Name: breath collection from children for disease biomarker discovery
Uploaded: 2019-02-14T15:00:00
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Esprimiamo la nostra gratitudine per i bambini e le famiglie dell'ospedale di St. Louis bambini che hanno partecipato a questo studio. Riconosciamo gli sforzi unici della signorina Stacy Postma e Sig. ra Janet Sokolich durante l'accumulazione di respiro. Questo lavoro è sostenuto dalla Fondazione Ospedale dei bambini St. Louis.

Lo studio è stato approvato dall'istituzionale Review Board di Washington University School of Medicine (#201709030). Consenso informato è stato ottenuto da un genitore o tutore legale prima dell'inclusione nello studio. Fotografie nella Figura 2 è riprodotto con consenso informato dei genitori.
1. Assemblea di campionatore respiro
<ol><li>Utilizzando guanti monouso, allegare un boccaglio cartone al campionatore respiro, come mostrato in supplementare <strong...

<ol>
	<li>Ahmed, W. M., Lawal, O., Nilsen, T. M., Goodacre, R., Fowler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+volatile+organic+compounds+of+infection:+a+systematic+review.">Exhaled volatile organic compounds of infection: a systematic review.</a> ACS Infectious Diseases. 3 (10), 695-710 (2017).</li><li>Berna, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+breath+specimens+for+biomarkers+of+Plasmodium+falciparum+infection.">Analysis of breath specimens for biomarkers of Plasmodium falciparum infection.</a> Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1120-1128 (2015).</li><li>Lawal, O., Ahmed, W. M., Nijsen, T. M. E., Goodacre, R., Fowler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+breath+analysis:+a+review+of+'breath-taking'+methods+for+off-line+analysis.">Exhaled breath analysis: a review of 'breath-taking' methods for off-line analysis.</a> Metabolomics. 13 (10), (2017).</li><li>Kang, S., Thomas, C. L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+long+may+a+breath+sample+be+stored+for+at-80+degrees+C?+A+study+of+the+stability+of+volatile+organic+compounds+trapped+onto+a+mixed+Tenax:Carbograph+trap+adsorbent+bed+from+exhaled+breath.">How long may a breath sample be stored for at-80 degrees C? A study of the stability of volatile organic compounds trapped onto a mixed Tenax:Carbograph trap adsorbent bed from exhaled breath.</a> Journal of Breath Research. 10 (2), (2016).</li><li>Basanta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+metabolomic+analysis+of+breath+using+differential+mobility+spectrometry+in+patients+with+chronic+obstructive+pulmonary+disease+and+healthy+smokers.">Non-invasive metabolomic analysis of breath using differential mobility spectrometry in patients with chronic obstructive pulmonary disease and healthy smokers.</a> Analyst. 135 (2), 315-320 (2010).</li><li>Mochalski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+and+breath+levels+of+selected+volatile+organic+compounds+in+healthy+volunteers.">Blood and breath levels of selected volatile organic compounds in healthy volunteers.</a> Analyst. 138 (7), 2134-2145 (2013).</li><li>Mochalski, P., Wzorek, B., Sliwka, I., Amann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitability+of+different+polymer+bags+for+storage+of+volatile+sulphur+compounds+relevant+to+breath+analysis.">Suitability of different polymer bags for storage of volatile sulphur compounds relevant to breath analysis.</a> Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (3), 189-196 (2009).</li><li>Mochalski, P., King, J., Unterkofler, K., Amann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+selected+volatile+breath+constituents+in+Tedlar,+Kynar+and+Flexfilm+sampling+bags.">Stability of selected volatile breath constituents in Tedlar, Kynar and Flexfilm sampling bags.</a> Analyst. 138 (5), 1405-1418 (2013).</li><li>Schaber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breathprinting+reveals+malaria-associated+biomarkers+and+mosquito+attractants.">Breathprinting reveals malaria-associated biomarkers and mosquito attractants.</a> Journal of Infectious Diseases. 217 (10), 1553-1560 (2018).</li><li>Herbig, J., Beauchamp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+in+the+analysis+of+breath+gas+volatiles.">Towards standardization in the analysis of breath gas volatiles.</a> Journal of Breath Research. 8 (3), (2014).</li><li>Phillips, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+volatile+organic+compounds+in+the+breath+of+normal+humans.">Variation in volatile organic compounds in the breath of normal humans.</a> Journal of Chromatography B. 729 (1-2), 75-88 (1999).</li><li>Eckel, S. P., Baumbach, J., Hauschild, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+importance+of+statistics+in+breath+analysis-hope+or+curse?.">On the importance of statistics in breath analysis-hope or curse?.</a> Journal of Breath Research. 8 (1), (2014).</li></ol>

