Name: breath collection from children for disease biomarker discovery
Uploaded: 2019-02-14T15:00:00
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Expresamos nuestro agradecimiento a los niños y familias del Hospital de St. Louis los niños que participaron en este estudio. Reconocemos los esfuerzos únicos de la Sra. Stacy Postma y Sra. Janet Sokolich durante la colección de la respiración. Este trabajo es apoyado por la Fundación del Hospital infantil de St. Louis.

El estudio ha sido aprobado por la institucional Review Board de Washington University School of Medicine (#201709030). El consentimiento informado fue obtenido de un padre o tutor legal antes de la inclusión en el estudio. Fotografías en la figura 2 se reproducen con el consentimiento informado de los padres.
1. Asamblea de aliento sampler
<ol><li>Utilizando guantes desechables, instale una boquilla de cartón en el sampler de la respiración, como se muestra...

<ol>
	<li>Ahmed, W. M., Lawal, O., Nilsen, T. M., Goodacre, R., Fowler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+volatile+organic+compounds+of+infection:+a+systematic+review.">Exhaled volatile organic compounds of infection: a systematic review.</a> ACS Infectious Diseases. 3 (10), 695-710 (2017).</li><li>Berna, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+breath+specimens+for+biomarkers+of+Plasmodium+falciparum+infection.">Analysis of breath specimens for biomarkers of Plasmodium falciparum infection.</a> Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1120-1128 (2015).</li><li>Lawal, O., Ahmed, W. M., Nijsen, T. M. E., Goodacre, R., Fowler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaled+breath+analysis:+a+review+of+'breath-taking'+methods+for+off-line+analysis.">Exhaled breath analysis: a review of 'breath-taking' methods for off-line analysis.</a> Metabolomics. 13 (10), (2017).</li><li>Kang, S., Thomas, C. L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+long+may+a+breath+sample+be+stored+for+at-80+degrees+C?+A+study+of+the+stability+of+volatile+organic+compounds+trapped+onto+a+mixed+Tenax:Carbograph+trap+adsorbent+bed+from+exhaled+breath.">How long may a breath sample be stored for at-80 degrees C? A study of the stability of volatile organic compounds trapped onto a mixed Tenax:Carbograph trap adsorbent bed from exhaled breath.</a> Journal of Breath Research. 10 (2), (2016).</li><li>Basanta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+metabolomic+analysis+of+breath+using+differential+mobility+spectrometry+in+patients+with+chronic+obstructive+pulmonary+disease+and+healthy+smokers.">Non-invasive metabolomic analysis of breath using differential mobility spectrometry in patients with chronic obstructive pulmonary disease and healthy smokers.</a> Analyst. 135 (2), 315-320 (2010).</li><li>Mochalski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+and+breath+levels+of+selected+volatile+organic+compounds+in+healthy+volunteers.">Blood and breath levels of selected volatile organic compounds in healthy volunteers.</a> Analyst. 138 (7), 2134-2145 (2013).</li><li>Mochalski, P., Wzorek, B., Sliwka, I., Amann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitability+of+different+polymer+bags+for+storage+of+volatile+sulphur+compounds+relevant+to+breath+analysis.">Suitability of different polymer bags for storage of volatile sulphur compounds relevant to breath analysis.</a> Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (3), 189-196 (2009).</li><li>Mochalski, P., King, J., Unterkofler, K., Amann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+selected+volatile+breath+constituents+in+Tedlar,+Kynar+and+Flexfilm+sampling+bags.">Stability of selected volatile breath constituents in Tedlar, Kynar and Flexfilm sampling bags.</a> Analyst. 138 (5), 1405-1418 (2013).</li><li>Schaber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breathprinting+reveals+malaria-associated+biomarkers+and+mosquito+attractants.">Breathprinting reveals malaria-associated biomarkers and mosquito attractants.</a> Journal of Infectious Diseases. 217 (10), 1553-1560 (2018).</li><li>Herbig, J., Beauchamp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+in+the+analysis+of+breath+gas+volatiles.">Towards standardization in the analysis of breath gas volatiles.</a> Journal of Breath Research. 8 (3), (2014).</li><li>Phillips, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+volatile+organic+compounds+in+the+breath+of+normal+humans.">Variation in volatile organic compounds in the breath of normal humans.</a> Journal of Chromatography B. 729 (1-2), 75-88 (1999).</li><li>Eckel, S. P., Baumbach, J., Hauschild, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+importance+of+statistics+in+breath+analysis-hope+or+curse?.">On the importance of statistics in breath analysis-hope or curse?.</a> Journal of Breath Research. 8 (1), (2014).</li></ol>

