Name: cortisol measurement in koala (phascolarctos cinereus) fur
Uploaded: 2019-08-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cortisol Measurement in Koala Phascolarctos cinereus Fur at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Start-up-Forschungsförderung für Edward Narayan durch die Western Sydney University, School of Science and Health unterstützt. Die Autoren danken Jack Nakhoul für die Unterstützung bei der Probenverarbeitung.

Dieses Projekt wurde unter strengen Richtlinien für die Tier- und Humanpflege durchgeführt. Tierethik wurde von der Western Sydney University (A12373) gewährt. Zusätzlich wurden eine Laborrisikobewertung sowie Biosicherheits- und Strahlenform eingereicht und von der Western Sydney University akzeptiert, um diese Forschung sicher durchzuführen (B12366).
HINWEIS: Koala-Pelzproben für dieses Projekt wurden vom Adelaide Koala and Wildlife Hospital am 282 Anzac Highway in Plympton South Austr...

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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Hair+Cortisol+Concentrations+to+Assess+the+Effect+of+Anthropogenic+Impacts+on+Wild+Chimpanzees+(Pan+troglodytes).">Measuring Hair Cortisol Concentrations to Assess the Effect of Anthropogenic Impacts on Wild Chimpanzees (Pan troglodytes).</a> PLoS ONE. 11 (4), 0151870 (2016).</li><li>Aderjan, R., Rauh, W., Vecsei, P., Lorenz, U., Ruttgers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+cortisol,+tetrahydrocortisol,+tetrahydrocortisone,+corticosterone,+and+aldosterone+in+human+amniotic+fluid.">Determination of cortisol, tetrahydrocortisol, tetrahydrocortisone, corticosterone, and aldosterone in human amniotic fluid.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 8 (1), 525-528 (1977).</li><li>Nejad, J. 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Es gibt eine Reihe von Studien, die eine Reihe von Techniken verwenden, um Cortisol in Säugetierfell zu erkennen. Diese Studie präsentiert Ergebnisse für den Nachweis von Cortisol in Fellen, die von einem wilden Koala gesammelt wurden, der aktuellem anthropogenen Stress ausgesetzt ist. Diese bahnbrechende Studie verwendete Pelz, um zu testen, welches der drei häufig verwendeten Lösungsmittel am besten Cortisol, ein Maß für chronischen Stress, aus Koalafell extrahiert. Die Ergebnisse zeigten, dass 100% Methanol das...

