Name: studying rna interactors of protein kinase rna-activated during the mammalian cell cycle
Uploaded: 2019-03-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle at JoVE.com

Bu eser temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Kore hükümeti Bilim Bakanlığı ve ICT (NMK-2016R1C1B2009886) tarafından desteklenen NMK) tarafından desteklenmiştir.

1. çözüm ve hücre hazırlık
<ol><li>Çözüm hazırlık<ol>
<li>Hücre kültür ortamı için orta HeLa hücre kültürü için 50 mL fetal sığır serum (FBS) ekleyerek 500 mL Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) için hazır olun. Not: Antibiyotik hücre kültür ortamına eklenebilir, ancak biz antibiyotik kullanmayın.</li>
		<li>%0,1 paraformaldehyde için 1 %4 (w/v) paraformaldehyde erimesi x Phosphate-Buffered serum fizyolojik (%0,1 (v/v) paraformaldehyde 30 mL 1 x PBS ekleyerek yapmak için PBS) I...

<ol>
	<li>Meurs, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+expression+of+human+double-stranded+RNA-activated+p68+kinase+in+murine+cells+mediates+phosphorylation+of+eukaryotic+initiation+factor+2+and+partial+resistance+to+encephalomyocarditis+virus+growth.">Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth.</a> Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).</li><li>Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interferon-inducible+double-stranded+RNA-activated+protein+kinase+self-associates+in+vitro+and+in+vivo.">The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).</li><li>Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAX/PACT-PKR+stress+response+pathway+promotes+p53+sumoylation+and+activation,+leading+to+G(1)+arrest.">The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest.</a> Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).</li><li>Yang, X., Nath, A., Opperman, M. J., Chan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+differentially+regulates+insulin+receptor+substrates+1+and+2+in+HepG2+cells.">The double-stranded RNA-dependent protein kinase differentially regulates insulin receptor substrates 1 and 2 in HepG2 cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (19), 3449-3458 (2010).</li><li>Zamanian-Daryoush, M., Mogensen, T. H., DiDonato, J. A., Williams, B. R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappa+B+Activation+by+Double-Stranded-RNA-Activated+Protein+Kinase+(PKR)+Is+Mediated+through+NF-kappa+B-Inducing+Kinase+and+Ikappa+B+Kinase.">NF-kappa B Activation by Double-Stranded-RNA-Activated Protein Kinase (PKR) Is Mediated through NF-kappa B-Inducing Kinase and Ikappa B Kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1278-1290 (2000).</li><li>Takada, Y., Ichikawa, H., Pataer, A., Swisher, S., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+deletion+of+PKR+abrogates+TNF-induced+activation+of+IkappaBalpha+kinase.">Genetic deletion of PKR abrogates TNF-induced activation of IkappaBalpha kinase.</a> JNK, Akt and cell proliferation but potentiates p44/p42 MAPK and p38 MAPK activation. Oncogene. 26 (8), 1201-1212 (2007).</li><li>Dabo, S., Meurs, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dsRNA-dependent+protein+kinase+PKR+and+its+role+in+stress,+signaling+and+HCV+infection.">dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection.</a> Viruses. 4 (11), 2598-2635 (2012).</li><li>Black, T. L., Safer, B., Hovanessian, A., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+68,000-Mr+Protein-Kinase+Is+Highly+Autophosphorylated+and+Activated+yet+Significantly+Degraded+during+Poliovirus+Infection+-+Implications+for+Translational+Regulation.">The Cellular 68,000-Mr Protein-Kinase Is Highly Autophosphorylated and Activated yet Significantly Degraded during Poliovirus Infection - Implications for Translational Regulation.</a> Journal of Virology. 63 (5), 2244-2251 (1989).</li><li>Bando, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+RNA+dependent+protein+kinase+(PKR)+is+involved+in+the+extrastriatal+degeneration+in+Parkinson's+disease+and+Huntington's+disease.">Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson's disease and Huntington's disease.</a> Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).</li><li>Onuki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA-dependent+protein+kinase+is+involved+in+tunicamycin-induced+apoptosis+and+Alzheimer's+disease.">An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease.</a> The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).</li><li>Peel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+cell+stress+kinase+PKR+in+Alzheimer's+disease+and+human+amyloid+precursor+protein+transgenic+mice.">Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer's disease and human amyloid precursor protein transgenic mice.</a> Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).</li><li>Peel, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase,+PKR,+binds+preferentially+to+Huntington's+disease+(HD)+transcripts+and+is+activated+in+HD+tissue.">Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington's disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue.</a> Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).