A pesar de progresos considerables en la investigación de la respiración durante la última década, las prácticas estándares para el muestreo y análisis de volátiles del gas de respiración siendo indefinido10. La razón principal de esta falta de estandarización ha sido la diversidad de métodos de recolección de la respiración, que tienen impacto directo sobre la diversidad química resultante en cualquier muestra dada respiración exhalada. Aliento exhalado contiene una amplia gama de...

Biomarcadores pueden producir información valiosa sobre los procesos biológicos normales y patológicos que pueden contribuir a la enfermedad clínicamente identificable. Recientemente, ha habido interés creciente en la evaluación de volátiles de respiración como biomarcadores para una variedad de Estados de enfermedad, incluyendo infecciones, enfermedades metabólicas y cáncer 1. Espirado contiene niveles cuantificables de compuestos orgánicos volátiles (COV), compuestos orgánicos semivolátiles y microbios derivada material (por ejemplo, los ácidos nucleicos de las bacterias y virus). El objetivo central del análisis del aire espirado es profundizar en el estado de una condición médica o exposiciones ambientales en forma no invasiva. Existen varios métodos para recolectar y analizar el aire espirado, dependiendo de los componentes de interés. Actualmente no existe ningún método de colección de respiración exhalada estandarizados, que complica el análisis comparativo de resultados entre los estudios. Estandarización de procedimientos de recopilación de la respiración es esencial, como el procedimiento de muestreo sí mismo tiene un efecto considerable sobre los resultados posteriores de análisis de aliento.
En muchos estudios, muestras respiratorias respiración finales son empleada2,3. Este muestreo consiste en descartar la parte inicial del aire espirado ("espacio muerto"), con el fin de captar preferentemente el aire al final del ciclo de respiración. La ventaja de esta estrategia es que reduce los niveles de VOC exógeno (por ejemplo, COV ambiental), enriqueciendo para compuestos orgánicos volátiles endógenos, específico para cada paciente. Este método excluye a los primeros segundos de exhalación de un individuo antes de tomar la muestra de aliento. Otros investigadores han utilizado un sensor de presión para activar el muestreo durante la fase de predefinidos de vencimiento4,5. Porque los sensores de presión requieren compleja ingeniería, este método alternativo requiere un dispositivo de muestreo dedicado y relativamente costosos.
Muestreo de respiración pediátrica puede ser particularmente difícil. Una preocupación fundamental es que los niños pequeños no puede cooperar con protocolos para la espiración voluntaria del aire de "dead space". Por esta razón, es más fácil obtener mezcla respiratoria respiración de los niños. Sin embargo, una advertencia importante con muestras mixtas respiración respiratoria es el riesgo de contaminación ambiental y material. Por lo tanto, la viabilidad de colección pediátrica es una preocupación de conducción en el campo.
Además de los métodos de recopilación, almacenamiento de muestras de aliento también puede influir la calidad de la muestra. La humedad alta en aire exhalado y las concentraciones bajas (partes por billón) de respiración orgánicos volátiles compuestos hacen muestras de aliento especialmente susceptibles a problemas relacionados con el almacenamiento6,7. A pesar del gran potencial de técnicas en tiempo real como protón transferencia reacción espectrometría de masas (PTR-MS), GC-MS sigue siendo el gold standard para el análisis de muestras de aliento. Análisis por GC-MS de muestras de aliento es una técnica fuera de línea, es junto con métodos de preconcentración como tubos de desorción térmica (TD), micro-extracción en fase sólida y dispositivos de la trampa de la aguja. Antes de la concentración, las muestras de aliento necesitan almacenarse temporalmente en polímero bolsas8. Bolsas de polímero son populares debido a su precio moderado, relativamente buena durabilidad y reutilización. Mientras que las bolsas se pueden reutilizar, tiempo y esfuerzo se requieren para asegurar la eficiente limpieza de7,8. Cada tipo de bolsa específica también requiere procedimientos empíricamente determinados y estandarizados de control de calidad, reutilización y recuperación.
