa duplex mtRNAs, presenterar vi också ett protokoll för strand-specifika qRT-PCR. Våra protokoll är optimerad för analys av PKR-bundna RNAs, men det kan enkelt modifieras för att studera cellulära dsRNAs eller RNA-interactmedlemmar av andra dsRNA bindande proteiner.

En schematisk att arrestera HeLa cells på S eller M fasen i cellcykeln processen visas i figur 1. För en M fas-greps prov, kan vi tydligt visualisera runda formade celler i Mikroskop (figur 2A). För att undersöka effektiviteten av cellcykelarrest, kan nukleära innehållet i cellen analyseras med hjälp FACS (figur 2B). Figur 3 visar representativa uppgifter för immunoprecipitation effektivitet test, där D7F7 antikr...

Watch this Scientific Journal Video about Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle at JoVE.com

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Vi presenterar experimentella metoder för att studera RNA-interactmedlemmar dubbelsträngat RNA-bindande protein Kinas RNA-aktiverat (PKR) under mammalian cell cykel använder HeLa cells. Denna metod använder tredjeparts formaldehyd crosslink RNA-PKR komplex och immunoprecipitation att berika PKR-bundna RNAs. Dessa RNAs kan analyseras vidare genom hög genomströmning sekvensering eller qRT-PCR.

Studera RNA interactmedlemmar av proteinkinas RNA-aktiverad under däggdjur cellcykeln