</li><li>Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upstream+signaling+pathways+leading+to+the+activation+of+double-stranded+RNA-dependent+serine/threonine+protein+kinase+in+beta-amyloid+peptide+neurotoxicity.">Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity.</a> Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+PKR+complexes+with+TRBP+in+Immunometabolic+regulation+and+eIF2alpha+phosphorylation+in+obesity.">A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity.</a> Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).</li><li>Saito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+the+interferon-induced+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+activity+by+Sindbis+virus+infection+and+heat-shock+stress.">Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress.</a> Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).</li><li>Youssef, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+for+snoRNAs+in+PKR+activation+during+metabolic+stress.">Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).</li><li>Murtha-Riel, P., Davies, M. V., Choi, S. Y., Hershey, J. W., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+Phosphorylation-resistant+Eukaryotic+Initiation+Factor+2+a-Subunit+Mitigates+Heat+Shock+Inhibition+of+Protein+Synthesis.">Expression of a Phosphorylation-resistant Eukaryotic Initiation Factor 2 a-Subunit Mitigates Heat Shock Inhibition of Protein Synthesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268, 12946-12951 (1993).</li><li>Benkirane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+potential+of+TAR+RNA+binding+protein+TRBP+and+its+regulatory+interaction+with+RNA-dependent+protein+kinase+PKR.">Oncogenic potential of TAR RNA binding protein TRBP and its regulatory interaction with RNA-dependent protein kinase PKR.</a> The EMBO Journal. 16 (3), 611-624 (1997).</li><li>Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+transformation+by+a+mutant+of+the+IFN-inducible+dsRNA-dependent+protein+kinase.">Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase.</a> Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKR+is+activated+by+cellular+dsRNAs+during+mitosis+and+acts+as+a+mitotic+regulator.">PKR is activated by cellular dsRNAs during mitosis and acts as a mitotic regulator.</a> Genes &amp; Development. 28 (12), 1310-1322 (2014).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+human+tarbp2+reveals+cellular+microRNA+targets+and+cell-cycle+function+of+TRBP.">Deletion of human tarbp2 reveals cellular microRNA targets and cell-cycle function of TRBP.</a> Cell Reports. 9 (3), 1061-1074 (2014).</li><li>Zhu, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+PKR+promotes+network+excitability+and+enhanced+cognition+by+interferon-gamma-mediated+disinhibition.">Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition.</a> Cell. 147 (6), 1384-1396 (2011).</li><li>Dagon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase,+PKR,+down-regulates+CDC2/cyclin+B1+and+induces+apoptosis+in+non-transformed+but+not+in+v-mos+transformed+cells.">Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells.</a> Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).</li><li>Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAU1+binding+3'+UTR+IRAlus+complements+nuclear+retention+to+protect+cells+from+PKR-mediated+translational+shutdown.">STAU1 binding 3' UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown.</a> Genes &amp; Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).</li><li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIN28A+is+a+suppressor+of+ER-associated+translation+in+embryonic+stem+cells.">LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells.</a> Cell. 151 (4), 765-777 (2012).</li><li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing.">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li><li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+(eCLIP).">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKR+Senses+Nuclear+and+Mitochondrial+Signals+by+Interacting+with+Endogenous+Double-Stranded+RNAs.">PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs.</a> Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).</li><li>Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Mapping+of+DROSHA+Cleavage+Sites+on+Primary+MicroRNAs+and+Noncanonical+Substrates.">Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates.</a> Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).</li><li>Ricci, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staufen1+senses+overall+transcript+secondary+structure+to+regulate+translation.">Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).</li><li>Kim, B., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fCLIP-seq+for+transcriptomic+footprinting+of+dsRNA-binding+proteins:+Lessons+from+DROSHA.">fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA.</a> Methods. , (2018).</li><li>Dhir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+double-stranded+RNA+triggers+antiviral+signalling+in+humans.">Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans.</a> Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).</li></ol>