Nonostante i notevoli progressi nella ricerca di respiro nell'ultimo decennio, le pratiche standardizzate per il campionamento e l'analisi di composti volatili respiro gas rimangono indefiniti10. Un motivo principale per questa mancanza di standardizzazione è stato la diversità dei metodi di raccolta di respiro, che hanno un impatto diretto sulla diversità chimica risultante presenti in qualsiasi campione dato respiro esalato. Respiro exhalata contiene una vasta gamma di composti organici volat...

Biomarcatori possono fornire preziose informazioni circa processi biologici normali e patologici che possono contribuire alla malattia clinicamente identificabile. Recentemente, c'è stato un crescente interesse nella valutazione di sostanze volatili respiro come biomarcatori per una varietà di Stati di malattia, compreso l'infezione, disordini metabolici e cancro 1. Espirata contiene livelli quantificabili di composti organici volatili (COV), composti organici semi-volatili e microbica derivato materiale (ad es., acidi nucleici da batteri e virus). L'obiettivo centrale dell'analisi del respiro esalato è di approfondire lo stato di una condizione medica e/o esposizioni ambientali non invadente. Ci sono vari metodi per la raccolta e l'analisi di respiro esalato, a seconda i costituenti di interesse. Attualmente non esiste un metodo di raccolta standardizzata di respiro esalato, che complica l'analisi comparativa dei risultati attraverso gli studi. Standardizzazione delle procedure di raccolta del respiro è essenziale, come la stessa procedura di campionamento ha un effetto notevole sui risultati a valle dell'analisi del respiro.
In molti studi, tardo respiratorio respiro campionamento è autonomo2,3. Questo campionamento coinvolge scartando la parte iniziale di respiro esalato ("dead space"), al fine di catturare preferenzialmente l'aria alla fine del ciclo del respiro. Il vantaggio di questa strategia è che riduce al minimo i livelli di VOC esogeni (ad es., ambientale COV), arricchendo per COV endogeno, specifico per ogni paziente. Questo metodo esclude i primi secondi di espirazione da un individuo prima di prelevare il campione di respiro. Altri ricercatori hanno utilizzato un sensore di pressione per attivare campionamento durante una fase di predefiniti di scadenza4,5. Poiché i sensori di pressione richiedono ingegneria complesso, questo metodo alternativo richiede un dispositivo di campionamento dedicato e relativamente costoso.
Campionamento alito pediatrica può essere particolarmente impegnativo. La preoccupazione principale è che i bambini piccoli sia in grado di cooperare con protocolli per volontario espirazione dell'aria "dead space". Per questo motivo, è più facile ottenere misto respiratorio respiro da bambini. Tuttavia, un avvertimento importante con campioni di aria espirata respiratoria mista è il rischio di contaminazione ambientale e dei materiale. Di conseguenza, la fattibilità della raccolta pediatrica è una preoccupazione di guida nel campo.
Inoltre, per i metodi di raccolta, stoccaggio di campioni di aria espirata può anche influenzare la qualità del campione. L'alta umidità in respiro exhalata e l'ultra-basse concentrazioni (parti per trilione) di respiro organici volatili composti fanno campioni di aria espirata particolarmente suscettibili a problemi legati al deposito6,7. Nonostante le grandi potenzialità delle tecniche in tempo reale come spettrometria di reazione-massa trasferimento di protone (PTR-MS), GC-MS rimane il gold standard per l'analisi di campioni di aria espirata. Analisi GC-MS di campioni di aria espirata, essendo una tecnica non in linea, è accoppiato con i metodi di pre-concentrazione quali tubi di desorbimento termico (TD), micro-estrazione in fase solida e dispositivi trappola dell'ago. Prima del pre-concentrazione, è necessario essere memorizzati temporaneamente in polimero borse8campioni di aria espirata. Borse di polimero sono popolari a causa del loro prezzo moderato, relativamente buona durevolezza e riusabilità. Mentre borse possono essere riutilizzati, tempo e fatica sono tenuti ad assicurare l'efficiente pulizia7,8. Ogni tipo di borsa specifica richiede anche empiricamente determinate e standardizzate le procedure per il controllo di qualità, riutilizzo e recupero.