Tubos de TD son ampliamente utilizados para la concentración la respiración porque captura a una gran cantidad de volátiles y se pueden personalizar. Los materiales absorbentes usados para embalar tubos de TD se pueden adaptados a aplicaciones particulares y objetivo particular volátiles de interés. Tubos de TD substancialmente mejorar la comodidad de los estudios de biomarcadores de la respiración, especialmente en sitios remotos, porque TD tubos con seguridad tienda volátiles de la respiración durante al menos dos semanas y son fáciles de transporte3.
En un esfuerzo por estandarizar la colección respiración pediátrica para el descubrimiento de biomarcadores, aquí describimos un método simple para recoger el aliento de los niños pequeños. Para ilustrar los resultados representativos de los protocolos implementados, se presentan datos desidentificados de una cohorte en curso de niños (8-17 años) sometidos a evaluación para la enfermedad sin alcohol ácido graso hígado (EHGNA). Resultados y análisis de este estudio serán denunciados en una posterior publicación. En este trabajo se presenta un subconjunto de datos para demostrar la aplicación de nuestro protocolo. En Resumen, los niños sean instruídos que exhale normalmente a través de la boquilla en una bolsa de polímero, como si "sopla un globo". El proceso se repite 2 a 4 veces hasta que se recogió 1 L de aire. La muestra es entonces transferida a un tubo de TD y almacenada a 5 ° C antes del análisis por GC-MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1303px;" width="1301">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:243px;">Breath bag&#160;</td>
			<td style="width:171px;">SKC</td>
			<td style="width:119px;">237-03</td>
			<td style="width:771px;">These are 3 L bags</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cardboard mouthpiece&#160;</td>
			<td style="width:171px;">A-M systems</td>
			<td style="width:119px;">161902</td>
			<td>0.86&#34; OD, 2.00&#34; L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Large diameter tubing</td>
			<td style="width:171px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:119px;">95802-11</td>
			<td>Silicone Tubing, 1/4&#34;ID x 5/16&#34;OD,</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long-term storage caps&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Markes International</td>
			<td>C-CF010</td>
			<td>Brass storage cap &#188;&#34; &#38; PTFE ferrule, pk 10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Male adapter</td>
			<td style="width:171px;">Charlotte Pipe</td>
			<td style="width:119px;">2109</td>
			<td>Part 1/3 of breath connector (1/2&#34; Universal part No. 436-005)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Male adapter (made from Teflon)</td>
			<td style="width:171px;">In-house built</td>
			<td></td>
			<td>Part 3/3 of breath connector (1/4&#34; ID x 1/2&#34; MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pump</td>
			<td style="width:171px;">SKC</td>
			<td>220-1000TC-C</td>
			<td>Pocket PumpTouch with Charger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small diameter tubing&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Supelco</td>
			<td style="width:119px;">20533</td>
			<td style="width:771px;">Teflon tubing&#160; L &#215; O.D. &#215; I.D. 25 ft &#215; 1/4 in. (6.35 mm) &#215; 0.228 in. (5.8 mm)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermal desorption tubes&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Markes International</td>
			<td style="width:119px;">C2-CAXX-5314</td>
			<td>Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube capping/uncapping tool</td>
			<td style="width:171px;">Markes International</td>
			<td>C-CPLOK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Two-way ball valve connector&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Homewerks Worldwide</td>
			<td style="width:119px;">VBV-P40-E3B</td>
			<td>Part 2/3 of breath connector (1/2&#34;)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