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Detta protokoll ger en metod för att identifiera RNA-interactorer av ett RNA-bindande protein PKR på ett genomomfattande sätt. Det hjälper oss att bättre förstå post-transkriptional reglering av genuttryck av RNA bindande protein. Den största fördelen med denna teknik är att den utnyttjar effektiv korsbindning av formaldehyd för att fixera RNase bundet till RNA-bindande proteiner och berika dem genom immunoprecipitation.Aktiverad PKR observeras hos patienter med neurodegenerativ sjukdom, såsom Parkinsons och Alzheimers sjukdom. Identifiera PKR-interagerande dubbelsträngade RNase kommer att hjälpa oss att bättre förstå patogenesen vid dessa degenerativa sjukdomar. Denna metod kan användas för att studera RNA-interactorer av alla RNA-bindande proteiner.I synnerhet anser vi att denna metod är användbar för att studera proteiner som känner igen den strukturerade RNase, såsom dubbelsträngad RNase. Kontrollera homogeniteten hos det cykelarresterade provet innan de skördar celler. Dessutom är det viktigt att optimera immunoprecipitationseffektiviteten med hjälp av den bästa antikroppen som finns.Till att börja med, utsäde 750, 000 eller en miljon HeLa celler för S-eller M-fas-arresterade prover, respektive. Odla celler i 37 grader Celsius och 5%koldioxid i 24 timmar. Behandla cellerna med två millimolär tymidin, och inkubera vid 37 grader Celsius i 18 timmar.Tvätta cellerna två gånger med PBS. Tillsätt sedan färska medier och inkubera vid 37 grader Celsius i nio timmar. För S-fas-arresterade celler, behandla celler med två-millimolär tymidin.För M-fas-arresterade celler, behandla celler med 100 nanogram per milliliter nokodazol. Inkubera vid 37 grader Celsius i 15 timmar. För ett S-fasprov samlar du in celler med en cellskrapa och överför till ett koniskt rör på 15 milliliter.För ett M-fasprov, tryck på sidan av cellodlingsskålen för att lossa M-fasarrestade celler och överföra dem till ett koniskt rör på 15 milliliter. Därefter centrifug cellerna vid 380 g vid rumstemperatur i tre minuter. Ta bort supernatanten och resuspend cellerna med en milliliter kall PBS.Överför celler till 1,5-milliliter mikrocentrifugrör. Centrifugera cellerna vid 10, 000 g vid fyra grader Celsius i 30 sekunder, och ta bort supernatanterna helt. För att utföra formaldehyd crosslinking, först lägga till 750 mikroliter av 0,1%paraformaldehyd till cellerna, och inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter för att fixa cellerna.Tillsätt sedan 250 mikroliter av en-molar glycin och inkubera i rumstemperatur i ytterligare 10 minuter för att släcka reaktionen. Centrifugera cellerna vid 10, 000 g vid fyra grader Celsius i 30 sekunder. Ta bort supernatanterna helt.Därefter återanvänds med en milliliter PBS. Centrifugera cellerna vid 10, 000 g vid fyra grader Celsius i 30 sekunder, och ta bort supernatanten. Resuspend med 400 mikroliter av fCLIP lysbuffert kompletterad med 0,2 volymprocent proteashämmare och två volymprocent RNase-hämmare.Inkubera på is i 10 minuter, och sonikera med hjälp av en ultraljudsbehandling. Tillsätt därefter 11 mikroliter av fem molar natriumklorid för att justera natriumkloridkoncentrationen till 150 millimolar och virvel kort. Sedan centrifug vid 21, 130 g vid fyra grader Celsius i 15 minuter.Överför supernatanterna till ett förkylt mikrocentrifugrör på 1,5 milliliter. För att utföra immunoprecipitation, tillsätt först 20 mikroliter protein A pärlor i en 1,5-milliliter microcentrifug röret. Sedan, tvätta pärlorna med 400 mikroliter av fCLIP lysbuffert.Centrifugera pärlorna vid 1, 000 g vid fyra grader Celsius i en minut. Därefter tar du bort supernatanten, lägger till 400 mikroliter av fCLIP-lysbuffert försiktigt och återanvänd försiktigt pärlorna genom att vända tre till fyra gånger. Upprepa tvättsteget tre gånger.Efter den slutliga tvätten, ta bort supernatanterna helt. Resuspend pärlorna i 300 microliters av fCLIP lys buffert. Tillsätt 8,3 mikroliter av fem-molar natriumklorid för att justera natriumkloridkoncentrationen till 150 millimolar.Tillsätt 10 mikroliter proteinkinas RNA-aktiverad antikropp, och inkubera på en rotator vid fyra grader Celsius i tre timmar. Därefter centrifug pärlorna på 1, 000 g vid fyra grader Celsius i en minut. Ta bort supernatanten, tillsätt 400 mikroliter av fCLIP tvättbuffert, och försiktigt återanvänd pärlorna genom att vända tre till fyra gånger.Upprepa tvättsteget två gånger. Efter den slutliga tvätten, ta bort supernatanterna helt. Därefter lägger du till 300 mikroliter av lysate, och inkubera vid fyra grader Celsius på en rotator i tre timmar.Sedan centrifug pärlorna på 1, 000 g vid fyra grader Celsius i en minut. Ta bort supernatanten, tillsätt 400 mikroliter av fCLIP tvättbuffert, och försiktigt återanvänd pärlorna genom att vända tre till fyra gånger. Upprepa tvättsteget tre gånger.Efter den slutliga tvätten, ta bort supernatanten helt. Därefter lägger du till 300 mikroliter av fCLIP elueringsbuffert. Inkubera i en ThermoMixer vid 25 grader Celsius i tre timmar för att elera proteinkinas RNA-aktiverad från pärlorna.Centrifugera vid 1, 000 g vid rumstemperatur, och överför supernatanterna till ett rent silikoniserat rör. Slutligen, tillsätt 300 mikroliter proteinas K och inkubera över natten vid 65 grader Celsius. Effektiviteten av cellcykelresteringen av HeLa-cellerna vid S- eller M-fasen undersöktes med HJÄLP AV FACS.D7F7 antikropp visade en överlägsen förmåga att immun fällning protein kinas RNA aktiveras. Western blot analys av PKR immuno fälls ut eller totalt HeLa lysate visade endast ett starkt band som motsvarar storleken på PKR, vilket tyder på att D7F7 antikroppen är mycket specifik i erkänna PKR. Med hjälp av olika PKR-antikroppar med olika immuno precipitationseffektivitet, resulterade i en annan klassfördelning av kartsekvenseringsläsningar.Minskning av radioisotop signal för PKR co-immunoprecipitated RNase observerades vid framgångsrika rRNA borttagning. PKR co-immunoprecipitated RNA prov, visade stark anrikning av mitokondriellt RNase jämfört med de negativa kontrollerna. Strand specifika omvänd transkription användes för att skilja den tunga och lätta strand mitokondriellt RNase som var co-immunoprecipitated med PKR för S eller M fas arresterade celler.Det mest kritiska steget i att förbereda cellcykel gripandet prov är där du måste tvätta cellerna två gånger med PBS och där du måste samla endast celler pastell för homogenitet eller skulle vara nedsatt prov. För etiskt process, de mest kritiska stegen är formaldehyd crosslinking och kvantitet. Efter detta förfarande de eluted RNAs kan analyseras med hjälp av norra blotting, qRT PCR eller hög genomströmning sekvensering.Dessa experiment kan identifiera typ och relativa mängden av RNase bunden till PKR. Denna teknik kan tillämpas för att studera och identifiera RNA-interactorer av RNA-bindande proteiner som kommer att öka vår förståelse av post transkriptional reglering av genuttryck, medierad av RNA-bindande proteiner. Formaldehyd är farligt så fixering, lösning och den inledande tvättbufferten måste hanteras med försiktighet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteinkomplex Affinity Capture från Cryomilled däggdjursceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analys av proteinkinasaktivitet med radiomärkt ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting analys av översättning inledande komplexa bildande på däggdjur mRNA

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescens Live-cell Imaging av komplett vegetativ cellcykeln av den långsamt växande sociala bakterien Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Studera Protein Import till kloroplaster som använder Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Human perifert blod Neutrophil Isolering för förhör av Parkinsons associerade LRRK2 Kinas väg genom att bedöma Rab10 Fosforylering

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Tillämpning av Biolayer interferometri (BLI) för att studera protein-proteininteraktioner vid transkription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering på molekylär nivå med hjälp av robusta biokemiska metoder för ett nytt Kinas protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinashämmare screening i självmonterade humana Proteinmikromatriser

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...