Australische Ökosysteme erhalten das menschliche Leben durch die Bereitstellung von Dienstleistungen einschließlich Nahrung und Ballaststoffen und vielen anderen dynamischen Wechselwirkungen1. Ironischerweise ist es die menschliche Aktivität, die als haupttreibender Treiber für Dieökosystemstörungen durch den Wandel der biologischen Vielfalt fungiert2. Die Fragmentierung von Lebensräumen, bekannt als der Prozess der Aufteilung großer kontinuierlicher Lebensräume in kleine, voneinander isolierte Landflächen, ist die größte anthropogene Veränderung der biologischen Vielfalt, die die australischen Ökosysteme bedroht2. Die Fragmentierung der Lebensräume ändert die Struktur und Vielfalt der Artenzusammensetzung in einem bestimmten Gebiet und verringert so die Lebensraumfläche, die für diese Arten zur Erhaltung lebensfähiger Populationen erforderlich ist2. Das Ergebnis ist ein verstärkter Wettbewerb zwischen Denarten um Ressourcen wie Nahrung, Treibstoff, Fasern und Wasser3. Die Zerstörung australischer Ökosysteme durch veränderungen in der biologischen Vielfalt hat katastrophale Folgen für viele australische einheimische Arten1.
Australiens ikonischste Beuteltierart, der Koala (Phascolarctos cinereus), hängt davon ab, dass die australischen Ökosysteme für ihr Überleben gesund bleiben4. Die Einführung der Europäischen Siedlung führte zu einem rapiden Rückgang der australischen Koalaspopulationen, da sie in einem großen Exporthandel für ihre Felle geschlachtet wurden, um Profit zu erzielen5. Diese Praxis wurde in den 1980er Jahren verboten und populationen von Koalas waren dann in der Lage,5zu stabilisieren. Jedoch hat exponentielles Wachstum der menschlichen Bevölkerung dazu geführt, dass diese Art um einen Großteil ihres Lebensraums konkurriert, und ihr Überleben ist wieder bedroht6. Nach Angaben der International Union for the Conservation of Nature (IUCN) sind alle Populationenaustralischer Koalas als vom Aussterben bedroht gelistet, tendenzianisch. Diese Auflistung wird auf die Ungewissheit um relevante Populationsparameter und die deutliche Veränderung der Populationstrends für diese Art7zurückgeführt. Als die ikonischsten und endemischsten Tiere profitieren Koalas der australischen Wirtschaft durch den Tourismus (NSW Office of Environment and Heritage 2018). Eine Schätzung legt nahe, dass der Koala-Tourismus etwa 9.000 Arbeitsplätze geschaffen hat und zwischen 1,1 und 2,5 Milliarden US-Dollar zur Wirtschaft beiträgt (NSW Office of Environment and Heritage 2018). Die Entfernung einer Art hat das Potenzial, katastrophal zu sein, und kann in der stetigen Abnahme der einheimischen australischen Tierwelt6gesehen werden. Darüber hinaus wird die australische Wirtschaft die Auswirkungen spüren, wenn die Populationen der australischen Koalas weiterhin mit der Geschwindigkeit sinken, die sie6beträgt.
Es wird vermutet, dass die Prävalenz von Tod und Krankheit als Reaktion auf die Fragmentierung von Lebensräumen das Ergebnis von chronischem Stress ist8. Bereits jetzt wurden 24 Beuteltierarten in Australien aufgrund der Fragmentierung von Lebensräumen für ausgestorben erklärt, wobei Koalas einem ähnlichen Trend folgen8. Die Komplexität der Habitatfragmentierung und der biologischen Systeme ist synergistisch, kann aber durch die Analyse der Stressreaktion6ausgepackt werden. Im Allgemeinen aktiviert jede Störung in der natürlichen Umgebung eines Tieres eine komplexe Kaskade neurohormonaler Ereignisse, die als "Kampf oder Flucht"-Reaktion bekannt ist9,10. Diese Reaktion auf Stress ist ein Prozess, der im Gehirn beginnt, wo die Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse (HPA) aktiviert ist11. Eine Komponente des Gehirns namens Hypothalamus setzt corticotrophin-releasing Hormon (CRH) frei, das dann signalisiert, dass die vordere Hypophyse adrenocorticotrophic Hormon (ACTH)11freisetzen. Dies wiederum stimuliert die Glukokortikoid-Sekretion aus der Nebennieren-Medulla. Der Körper zirkuliert Glukokortikoide durch das Blut, das die Speicherung von Glukose aus Glykogen leitet und Glukose aus gespeichertem Glykogen11mobilisiert. Diese Kaskade neurohormonaler Ereignisse ist die Reaktion, die das Tier verwendet, um mit unvorhersehbaren Reizen umzugehen11. Wenn jedoch Glukokortikoide freigesetzt werden und über einen längeren Zeitraum erhöht bleiben, gilt das Tier als chronischer Stress12,13. Dieser Prozess beinhaltet die Ableitung von Energie weg von anderen körperlichen Körperfunktionen, wie es für die laufende Glukokortikoid-Produktion benötigt wird13. Als Ergebnis kann chronischer Stress Wachstum, Fortpflanzung und Immunität verbieten, alles sind wichtige Fitnessmerkmale, die für das Überleben erforderlich sind14.
Die Messung der Glukokortikoiumproduktion eines Tieres ist ein gängiger Indikator, der verwendet wird, um zu bestimmen, ob das Tier physiologischen Stress hat15. Dazu können Glukokortikoide im Blutplasma, Serum, Speichel, Urin oderFäkalien 16 gemessen werden. Jedoch, Beweise deuten darauf hin, dass Haar ist ein viel effektiver Indikator für chronischen Stress, im Gegensatz zu den oben genannten16. Dies liegt daran, Haar wird gedacht, um blutübertragene Hormone während seiner Wachstumsphase zu integrieren; sie ist relativ stabil; und jedes Cortisol, das im Haar nachgewiesen wird, spiegelt physiologischen Stress wider, der während des Zeitraums des Haarwachstums erlebt wird, der Wochen bis Monate16betragen kann. Darüber hinaus sollte jede Sammlung von Cortisol nicht-invasiv sein, um den Stress zu minimieren, der mit der Erfassung und Handhabung von16verbunden ist. Jedoch, Jeder Stress während dieses Ereignisses erlebt würde glukokortikoiden Ebenen im Haar nicht beeinflussen16. Es gab viele Studien, die die Fähigkeit der Verwendung von Haaren, um Langzeitstress bei einer Reihe von Tieren zu messen, und umfassen Studien an Rentier, Grizzlybären, Rhesusaffen, Muskoxen und Braunbären17,18, 19 , 20 , 21. Haarcortisol wird in der Regel durch erstes Waschen der Probe extrahiert, um sicherzustellen, dass Schweiß und Talg-abgeleitetes Cortisol, das auf der Oberfläche des Haares abgelagert wird, nicht mit Cortisol mitextrahiert wird und dann die Probe in einem Perlenschlag pulverisiert22. Nach dem Waschen muss die Probe getrocknet werden, um eine vollständige Verdunstung zu gewährleisten22. Schließlich kann die Probe mit einem Lösungsmittel extrahiert und rekonstituiert werden, um den Test von Cortisol22zu erleichtern. Das gängigste Lösungsmittel, das zur Gewinnung von Cortisol aus Fell verwendet wird, ist Methanol21,23; es gibt jedoch einige Studien, die Ethanol und Isopropanol in ihren Cortisolextraktionstechniken verwenden. Zum Beispiel war eine Studie, die Ethanol verwendet, erfolgreich für die Extraktion von Cortisol aus menschlicher Fruchtwasser24. Zusätzlich, eine Studie, die Isopropanol verwendet wurde erfolgreich für die Extraktion von Cortisol aus menschlichen Haaren und Nägeln25,26. Aus diesem Grund wurden in dieser Studie alle drei Lösungsmittel (Methanol, Ethanol und Isopropanol) getestet, um festzustellen, welche für die Extraktion von Cortisol aus Proben von Koalafell am erfolgreichsten war.
Das primäre Ziel dieser Studie war es, aktuelle Techniken zu verwenden, um eine optimale Hormonextraktionstechnik zu validieren, die als nicht-invasive Sysolmessung aus Koalafell verwendet werden soll. Dies wurde durch die Prüfung von drei Extraktionslösungsmitteln (Methanol, Ethanol und Isopropanol) erreicht. Wir vermuteten, dass Methanol das optimale Lösungsmittel für die Extraktion von Cortisol aus Koala-Pelz verwendet wird, weil es das empfohlene Lösungsmittel der Extraktion durch Arbor Assay Cortisol Kits27ist.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:616px;" width="616">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:72px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:211px;">1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Chrome Steel Beads</td>
			<td style="width:72px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:211px;">3.2 mm x 3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Cortisol Kit</td>
			<td style="width:72px;">Arbor Assays</td>
			<td style="width:119px;">K003-H1W</td>
			<td style="width:211px;">Manufactured in Michigan USA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit</td>
			<td style="width:72px;">Arbor Assays</td>
			<td style="width:119px;">K003-H5</td>
			<td style="width:211px;">Used first-time for cortisol testing in koala fur</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:72px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:211px;">HPLC Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:72px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:211px;">HPLC Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Methanol</td>
			<td style="width:72px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:211px;">HPLC Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Micro Pipette</td>
			<td style="width:72px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:211px;">n/a</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Micro Precision Sieve</td>
			<td style="width:72px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:211px;">0.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:72px;">Bio Radi</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:211px;">n/a</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Microplate Washer</td>
			<td style="width:72px;">Bio Radi</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:211px;">n/a</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Orbital Shaker</td>
			<td style="width:72px;">Bio Line</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:211px;">n/a</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Plastic Weighing Boat</td>
			<td style="width:72px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:211px;">n/a</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Plate Sealer</td>
			<td style="width:72px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:211px;">n/a</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Precision Balance</td>
			<td style="width:72px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:211px;">n/a</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Vortex Mixer</td>
			<td style="width:72px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:211px;">n/a</td>
		</tr>
	</tbody>
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cortisol measurement in koala (phascolarctos cinereus) fur