TD tubi sono ampiamente utilizzati per pre-concentrazione respiro perché catturare un gran numero di sostanze volatili e possono essere personalizzati. I materiali assorbenti utilizzati per il confezionamento TD tubi possono essere adattati alle particolari applicazioni e sostanze volatili particolare target di interesse. TD tubi sostanzialmente migliorare la convenienza di studi di biomarcatore respiro, soprattutto in siti remoti, perché TD tubi tranquillamente conservare sostanze volatili respiro per almeno due settimane e sono facili da trasporto3.
Nel tentativo di standardizzare la raccolta di respiro pediatrica per la scoperta del biomarcatore, qui descriviamo un metodo semplice per raccogliere il respiro da bambini piccoli. Per illustrare i risultati rappresentativi dei protocolli implementati, i dati sono presentati da un gruppo in corso dei bambini (età 8-17) in fase di valutazione per la malattia dell'acido grasso non alcolica del fegato (NAFLD). Risultati completi e analisi di questo studio verranno segnalati in una pubblicazione successiva. In questo lavoro, segnaliamo un sotto insieme di dati per dimostrare l'applicazione del nostro protocollo. In breve, i bambini sono istruiti per espirare normalmente tramite boccaglio in un sacchetto di polimero, come se "soffiando un palloncino". Il processo viene ripetuto 2 - 4 volte fino a 1 L di respiro sono raccolti. Il campione è quindi trasferito in una provetta di TD e conservato a 5 ° C prima dell'analisi GC-MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1303px;" width="1301">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:243px;">Breath bag&#160;</td>
			<td style="width:171px;">SKC</td>
			<td style="width:119px;">237-03</td>
			<td style="width:771px;">These are 3 L bags</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cardboard mouthpiece&#160;</td>
			<td style="width:171px;">A-M systems</td>
			<td style="width:119px;">161902</td>
			<td>0.86&#34; OD, 2.00&#34; L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Large diameter tubing</td>
			<td style="width:171px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">95802-11</td>
			<td>Silicone Tubing, 1/4&#34;ID x 5/16&#34;OD,</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long-term storage caps&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Markes International</td>
			<td>C-CF010</td>
			<td>Brass storage cap &#188;&#34; &#38; PTFE ferrule, pk 10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Male adapter</td>
			<td style="width:171px;">Charlotte Pipe</td>
			<td style="width:119px;">2109</td>
			<td>Part 1/3 of breath connector (1/2&#34; Universal part No. 436-005)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Male adapter (made from Teflon)</td>
			<td style="width:171px;">In-house built</td>
			<td></td>
			<td>Part 3/3 of breath connector (1/4&#34; ID x 1/2&#34; MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pump</td>
			<td style="width:171px;">SKC</td>
			<td>220-1000TC-C</td>
			<td>Pocket PumpTouch with Charger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small diameter tubing&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Supelco</td>
			<td style="width:119px;">20533</td>
			<td style="width:771px;">Teflon tubing&#160; L &#215; O.D. &#215; I.D. 25 ft &#215; 1/4 in. (6.35 mm) &#215; 0.228 in. (5.8 mm)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermal desorption tubes&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Markes International</td>
			<td style="width:119px;">C2-CAXX-5314</td>
			<td>Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube capping/uncapping tool</td>
			<td style="width:171px;">Markes International</td>
			<td>C-CPLOK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Two-way ball valve connector&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Homewerks Worldwide</td>
			<td style="width:119px;">VBV-P40-E3B</td>
			<td>Part 2/3 of breath connector (1/2&#34;)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