S veya M faz tutuklandı örnekleri hazırlamak için işlem şekil 1' de gösterilmiştir. S aşamada hücreleri tutuklamaya biz nereye biz timidin sürümüyle arasında yüksek tutuklama verimliliği (şekil 1A) sağlamak için iki kez bir 9 h hücrelerle tedavi timidin çift blok yöntemi kullanılır. M faz durması için biz timidin bir kez hücrelerle tedavi 9 h yayın tarafından takip ve nocodazole prometafaz (şekil 1B) bl...

Protein kinaz (PKR) RNA-harekete geçirmek, olarak da bilinen ökaryotik başlama faktör 2-Alfa kinaz 2 (EIF2AK2), RNA'ların tarafından sağlanan bilgi ileten bir iyi karakterize protein kinaz var. Ökaryotik çeviri başlatma 2 alt birim alfa (eIF2α) ait kinaz aile ve serin 51 yanıt olarak küresel çeviri1bastırmak için enfeksiyon, eIF2α phosphorylates. Bu bağlamda, PKR PKR dimerization ve autophosphorylation2için bir platform sağlamak viral çift iplikçikli RNA (dsRNAs), tarafından etkinleştirilir. EIF2α ek olarak, PKR da p53, insülin reseptör substrat 1, inhibitörü κB ve c-Jun N-terminal kinaz (JNK) çok sayıda sinyal iletim yollarının3,4,5, etkinliği düzenleyen fazdan 6.
PKR aslında poliovirus'dsRNAs7,8tanıyarak poliovirus enfeksiyon sırasında eIF2α fosforile kinaz olarak tespit edilmiştir. PKR giderek bağışıklık yanıtı ötesinde çok yönlü rolleri oynamak için bulunur ve onun anormal harekete geçirmek ya da arıza çok sayıda insan hastalıklarda ima etti. Aktif/Phosphorylated PKR (pPKR) apoptosis sırasında sık sık gözlenen ve dejeneratif hastalıklar, özellikle gibi Huntington nörodejeneratif hastalıklar, Parkinson'ın ve Alzheimer hastalığı9 hastalarda genel özelliği olduğunu ,10,11,12,13. Buna ek olarak, PKR metabolik stres ve ısı şok14,15,16,17gibi çeşitli stres koşullarında etkinleştirilir. Öte yandan, PKR inhibisyonu artan hücre çoğalması ve hatta Malign transformasyon18,19ile sonuçlanır. PKR işlevi de normal beyin işlevinde önemli ve pPKR düzeyi olarak hücre döngüsü sırasında sırasında M faz20,21,22yükseltilmiş. Bu bağlamda pPKR küresel çeviri bastırır ve uygun hücre bölünmesi20için gerekli olan anahtar Mitotik sinyal sistemleri için ipuçları sağlar. Ayrıca, uzun süreli PKR aktivasyonu hücre döngüsü tutuklama Çin hamster yumurtalık içinde23hücreleri G2/M aşamasında sonuçlandı. Sonuç olarak, PKR fosforilasyon sırasında M/G1 geçiş21hızlı devre dışı bırakma sağlamak için negatif geribesleme tarafından düzenlenmiştir.
PKR geniş aralığı işlevi rağmen PKR harekete geçirmek anlayışımızı yakalamak ve PKR etkinleştirebilirsiniz dsRNAs tanımlamak için standart yüksek üretilen iş deneysel yaklaşım eksikliği nedeniyle sınırlıdır. PKR iki ters Alu yineler (IRAlus)20,24, ama PKR hücre döngüsü sırasında veya altında etkinleştirebilirsiniz ek hücresel dsRNAs varlığı olasılığını tarafından kurulan dsRNAs ile etkileşim kurabilir önceki çalışmalar göstermiştir insan hücreleri stres koşullarında keşfedilmemiş. RNA-interactors bir RNA bağlayıcı protein (RBP) belirlenmesinde geleneksel yaklaşım UV ışık crosslink RNA-RBP kompleksleri25,26,27için kullanılır. Yeni yapılan bir çalışmada bu UV crosslinking yaklaşım bir fare sisteminde uygulanan ve küçük genelde RNA'ların PKR etkinleştirme sırasında metabolik stres16düzenleyen teşhis etti. Formaldehit verimliliğini yüksek crosslinking kullanarak, biz PKR etkileşim RNA'ların HeLa hücreleri28Hücre döngüsünde sırasında tanımlamak için alternatif bir yöntem sundu. Benzer bir yaklaşım Staufen ve Drosha29,30,31gibi diğer dsRBPs çalışma uygulandı. Bulduğumuz gibi kısa serpiştirilmiş nükleer öğesi (sinüs), uzun Nükleer öğesi (satır), endojen retrovirüsü öğesi (modül) ve hatta Alfa-uydu RNA'ların serpiştirilmiş PKR kodlamayan RNA'ların türleri ile etkileşim kurabilir. Buna ek olarak, biz PKR ağır iplikçik ve ışık arasında tamamlayıcı etkileşimi aracılığıyla hangi formu cins dsRNAs RNA'ların28strand mitokondrial RNA'lar ile (mtRNAs), etkileşim içinde olduğunu gösterdi. Son yayın daha fazla desteklenen bizim veri bazı mtRNAs bir çift yönlü formunda yer alan ve dsRNA sensörleri interferonlar32ikna etmek için Melanom farklılaşma ilişkili protein 5 gibi etkinleştirebilirsiniz. Daha da önemlisi, ifade ve mtRNAs hücre altı yerelleştirme hücre döngüsü sırasında ve tarafından çeşitli stresler, PKR harekete geçirmek28düzenleyen yeteneğini önemli olabilecek modülasyonlu.
Bu makalede, biz son zamanlarda geliştirilen formaldehit crosslinking ve immunoprecipitation (fCLIP) için detaylı bir protokolü mevcut yakalamak ve RNA'ların PKR etkileşim hücre döngüsü sırasında analiz yöntemi. Hücre döngüsü tutuklama örnekleri timidin ve nocodazole kullanarak hazırlamak için yöntemi göstermektedir. Biz o zaman fCLIP işleminin PKR bağımlı RNA'ların ve bu RNA'ları tanımlamak için bir yöntem yüksek üretilen iş sıralama kitaplığı hazırlamak için izole etmek için mevcut. Ayrıca, biz PKR bağımlı RNA'ların qRT-PCR kullanarak analiz ile ilgili ayrıntılı yordamlar betimlemek. Özellikle, biz mtRNAs strandedness analiz etmek için bir iplikçik özgü ters transkripsiyon yordam mevcut. Açıklanan protokol HeLa hücreleri ve PKR için optimize edilmiştir, ancak hücre döngüsü örnek, fCLIP ve strand özgü qRT-PCR analizleri hazırlanması gibi önemli adımlar kolayca hücresel dsRNAs çalışmaya ya da diğer dsRBPs, RNA interactors belirlemek için değiştirilebilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris, pH 7.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9855G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Nonidet-p40 (NP-40)</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BN015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Urea-acrylamide gel solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7 M (w/v) Urea and 0.5X TBE, stored protected from light at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X DNA loading buffer</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39; adaptor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 M Sodium Acetate pH 5.5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#39; adaptor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-phenol chloroform, pH 4.5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>Magnetic beads DNA/RNA clean up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antarctic alkaline phosphatase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DGCR8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PKR (D7F7)</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>12297S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PKR (Milli)</td>
			<td>Millipore EMD</td>
