Name: generation, amplification, and titration of recombinant respiratory syncytial viruses
Uploaded: 2019-04-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses at JoVE.com

Forfatterne takke Dr. Qin Yu fra AstraZeneca R & D Boston, MA, USA, for at give AZD4316 stoffet. Forfatterne er taknemmelig for, at Cymages platform for adgang til ScanR Olympus mikroskop, som blev støttet af tilskud fra regionen Ile-de-France (DIM ONE HEALTH). Forfatterne anerkender støtte fra INSERM og Versailles Saint-Quentin Universitet.

1. materielle forberedelse
<ol><li>Købe celle medier (nedsat serum medier, minimum essential medier [MEM], 10 x MEM og Dulbecco ændrede Eagle's medium [DMEM]), Transfektion reagens, og mikrokrystallinsk cellulose (Se Tabel af materialer).</li>
	<li>Opnå de følgende vektorer for omvendt Genetik: genomisk vector(s) og udtryk vektorer kodning N protein og polymerase komplekse proteiner. Genomisk vektorerne indeholder fuld cDNA genomet af RSV-normal god landbrugspraksis (p-RSV-NGL) og af RSV-M2-1GFP (p...

<ol>
	<li>Shi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+disease+burden+estimates+of+acute+lower+respiratory+infections+due+to+respiratory+syncytial+virus+in+young+children+in+2015:+a+systematic+review+and+modelling+study.">Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study.</a> The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).</li><li>Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+Syncytial+Virus+Infection+in+Elderly+and+High-Risk+Adults.">Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults.</a> The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).</li><li>DeVincenzo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+Oral+ALS-008176+in+a+Respiratory+Syncytial+Virus+Challenge+Study.">Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).</li><li>DeVincenzo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+GS-5806+Activity+in+a+Respiratory+Syncytial+Virus+Challenge+Study.">Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).</li><li>Afonso, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales:+update+2016.">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016.</a> Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).</li><li>Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+elongation+factor+of+respiratory+syncytial+virus,+a+nonsegmented+negative-strand+RNA+virus.">Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+bodies+are+a+site+of+ebolavirus+replication.">Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication.</a> Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).</li><li>Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+expression+redirects+vesicular+stomatitis+virus+RNA+synthesis+to+cytoplasmic+inclusions.">Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions.</a> PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958 (2010).</li><li>Lahaye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Characterization+of+Negri+Bodies+(NBs)+in+Rabies+Virus-Infected+Cells:+Evidence+that+NBs+Are+Sites+of+Viral+Transcription+and+Replication.">Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication.</a> Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).</li><li>Kolesnikova, L., M&#252;hlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+organization+of+recombinant+Marburg+virus+nucleoprotein:+comparison+with+Marburg+virus+inclusions.">Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions.</a> Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).</li><li>Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marburg+virus+inclusions:+A+virus-induced+microcompartment+and+interface+to+multivesicular+bodies+and+the+late+endosomal+compartment.">Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment.</a> European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).</li><li>Rincheval, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+cytoplasmic+inclusion+bodies+in+cells+infected+by+respiratory+syncytial+virus.">Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus.</a> Nature Communications. 8 (1), 563 (2017).</li><li>Santangelo, P. J., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+filamentous+viral+RNPs+prior+to+egress.">Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).</li><li>Lifland, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Nucleoprotein+and+Inclusion+Bodies+Antagonize+the+Innate+Immune+Response+Mediated+by+MDA5+and+MAVS.">Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS.</a> Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).</li><li>Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+inclusions+of+respiratory+syncytial+virus-infected+cells:+formation+of+inclusion+bodies+in+transfected+cells+that+coexpress+the+nucleoprotein,+the+phosphoprotein,+and+the+22K+protein.">Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein.</a> Virology. 195 (1), 243-247 (1993).</li><li>Brown, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+association+between+heat+shock+protein+70+and+the+respiratory+syncytial+virus+polymerase+complex+within+lipid-raft+membranes+during+virus+infection.">Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection.</a> Virology. 338 (1), 69-80 (2005).</li><li>Radhakrishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+analysis+of+purified+respiratory+syncytial+virus+particles+reveals+an+important+role+for+heat+shock+protein+90+in+virus+particle+assembly.">Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).</li><li>Racaniello, V. R., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloned+poliovirus+complementary+DNA+is+infectious+in+mammalian+cells.">Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells.</a> Science. 214 (4523), 916-919 (1981).</li><li>Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+rabies+viruses+from+cloned+cDNA.">Infectious rabies viruses from cloned cDNA.</a> The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).</li><li>Collins, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+infectious+human+respiratory+syncytial+virus+from+cloned+cDNA+confirms+an+essential+role+for+the+transcription+elongation+factor+from+the+5'+proximal+open+reading+frame+of+the+M2+mRNA+in+gene+expression+and+provides+a+capability+for+vaccine.">Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).</li><li>Rameix-Welti, M. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+replication+of+respiratory+syncytial+virus+in+cells+and+in+living+mice.">Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice.</a> Nature Communications. 5, 5104 (2014).</li><li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+(BRSV)+from+cDNA:+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture,+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter.">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).</li><li>Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+activity+and+molecular+mechanism+of+an+orally+active+respiratory+syncytial+virus+fusion+inhibitor.">Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).</li><li>Derscheid, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+respiratory+syncytial+virus+memphis+37+grown+in+HEp-2+cells+causes+more+severe+disease+in+lambs+than+virus+grown+in+vero+cells.">Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells.</a> Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).</li><li>McKimm-Breschkin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+plaque+assay+for+respiratory+syncytial+virus+-+direct+visualization+of+plaques+without+immunostaining.">A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus - direct visualization of plaques without immunostaining.</a> Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virology Journal. 7, 1-7 (2006).</li><li>Novina, C. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNAi+revolution.">The RNAi revolution.</a> Nature. 430 (6996), 161-164 (2004).</li><li>Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+inosine+5'-monophosphate+dehydrogenase+and+the+design+of+novel+inhibitors.">The structure of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors.</a> Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).</li><li>Beaucourt, S., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribavirin:+A+drug+active+against+many+viruses+with+multiple+effects+on+virus+replication+and+propagation.+Molecular+basis+of+ribavirin+resistance.">Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance.</a> Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).</li><li>Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Ribavirin+on+Respiratory+Syncytial+Virus+in+vitro.">Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).</li><li>Sim&#245;es, E. A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past,+Present+and+Future+Approaches+to+the+Prevention+and+Treatment+of+Respiratory+Syncytial+Virus+Infection+in+Children.">Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children.</a> Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).</li><li>Alvarez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-mediated+silencing+of+the+respiratory+syncytial+virus+nucleocapsid+defines+a+potent+antiviral+strategy.">RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).</li><li>DeVincenzo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+double-blind,+placebo-comtrolled+study+of+an+RNAi-based+therapy+directed+against+respiratory+syncytial+virus.">A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+a+CRISPR/Cas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells.">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).</li><li>Nikolic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negri+bodies+are+viral+factories+with+properties+of+liquid+organelles.">Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles.</a> Nature Communications. 8 (1), 58 (2017).</li></ol>