breath collection from children for disease biomarker discovery

Analisi e raccolta di respiro può essere utilizzati per scoprire volatili biomarcatori in un certo numero di malattie infettive e non infettive, come la malaria, la tubercolosi, cancro ai polmoni e affezione epatica. Questo protocollo descrive un metodo riproducibile per il campionamento di respiro nei bambini e quindi stabilizzare campioni di aria espirata per ulteriori analisi con spettrometria della cromatografia-massa del gas (GC-MS). L'obiettivo di questo metodo è quello di stabilire un protocollo standardizzato per l'acquisizione di campioni di aria espirata per ulteriore analisi chimica, da bambini di 4-15 anni. In primo luogo, respiro viene campionata utilizzando un boccaglio cartone attaccato ad una valvola 2 vie, che è collegata ad un sacchetto di 3L. Respiro analiti sono poi trasferiti in una provetta di desorbimento termico e conservati a 4-5 ° C fino all'analisi. Questa tecnica è stata utilizzata in precedenza per catturare il respiro dei bambini con la malaria per identificazione di biomarcatori di successo respiro. Successivamente, abbiamo applicato con successo questa tecnica per ulteriori coorti pediatriche. Il vantaggio di questo metodo è che esso richiede la cooperazione minimo da parte del paziente (di particolare valore nella popolazione pediatrica), ha un periodo di breve raccolta, non richiede personale specializzato e può essere eseguita con apparecchiature portatili in impostazioni del campo di risorse limitate.

Nel nostro studio, respiro sono stati raccolti campioni da 10 bambini (8-17 anni) in fase di valutazione all'ospedale dei bambini di St. Louis. Campioni di aria espirata e campioni di aria ambiente (n = 10) sono stati raccolti come sopra descritto. I campioni sono stati analizzati mediante spettrometria di massa tempo di volo del quadrupole gas cromatografia (GC-QToF-MS) e desorbimento termico, come descritto in precedenza9. Dopo la rimozione di contaminan...

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Breath Collection from Children for Disease Biomarker Discovery

Collezione di respiro dai bambini per la scoperta di Biomarker di malattia

Questo protocollo descrive un metodo semplice per l'acquisizione di campioni di aria espirata da bambini. Brevemente, campioni di aria mista pre-sono concentrati in tubi sorbente prima dell'analisi gas cromatografia spettrometria di massa. Biomarcatori di respiro delle malattie infettive e non infettive possono essere identificati usando questo metodo di raccolta di respiro.

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, ...