breath collection from children for disease biomarker discovery

Análisis y colección de respiración pueden utilizarse para descubrir biomarcadores volátiles en un número de enfermedades infecciosas y no infecciosas, como la malaria, tuberculosis, cáncer de pulmón y enfermedad hepática. Este protocolo describe un método reproducible para el muestreo de aliento en los niños y luego estabilizar las muestras de aliento para su posterior análisis con cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS). El objetivo de este método es establecer un protocolo estandarizado para la adquisición de muestras de aliento para su posterior análisis químico, de los niños de 4 a 15 años de edad. En primer lugar, se muestrea respiración usando una boquilla de cartón unida a una válvula de 2 vías, que está conectada a una bolsa de 3 L. Analitos de respiración se transfirió a un tubo de desorción térmica y almacenados a 4-5 ° C hasta su análisis. Esta técnica se ha utilizado previamente para capturar el aliento de los niños con malaria para la identificación de biomarcadores de respiración exitosa. Posteriormente, hemos aplicado con éxito esta técnica a las cohortes pediátricas adicionales. La ventaja de este método es que requiere mínima cooperación por parte del paciente (de valor particular en población pediátrica), tiene un período corto de la colección, no requiere de personal capacitado y se puede realizar con equipos portátiles en configuración del campo de recursos limitados.

En nuestro estudio, respiración se colectaron muestras de 10 niños (8-17 años) sometidos a evaluación en el Hospital infantil de St. Louis. Las muestras de aliento y muestras de aire ambiente (n = 10) fueron recogidos como se describió anteriormente. Muestras fueron analizadas mediante cromatografía de gases cuadrupolo tiempo de vuelo espectrometría de masas (GC-MS-QToF) y desorción térmica, como se describió previamente9. Después de la eliminac...

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Breath Collection from Children for Disease Biomarker Discovery

Colección de aliento de los niños para el descubrimiento de biomarcadores de la enfermedad

Este protocolo describe un método simple para la adquisición de muestras de aliento de los niños. Brevemente, las muestras de aire mezclado previamente se concentran en tubos absorbentes antes del análisis de cromatografía de gases-espectrometría de masas. Biomarcadores de la respiración de las enfermedades infecciosas y no infecciosas pueden identificarse mediante este método de colección de la respiración.

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, ...