Optimale Methoden der Hormonextraktion, die verwendet werden, um Stress bei Tieren über Stichprobenarten hinweg zu messen, sind nicht immer gleich. Australiens ikonische Beuteltierart, der Koala (Phascolarctos cinereus), sieht sich einer längeren Exposition anthropogener Stressoren ausgesetzt und die Bewertung von chronischem Stress in wilden Populationen ist dringend gerechtfertigt. Eine der effektivsten Methoden, um chronischen Stress zu messen, ist durch die Analyse des Glukokortikoidhormons Cortisol in Haar oder Fell, da es physiologische und Verhaltensreaktionen unterstützt. Diese Laborvalidierungsstudie zielt darauf ab, aktuelle Techniken zu testen, um eine optimale Hormonextraktionsmethode zu validieren, die als nicht-invasive Santids-Maßnahme von Cortisol in Koalafellen verwendet werden soll. Es wird anerkannt, dass die Verwendung nicht-invasiver Techniken zur Messung von Stresshormonen aufgrund ihrer idealen praktischen und ethischen Standpunkte gegenüber traditionellen, invasiven Techniken bevorzugt wird. Darüber hinaus ist es vergleichsweise einfacher, Fell von Koalas zu erwerben, als Proben ihres Blutes zu erwerben. Diese Studie verwendete Proben von Koala-Pelz, die vom Adelaide Koala and Wildlife Hospital erworben wurden, um eine Reihe von Hormonextraktionstechniken auszuführen, um eine optimale Cortisolextraktionsmethode zu validieren. Die Ergebnisse zeigten, dass 100% Methanol die optimale Lösungsmittelextraktion im Vergleich zu 100% Ethanol oder 100% Isopropanol auf der Grundlage von Parallelitätsergebnissen lieferte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode der Cortisolextraktion aus Koalafellen einen zuverlässigen nicht-invasiven Assay lieferte, der verwendet werden könnte, um chronischen Stress in Koalas zu untersuchen.