			<td>07-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE27-2056-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue sodium salt</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>B5525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf intestinal alkaline phosphatase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2250A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper 25 cm 2-position</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMV promoter sequence</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
			<td>Welgene</td>
			<td>LM001-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mixture (2.5 mM)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Absolute, ACS Grade</td>
			<td>Alfa-Aesar</td>
			<td>A9951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M-TMS-013-BKR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>GB0235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.18766.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext rRNA Depletion Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6318</td>
			<td>rRNA Depletion Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal rabbit IgG</td>
			<td>Cell signaling technology</td>
			<td>2729S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR forward primer (RP1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR index reverse primer (RPI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes with flat cap, 0.2 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate bufered saline (PBS) Tablet</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T9181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high-fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td>High-fidelity polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>c2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polynucleotide kinase (PNK)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2021A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail set III</td>
			<td>Merck</td>
			<td>535140-1MLCN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO1 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-GCCATAACCCAATACCAAACG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO1 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO2 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO2 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO3 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CO3 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CYTB Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: CYTB Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: GAPDH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND1 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND1 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND4 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND4 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND5 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND5 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND6 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR primer sequence: ND6 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Forward/Reverse: 5&#8242;-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3&#8242;/5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random hexamer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SO142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/&#956;L)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2270A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rnase inhibitor (40 U/&#956;L)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribo-Zero rRNA Removal Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MRZH116</td>
			<td>rRNA Removal Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>FINEPCR, ROTATOR AG</td>
			<td>D1.5-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO1 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO1 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO2 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO2 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO3 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CO3 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CYTB Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: CYTB Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: GAPDH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND1 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND1 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND4 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND4 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND5 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND5 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND6 Heavy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT primer sequence: ND6 Light</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8242;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3&#8242;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube</td>
			<td>Bio Plas</td>
			<td>4167SLS50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dedecyl sulfate</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>S1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERase In Rnase inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080093</td>
			<td>Reverse transcriptase for library preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV reverse transcriptase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18090010</td>
			<td>Reverse transcriptase for qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR gold nucleic acid gl stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA ligase 2, truncated KQ</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-borate-EDTA buffer (TBE)</td>
			<td>TaKara</td>
			<td>T9122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultralink Protein A sepharose beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22810</td>
			<td>Protein A beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>Bioruptor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>UB0148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>DAIHAN Scientific</td>
			<td>VM-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-32P-ATP (10 &#956;Ci/&#956;L, 3.3 &#956;M)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>BLU502A100UC</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying rna interactors of protein kinase rna-activated during the mammalian cell cycle