Un método estandarizado de recolección de aliento en niños podría utilizarse para responder preguntas clave sobre el estado de las condiciones médicas pediátricas de manera no invasiva y para comparar los resultados entre estudios. La principal ventaja de esta técnica es que permite la recogida de muestras de aliento de niños de una manera sencilla, no invasiva y reproducible. Las implicaciones de estas técnicas se extienden al diagnóstico de una amplia gama de estados de la enfermedad, incluyendo infecciones, trastornos metabólicos y cáncer y para pruebas de punto de atención para uso clínico.La instrucción visual es muy útil porque hay muchas partes en nuestro equipo de recolección de aliento y porque la configuración del equipo puede ser complicada. Para ensamblar el equipo de muestra de aliento, conecte una boquilla de cartón al tomamuestras de aliento y conecte una longitud corta de tubo de gran diámetro al otro extremo del tomamuestras. Fije el conector de respiración a la válvula de la bolsa a través del tubo.Gire el tornillo de pulgar moleteado en el lado del accesorio de entrada en sentido antihorario para desbloquear la válvula en la posición abierta y empuje el vástago de la válvula de la bolsa hacia abajo para abrir el accesorio de entrada para el muestreo. Gire el tornillo del pulgar moleteado en el lado del accesorio de entrada en el sentido de las agujas del reloj para bloquear la válvula abierta y confirme que la válvula azul del muestreador de aliento está abierta y paralela al conector. A continuación, escriba la identificación del paciente, la fecha y la hora en la etiqueta de la bolsa de polímero.Antes de iniciar la recolección de la respiración, utilice un muestreador de aliento sin una bolsa para demostrar la exhalación de la respiración al paciente. Explique que el paciente debe respirar como lo haría al volar un globo y continuar respirando tan lejos como pueda cómodamente. Proporcione al paciente el muestreador de aliento etiquetado y pida al paciente que exhale en la bolsa como en la demostración.Cierre la válvula azul del dispositivo de toma de muestras de aliento tan pronto como el paciente haya terminado de respirar y después de esperar al menos 30 segundos entre las colecciones haga que el paciente repita la exhalación hasta que se haya recogido al menos un litro de aliento. Observe en la etiqueta de la bolsa cuántas respiraciones se recogieron del paciente y gire el tornillo del pulgar moleteado en el lado del accesorio de entrada en sentido antihorario para empujar el vástago de la válvula hacia arriba para cerrar el accesorio de entrada. A continuación, gire el tornillo de pulgar moleteado en el lado del accesorio de entrada en el sentido de las agujas del reloj para bloquear la válvula cerrada y desenganche la bolsa del muestreador de aliento.Inmediatamente después de recoger la muestra de aliento, coloque una nueva bolsa de muestra en un puerto de salida de la bomba. Y empuje el vástago de la válvula de la bolsa hacia abajo para abrir el accesorio de entrada para el muestreo. Gire el tornillo de pulgar moleteado en el lado del accesorio de entrada en el sentido de las agujas del reloj para bloquear la válvula abierta y ajuste la bomba para que funcione a 100 mililitros por minuto durante 12 minutos.La bomba recogerá 1.200 mililitros de aire ambiente. Al final de la colección de aire ambiente, gire el tornillo del pulgar moleteado en el lado del accesorio de entrada en sentido contrario a las agujas del reloj y empuje el vástago de la válvula hacia arriba para cerrar el accesorio de entrada. A continuación, gire el tornillo del pulgar moleteado en el lado del accesorio de entrada en el sentido de las agujas del reloj para bloquear la válvula cerrada y desenganche la bolsa de la bomba.Para transferir la muestra de aliento o aire ambiente a un tubo de desorción térmica dentro de una hora de recolección, retire el tubo del refrigerador y utilice el tubo de tapado del fabricante para retirar las tapas de almacenamiento a largo plazo del tubo de sorbente. Utilice el tubo para fijar el extremo ranurado del tubo a la bolsa e inserte el otro extremo del tubo de desorción térmica en un pedazo de tubo conectado a una bomba. Ajuste la bomba para que funcione a 100 mililitros por minuto durante 10 minutos.Gire el tornillo del pulgar moleteado en el lado del accesorio de entrada en sentido antihorario para abrir la válvula y empuje el vástago de la válvula hacia abajo para abrir el accesorio de entrada antes de iniciar la bomba. Después de 10 minutos, la bomba se detendrá. Retire el tubo de sorbente de desorción térmica, apriete las tapas en ambos extremos y guarde el tubo de sorbente en el refrigerador hasta el análisis.En este estudio representativo de muestras de aire ambiente y aliento de 10 niños sometidos a evaluación en el Hospital Infantil St.Louis, se encontraron compuestos orgánicos o COV significativamente más volátiles en promedio en las muestras de aliento en comparación con las muestras de control ambiental ambiental. El aumento del número de COV en la respiración en comparación con el aire ambiente se puede distinguir visiblemente comparando los cromatogramas iónicos totales representativos en cada muestra. Como medida de control de calidad de la colección de respiración exitosa, los niveles de dos VOC de aliento común se compararon con los controles de aire de la habitación.El isopreno, uno de los COV más abundantes en la respiración, se midió en una concentración diez veces mayor en muestras de aliento pediátricas que en los controles de aire de la habitación. Mientras que el beta-pineno, que se encuentra típicamente en los niveles de subpartes por mil millones exhibió una abundancia de aliento tres veces mayor que el aire que confirma el éxito de la colección de respiración. Es importante transferir la muestra de aliento a los tubos sorbentes dentro de una hora de la colección de respiración y tener en cuenta la orientación del tubo durante la transferencia.Después de este procedimiento, los investigadores pueden querer seguir estudios en modelos animales para responder preguntas adicionales sobre la audiencia de compuestos volátiles respiratorios.

Research

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