Der Assay-Nachweis von Hormonmetaboliten von Interesse wird mittels Parallelität bestimmt. Mit Hilfe einer Parallelitätskurve bestimmt der 50%-Bindungspunkt auch den Probenverdünnungsfaktor auf der Standardkurve (Abbildung 1). Wie im Parallelitätsdiagramm (Abbildung 1) dargestellt, lieferten die 100% Ethanol- und 100% Isopropanol-Extrakte keine parallele Verschiebung gegenüber dem Cortisolstandard. Der 100%ige Methanolextrakt sorgte jedoch für eine parallele Verschiebung gegenüber...

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Cortisol Measurement in Koala Phascolarctos cinereus Fur

Wir präsentieren ein Protokoll zur Bestimmung des optimalen Extraktionslösungsmittels zur Messung von Cortisol aus Koalafell. Die in diesem Protokoll verwendeten Lösungsmittel sind Methanol, Ethanol und Isopropanol. Die Bestimmung eines optimalen Extraktionslösungsmittels hilft bei der zuverlässigen Messung von Fellen, um die Auswirkungen chronischer Belastungen auf Koalas zu bestimmen.

Cortisol Messung in Koala (Phascolarctos cinereus) Pelz

Optimal methods of hormone extraction used to measure stress in animals across sample types are not always the same. Australia&#39;s iconic marsupial ...