Protein kinaz (PKR) RNA-harekete geçirmek doğuştan gelen bağışıklık yanıtı proteinler üyesidir ve viral RNA'ların çift iplikçikli ikincil yapısını tanır. Viral çift iplikçikli RNA (dsRNAs) bağlandığında, PKR dimerization ve sonraki autophosphorylation uğrar. Fosforile PKR (pPKR) aktif hale gelir ve fosforilasyon bir alfa alt birimi ökaryotik başlama Factor global çeviri bastırmak için 2 (eIF2α) neden olmaktadır. Kanıt artan PKR hücre döngüsü sırasında gibi fizyolojik koşullar altında veya enfeksiyonu olmadan çeşitli stres koşullarında etkinleştirilebilir öneriyor. Ancak, PKR RNA aktivatörler anlayışımızı yakalamak ve PKR etkileşim dsRNAs analiz için standart bir deneysel yöntem eksikliği nedeniyle sınırlıdır. Burada, bir deneysel mevcut özellikle zenginleştirmek ve PKR çözümlemek için iletişim kuralı bağlı RNA'ların HeLa hücreleri kullanarak hücre döngüsü sırasında. Biz verimli crosslinking etkinlik formaldehit PKR-RNA kompleksleri düzeltmek ve onları immunoprecipitation yolu ile izole etmek için kullanmaktadır. PKR co-immunoprecipitated RNA'ların daha da yüksek üretilen iş sıralama kitaplığı oluşturmak için işlenebilir. Bir büyük PKR etkileşim hücresel dsRNAs (mtRNAs), hangi cins dsRNAs ağır iplikçik ve ışık iplikçikli RNA'ların arasında tamamlayıcı etkileşimi aracılığıyla olarak bulunabilir mitokondrial RNA'lar sınıfıdır. Bu çift yönlü mtRNAs strandedness çalışmaya da strand özgü qRT-PCR için bir iletişim kuralı mevcut. Bizim iletişim kuralı PKR bağımlı RNA'ların analizi için optimize edilmiştir, ama hücresel dsRNAs veya RNA-interactors diğer dsRNA bağlayıcı proteinlerin eğitimi için kolayca değiştirilebilir.