Un metodo standardizzato di raccolta del respiro nei bambini potrebbe essere utilizzato per rispondere a domande chiave sullo stato delle condizioni mediche pediatriche in modo non invasivo e per confrontare i risultati tra gli studi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la raccolta di campioni di respiro dai bambini in modo semplice, non invasivo e riproducibile. Le implicazioni di queste tecniche si estendono alla diagnosi di una vasta gamma di stati di malattia tra cui infezioni, disturbi metabolici e cancro e per test di punto di cura per uso clinico.L'istruzione visiva è molto utile perché ci sono così tante parti nella nostra attrezzatura per la raccolta del respiro e perché la configurazione dell'attrezzatura può essere complicata. Per assemblare l'attrezzatura del campione di respiro, attaccare un bocchino di cartone al campionatore del respiro e attaccare una breve lunghezza di tubi di grande diametro all'altra estremità del campionatore. Collegare il connettore del respiro alla valvola del sacchetto tramite il tubo.Ruotare la vite del pollice zigrinata sul lato del raccordo di ingresso in senso antiorario per sbloccare la valvola in posizione aperta e spingere lo stelo della valvola del sacchetto verso il basso per aprire il raccordo di ingresso per il campionamento. Ruotare la vite del pollice zigrinata sul lato del raccordo di ingresso in senso orario per bloccare la valvola aperta e confermare che la valvola blu sul campionatore del respiro è aperta e parallela al connettore. Quindi scrivi l'ID paziente, la data e l'ora sull'etichetta del sacchetto polimerico.Prima di iniziare la raccolta del respiro, utilizzare un campionatore di respiro senza borsa per dimostrare l'espirazione del respiro al paziente. Spiega che il paziente dovrebbe respirare come farebbe quando fa saltare in aria un palloncino e continuare a respirare il più comodamente possibile. Fornire al paziente il campionatore di respiro etichettato e chiedere al paziente di espirare nella borsa come nella dimostrazione.Chiudere la valvola blu sul dispositivo del campionatore del respiro non appena il paziente ha finito di respirare e dopo aver aspettato almeno 30 secondi tra le raccolte, il paziente ha ripetuto l'espirazione fino a quando non è stato raccolto almeno un litro di respiro. Si noti sull'etichetta della borsa quanti respiri sono stati raccolti dal paziente e ruotare la vite del pollice zigrinata sul lato del raccordo di ingresso in senso antiorario per spingere lo stelo della valvola verso l'alto per chiudere il raccordo di ingresso. Quindi ruotare la vite del pollice zigrinata sul lato del raccordo di ingresso in senso orario per bloccare la valvola del sacchetto chiusa e staccare la borsa dal campionatore del respiro.Immediatamente dopo aver raccolto il campione di respiro, attaccare un nuovo sacchetto campione a una porta di uscita della pompa. E spingere lo stelo della valvola del sacchetto verso il basso per aprire il raccordo di ingresso per il campionamento. Ruotare la vite del pollice zigrinata sul lato del raccordo di ingresso in senso orario per bloccare la valvola aperta e impostare la pompa a funzionare a 100 millilitri al minuto per 12 minuti.La pompa raccoglierà 1.200 millilitri di aria ambiente. Al termine della raccolta dell'aria ambiente, ruotare la vite del pollice zigrinata sul lato del raccordo di ingresso in senso antiorario e spingere lo stelo della valvola verso l'alto per chiudere il raccordo di ingresso. Quindi ruotare la vite del pollice zigrinata sul lato del raccordo di ingresso in senso orario per bloccare la valvola del sacchetto chiusa e staccare la borsa dalla pompa.Per trasferire il campione di respiro o aria ambiente in un tubo di desorbimento termico entro un'ora dalla raccolta, rimuovere il tubo dal frigorifero e utilizzare il tubo di tappatura del produttore per rimuovere i tappi di stoccaggio a lungo termine dal tubo assorbente. Utilizzare i tubi per fissare l'estremità scanalata del tubo alla borsa e inserire l'altra estremità del tubo di desorbimento termico in un pezzo di tubo collegato a una pompa. Impostare la pompa a 100 millilitri al minuto per 10 minuti.Ruotare la vite del pollice zigrinata sul lato del raccordo di ingresso in senso antiorario per aprire la valvola e spingere lo stelo della valvola verso il basso per aprire il raccordo di ingresso prima di avviare la pompa. Dopo 10 minuti, la pompa si fermerà. Rimuovere il tubo assorbente di desorbimento termico, stringere i tappi su entrambe le estremità e conservare il tubo assorbente in frigorifero fino all'analisi.In questo studio rappresentativo sui campioni di respiro e aria ambiente di 10 bambini sottoposti a valutazione presso il St.Louis Children's Hospital, sono stati trovati in media composti organici o COV significativamente più volatili nei campioni del respiro rispetto ai campioni di controllo ambientale ambientale. L'aumento del numero di COV nel respiro rispetto all'aria ambiente può essere visibilmente distinto confrontando i cromatogrammi ionici totali rappresentativi in ciascun campione. Come misura di controllo della qualità della raccolta del respiro di successo, i livelli di due COV del respiro comuni sono stati confrontati con i controlli dell'aria ambiente.Isoprene, uno dei COV più abbondanti nel respiro è stato misurato in una concentrazione dieci volte maggiore nei campioni di respiro pediatrico rispetto ai controlli dell'aria ambiente. Mentre la beta-pinena, che si trova tipicamente in sotto-parti per miliardo di livelli, ha mostrato una triplice abbondanza di respiro superiore rispetto all'aria confermando il successo della raccolta del respiro. È importante trasferire il campione di respiro ai tubi assorbenti entro un'ora dalla raccolta del respiro e notare l'orientamento del tubo durante il trasferimento.Seguendo questa procedura, gli investigatori potrebbero voler perseguire studi su modelli animali per rispondere a domande aggiuntive sul pubblico di composti volatili del respiro.

Research

JoVE Journal

Chemistry

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