Dies ist eine neuartige Methode zur Beurteilung des Glukokortikoidhormons Cortisol aus Koalafell. Es bietet einen neuartigen Biomarker für die Beurteilung von chronischem Stress in Koalas. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es sich um eine hochempfindliche und reproduzierbare Methode mit einer ziemlich schnellen Bearbeitungszeit zwischen Probenvorbereitung und Hormontest handelt.Diese Technik ermöglicht die quantitative Bewertung von chronischem Stress in Koalas, das ein sehr nützliches klinisches Management-Tool ist. Dylan Fox, ein Grad-Student aus meinem Labor, hilft mir bei diesem Verfahren. Um dieses Verfahren zu beginnen, holen Sie das Fell aus dem Lager bei minus 80 Grad Celsius und lassen Sie es bei Raumtemperatur auftauen.Dann wiegen Sie das Fell auf einem Labor analytische Präzisionsbalance. 60 Milligramm des Fells in ein vorgewogenes und beschriftetes 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr geben und wiederholen, bis 18 Tuben gefüllt sind. Mit einer Pipette, fügen Sie einen Milliliter von 100%HPLC Grad Isopropanol zu jedem Rohr.Wirbeln Sie die Proben für 30 Sekunden. Jede Probe mit einem 0,5-Milliliter-Mikropräzisionssieb abseihen, um flüssigkeits- und pelzlösenzukönnen, und entsorgen Sie die Flüssigkeit in einen Abfallbehälter. Legen Sie jede Fellprobe in ein beschriftetes Kunststoff-Wägeboot.Dann legen Sie die Wägeboote in einen Vakuum-Austrocknungsgerät und lassen Sie für drei Tage das Fell trocknen. Sobald das Fell vollständig trocken ist, legen Sie jede Probe in ein beschriftetes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Jede Probe in eine Perlenmühle mit drei Chrom-Stahlperlen geben und zwei Minuten bei 30 Shakes pro Sekunde pulverisieren.Wiederholen Sie diesen Transfer mit 100% analytischem Methanol und 100% analytischem Isopropanol, bis 18 Gesamtrohre gefüllt wurden. Danach verwenden Sie eine Pipette, um einen Milliliter der ersten Extraktionstechnik in sechs 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhren zu übertragen, die die Fellprobe enthalten. Verkapseln Sie jedes Rohr und verwenden Sie einen Shaker, um sie bei Raumtemperatur mit konstantem Pulsieren für mindestens 12 Stunden zu bebrüten.Dann die Proben mit einem 0,5-Milliliter Mikropräzisionssieb abseihen. Verwenden Sie eine Pipette, um die Flüssigkeit in ein neues beschriftetes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr zu übertragen, während Sie sicherstellen, dass das Fell entsprechend entsorgt wird. In einer Dunstabzugshaube den Lösungsmittelextrakt unter einem Stickstoffdampfstrom vollständig ausprobieren.Rekonstituieren Sie dann die getrocknete Probe mit 400 Mikroliter Assaypuffer und 100 Mikrolitern Ethanol in analytischer Qualität. Um die Kontrollen durchzuführen, wählen Sie zunächst Proben von Tieren mit bekannter Exposition gegenüber dem Stressor aus. Um einen Extraktpool zu bilden, nehmen Sie 20 Mikroliter Extrakt aus jeder Probe, bis ein Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern erhalten ist.Bewahren Sie den Extraktpool bei minus 80 Grad Celsius auf, bis er bereit ist, Assays auszuführen. Wenn Sie bereit sind, erhalten Sie den Verdünnungsfaktor für die 30% und 70%-Bindungspunkte aus dem Parallelitätsdiagramm für den Extrakt mit dem Cortisolstandard, und verwenden Sie den Assaypuffer, um den Probenpool entsprechend zu verdünnen, um die hohen und niedrigen Kontrollen zu erstellen. Mit einem kommerziellen Cortisol-Kit eine 96-Well-Bandplatte mit den Proben, Kontrollen, Cortisol-Standards, unspezifisch bindenden Brunnen und maximal bindenden Brunnen nach den Anweisungen des Lieferanten einrichten.Verwenden Sie das im Kit-Booklet enthaltene Plattenlayoutblatt, um die Positionen der Proben, Steuerelemente und Standards aufzulisten. Als nächstes folgen Sie dem zuvor beschriebenen Pelzhormonextraktionsprozess, um 100% Methanol-extrahiertes Koalafell zu erhalten. Bereiten Sie die Reagenzien des Cortisol-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.Pipette 50 Mikroliter Proben oder Standards in die Brunnen der Platte. Pipette 75 Mikroliter Assaypuffer in die unspezifisch bindenden Brunnen und 50 Mikroliter Assaypuffer in die maximal bindenden Brunnen. Mit einer Repeaterpipette fügen Sie 25 Mikroliter des Cortisol-Konjugats zu jedem Brunnen hinzu.Dann Pipette 25 Mikroliter des Cortisol-Antikörpers in jeden Brunnen, mit Ausnahme der unspezifisch bindenden Brunnen. Tippen Sie vorsichtig auf die Seiten der Platte, um sicherzustellen, dass die Reagenzien gut gemischt sind. Bedecken Sie die Platte mit dem Plattenversiegeler, und verwenden Sie einen Orbital-Shaker, um bei Raumtemperatur für eine Stunde zu schütteln.Danach entfernen Sie die Plattendichtung und saugen Sie die Brunnenplatte an, indem Sie jeden Brunnen mit 300 Mikroliter Waschpuffer viermal waschen. Trocknen Sie dann die Platte, indem Sie sie auf saubere saugfähige Handtücher tippen. Pipette 100 Mikroliter Tetramethylbenzidinsubstrat zu jedem Brunnen.Legen Sie die Plattenversiegelung auf die Brunnenplatte und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Danach Pipette 50 Mikroliter Stop-Lösung in jedem Brunnen. Übertragen Sie die Platte in einen Plattenleser, der 450 Nanometer lesen kann, und berechnen Sie die endgültige Hormonkonzentration, wie im Textprotokoll beschrieben.In dieser Studie wird der Aufsatznachweis von Hormonmetaboliten von Interesse durch Parallelität bestimmt. In der Parallelitätskurve bestimmt der 50%-Bindungspunkt den Probenverdünnungsfaktor auf der Standardkurve. Wie man sieht, lieferten die 100%ethanol- und 100%isopropanol-Extrakte keine parallele Verschiebung gegenüber dem Cortisol-Standard.Der 100%methanol-Extrakt bietet jedoch eine parallele Verschiebung gegenüber dem Cortisol-Standard. Intra- und Inter-Assay-Variationskoeffizienten werden aus hoch- und niedrigbindenden Probenextrakten bestimmt, die in allen Assays ausgeführt werden. Die niedrigverbindlichen internen Kontrollen gelten als ordentlicher Koala-Extrakt-Pool, während die hochverbindlichen internen Kontrollen als eins-zu-zwei verdünnter Koala-Extrakt-Pool angesehen werden.Die Assoziation zwischen jedem Lösungsmittelextrakt und dem Cortisolstandard wird dann mittels eines Regressionsdiagramms bestimmt. Der 100%methanol-Extrakt bietet die beste Regressionslinie mit dem höchsten R-Quadrat-Wert im Vergleich zu den 100% Ethanol- und 100%isopropanol-Extrakten. Es ist wichtig, daran zu erinnern, dass die Probe Waschschritt vor dem Schleifen der Proben durchgeführt werden muss, um den Verlust von Steroidhormonen zu vermeiden.Nach diesem Verfahren können wir andere steroidale Hormone messen, wie Fortpflanzungshormone, um die Wechselwirkungen zwischen Stress und Fortpflanzung in Koalas zu betrachten. Diese Technik bietet ein neues Werkzeug für das aufkommende Gebiet der Erhaltungsphysiologie, das die nicht-invasive Beurteilung von Cortisol in Koalafellermöglicht. Das kommerzielle Cortisol-Kit liefert Reagenzien in winziger Menge.Es ist jedoch wichtig, persönliche Schutzausrüstung zu tragen, um Verletzungen an sich selbst zu minimieren, während Sie dieses Laborverfahren durchführen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur

Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads

Messung der Basal- und Forskolin-stimulierten Lipolyse bei Inguinal Adipose Fat Pads

Lipolysis is a process by which the lipid stored as triglycerides in adipose tissues are hydrolyzed into glycerol and fatty acids. This article describes ...

Forschung

Biochemie

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Vorbereitung der Keratin-Hydrolysat aus Hühnerfedern und ihre Anwendung in der Kosmetik

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Permeabilized Fasern von Drosophila mit minimalen Mengen von Gewebe

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

In Situ Messung und Korrelation der Zelldichte und Lichtemission von Biolumineszenten Bakterien

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

Messung der Konzentration der Ionen in der ungerührte Grenzschicht mit offenen Patch-Clamp-Pipette: Auswirkungen auf die Kontrolle der Ionenkanäle durch Flüssigkeit fließen

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affinitätsreinigung der Chloroplasten Translocon Proteinkomplexe mit dem TAP-Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

Direkte Messung des KDM1A Target Engagements mit Chemoprobe-basierten Immunoassays

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS

Pflanzenprobenvorbereitung zur Messung des Nukleosid-/Nukleotidgehalts mit EINER HPLC-MS/MS

Nucleosides/nucleotides are building blocks of nucleic acids, parts of cosubstrates and coenzymes, cell signaling molecules, and energy carriers, which ...

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Measurement of Fatty Acid ÃƒÅ½Ã‚Â²-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Messung der Fettsäure-β-Oxidation in einer Suspension frisch isolierter Maus-Hepatozyten

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

Time-resolved FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

Zeitaufgelöste Förster-Resonanz-Energietransfer-Assays zur Messung von endogenen phosphorylierten STAT-Proteinen in menschlichen Zellen

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...