Hücre döngüsü S veya M aşamasında HeLa hücreleri tutuklamaya işleminin şematik Resim 1' de gösterilen. M faz tutuklandı bir örnek, açıkça (şekil 2A) mikroskop altında yuvarlak şekilli hücreler görselleştirebilirsiniz. Hücre döngüsü tutuklama verimliliğini incelemeye, nükleer hücre içeriğini FACS (şekil 2B) kullanılarak analiz edilebilir. Şekil 3 D7F7 antikor immunoprecipitate PKR üstün y...

Watch this Scientific Journal Video about Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle at JoVE.com

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Memeli hücre HeLa hücreleri kullanarak döngüsü sırasında eğitim RNA-interactors için çift iplikçikli RNA bağlayıcı protein kinaz (PKR) RNA-harekete geçirmek ve deneysel yaklaşımlar mevcut. Formaldehit crosslink RNA-PKR kompleksleri ve immunoprecipitation PKR bağımlı RNA'ların zenginleştirmek için bu yöntemi kullanır. Bu RNA'ların daha da yüksek üretilen iş sıralama veya qRT-PCR ile çözümlenebilir.

RNA Interactors Protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında RNA-harekete geçirmek, eğitim

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Bu protokol, rna bağlayıcı protein PKR'nin RNA interaktörlerini genom çapında bir şekilde tanımlamak için bir yöntem sağlar. RNA bağlayıcı protein tarafından gen ekspresyonunun transkripsiyon sonrası düzenlenmesini daha iyi anlamamıza yardımcı olur. Bu tekniğin en büyük avantajı, RNA bağlayıcı proteinlere bağlı RNase'yi onarmak ve immünopresipitasyon yoluyla zenginleştirmek için formaldehitin verimli çapraz bağlanmasını kullanmastır.Parkinson ve Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalığı olan hastalarda aktive PKR gözlenir. PKR-etkileşen çift iplikçikli RNase'nin tanımlanması bu dejeneratif hastalıkların patogenezini daha iyi anlamamıza yardımcı olacaktır. Bu yöntem, herhangi bir RNA bağlayıcı proteinlerin RNA interactors çalışma için kullanılabilir.Özellikle, bu yöntemin yapılandırılmış RNase tanıyan proteinleri incelemek için yararlı olduğuna inanıyoruz, örneğin çift iplikli RNase gibi. Hücreleri toplamadan önce döngüden tutuklanan numunenin homojenliğini kontrol edin. Buna ek olarak, mevcut en iyi antikor kullanarak immünopresid verimliliğini optimize etmek için önemlidir.Başlangıç olarak, sırasıyla S-veya M fazı tutuklanan numuneler için 750, 000 veya bir milyon HeLa hücresi tohum. Hücreleri 37 derecede ve %5 karbondioksitle 24 saat boyunca büyütün. Hücreleri iki milimolar timidin ile tedavi edin ve 18 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Sonra, taze medya ekleyin ve dokuz saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçka. S-faz-arrested hücreleri için, iki milimolar timinin ile hücreleri tedavi.M-faz-arrested hücreleri için, nocodazol mililitre başına 100 nanogram ile hücreleri tedavi. 15 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Bir S-faz örneği için, bir hücre kazıyıcı ile hücreleri toplamak ve 15 mililitrelik konik tüp içine aktarın.M fazlı bir örnek için, M fazı tutuklanan hücreleri ayırmak ve bunları 15 mililitrelik konik tüpe aktarmak için hücre kültür çanağının yan tarafına dokunun. Daha sonra, üç dakika oda sıcaklığında 380 g hücreleri santrifüj. Supernatant çıkarın ve soğuk PBS bir mililitre ile hücreleri yeniden askıya.Hücreleri 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri 10, 000 g'da 4 santigrat derecede 30 saniye santrifüj edin ve süpernatantları tamamen çıkarın. Formaldehit crosslinking gerçekleştirmek için, ilk hücrelere% 0.1 paraformaldehit 750 mikrolitre ekleyin ve hücreleri düzeltmek için 10 dakika oda sıcaklığında kuluçka.Daha sonra, tek azılı glisin 250 mikrolitre ekleyin ve reaksiyonu bastırmak için ek bir 10 dakika oda sıcaklığında kuluçka. Hücreleri 10,000 g'da 4 derece santigrat derecede 30 saniye santrifüj edin. Supernatants'ı tamamen çıkarın.Sonra, bir mililitre PBS ile askıya alın. Hücreleri 10,000 g'de 4 santigrat derecede 30 saniye santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. FCLIP lysis tampon 400 mikrolitre ile resuspend 0.2 hacimli proteaz inhibitörü ve iki hacimli RNase inhibitörü ile desteklenir.10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka ve ultrasonicator kullanarak sonicate. Daha sonra, sodyum klorür konsantrasyonu ayarlamak için beş molar sodyum klorür 11 mikrolitre ekleyin 150 milimolar, ve girdap kısaca. Sonra, santrifüj 21, 130 g dört derece santigrat 15 dakika.Supernatants önceden soğutulmuş 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp aktarın. İmmünopits gerçekleştirmek için, ilk 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp içine protein A boncuk 20 mikrolitre ekleyin. Daha sonra boncukları 400 mikrolitre fCLIP lysis tamponu ile yıkayın.Boncukları 1,000 g'de 4 santigrat derecede bir dakika santrifüj edin. Daha sonra, supernatant çıkarın, fCLIP lysis tampon 400 mikrolitre ekleyin ve yavaşça üç ila dört kez ters çevirerek boncuk ları yeniden askıya. Yıkama adımını üç kez tekrarlayın.Son yıkamadan sonra, supernatants tamamen çıkarın. FCLIP lysis tampon 300 mikrolitre boncuk resuspend. Sodyum klorür konsantrasyonu 150 milimolar ayarlamak için beş molar sodyum klorür 8.3 mikrolitre ekleyin.Protein kinaz RNA-aktive antikor 10 mikrolitre ekleyin ve üç saat boyunca dört derece santigrat bir rotator üzerinde kuluçka. Sonra, boncukları 1,000 g'de 4 santigrat derecede bir dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın, fCLIP yıkama tampon 400 mikrolitre ekleyin ve yavaşça üç ila dört kez ters çevirerek boncuk ları yeniden askıya.Yıkama adımını iki kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, supernatants tamamen çıkarın. Daha sonra, 300 mikrolitre lysate ekleyin ve üç saat boyunca bir rotator üzerinde dört santigrat derecede kuluçka.Sonra, boncukları 1,000 g'de 4 santigrat derecede bir dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın, fCLIP yıkama tampon 400 mikrolitre ekleyin ve yavaşça üç ila dört kez ters çevirerek boncuk ları yeniden askıya. Yıkama adımını üç kez tekrarlayın.Son yıkamadan sonra, supernatant tamamen çıkarın. Ardından, 300 mikrolitre fCLIP elüsyon arabelleği ekleyin. Boncuklardan aktive protein kinaz RNA'yı eleştirmek için 25 derecede 25 santigrat derecede kuluçkaya yatın.Oda sıcaklığında 1,000 g'da santrifüj edin ve süpernatantları temiz silikonlu bir tüpe aktarın. Son olarak, Proteinaz K 300 mikrolitre ekleyin ve 65 santigrat derece gecede kuluçka. S veya M fazındaki HeLa hücrelerinin hücre döngüsü ndeki arrestinin etkinliği FACS kullanılarak incelendi.D7F7 antikor immün çökelti protein kinaz RNA aktive üstün bir yetenek gösterdi. PKR immünopresör veya total HeLa lysate batı leke analizi PKR büyüklüğüne karşılık gelen sadece bir güçlü bant gösterdi, D7F7 antikor PKR tanımada son derece spesifik olduğunu gösteren. Farklı immün çökeltme verimliliği ile farklı PKR antikorları kullanarak, harita sıralama okuma farklı bir sınıf dağılımı ile sonuçlandı.Başarılı rRNA çıkarılması sırasında PKR co-immünoppititated RNase için radyoizotop sinyalinde azalma gözlendi. PKR co-immünopprepititated RNA örneği, negatif kontrollere göre mitokondriyal RNase güçlü zenginleştirme gösterdi. İplik spesifik ters transkripsiyon, S veya M fazı tutuklanan hücreler için PKR ile birlikte immünoppresipitated olan ağır ve hafif iplikçik mitokondriyal RNase ayırt etmek için kullanılmıştır.Hücre döngüsü tutuklama örneğinin hazırlanmasında en kritik adım, hücreleri PBS ile iki kez yıkamanız gereken ve homojenlik için sadece hücre pastel toplamanız gereken veya numunenin bozulduğu yerdir. Etik süreç için, en kritik adımlar formaldehit crosslinking ve miktar vardır. Bu işlemden sonra eluted RNA'lar kuzey blotlama, qRT PCR veya yüksek iş elde ekincing kullanılarak analiz edilebilir.Bu denemeler, PKR'ye bağlı RNase'nin türünü ve göreli miktarını belirleyebilir. Bu teknik, RNA bağlayıcı proteinlerin transkripsiyonel regülasyonu hakkındaki anlayışımızı geliştirecek olan RNA bağlayıcı proteinlerin RNA interaktörlerini incelemek ve tanımlamak için uygulanabilir. Formaldehit tehlikelidir, bu nedenle fiksasyon, çözelti ve ilk yıkama tamponunun dikkatli bir şekilde ele alınması gerekir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Çeviri başlatma karmaşık oluşumu memeli mRNA'ların Toeprinting analizi

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Floresans Live-hücre görüntüleme, tam bitkisel hücre döngüsü yavaş büyüyen sosyal bakteri Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Önceki kullanarak kloroplast eğitim Protein içe aktarma işlemi

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Rab10 Fosforilasyon Değerlendirilmesi tarafından Parkinson İlişkili LRRK2 Kinas yolu Sorgulama için İnsan Periferik Kan Nötrofil İzolasyon

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Transkripsiyon protein-protein etkileşimlerini Incelemek için Biolayer Interferometri (BLı) uygulaması

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kendi kendine monte Edilen İnsan Protein Mikrodizilerinde Kiaz Inhibitörü Taraması

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...