Her vil vi præsentere en metode til redning af rekombinante RSVs fra fem plasmider og deres forstærkning. Evnen til at manipulere genomet af virus har revolutioneret virologi forskning for at teste mutationer og udtrykke en yderligere gen eller en mærket virale proteiner. RSV har vi beskrevet og brugt som et eksempel i denne artikel er en virus, der udtrykker en reporter gen, RSV-normal god landbrugspraksis (upubliceret) og udtrykker en M2-1 protein smeltet til en normal god landbrugspraksis tag12</s...

Menneskelige RSV er den hyppigste årsag til indlæggelse for akut luftvejsinfektion i spædbørn verdensomspændende1. Derudover er RSV forbundet med en betydelig sygdomsbyrden i voksne sammenlignes med influenza, med de fleste af indlæggelse og dødelighed byrde i den ældre2. Der findes ingen vacciner eller specifikke antivirale endnu mod RSV, men lovende nye lægemidler er i udvikling af3,4. Kompleksiteten og tyngde i teknikker til kvantificering af RSV multiplikation hæmmer søgningen for antivirale lægemidler eller vacciner trods aktuelle betydelige bestræbelser. Kvantificering af RSV multiplikation in vitro-er generelt baseret på omstændelig, tidskrævende og dyre metoder, der består for det meste i analysen af den cytopatisk effekt af mikroskopi, immunfarvning, plaque reduktion assays, kvantitative reverse transkriptase (qRT)-polymerase kædereaktion (PCR) og enzym-forbundet immunosorbent assay tests. Vira med modificerede genomer og udtrykke reporter gener, som koder for normal god landbrugspraksis, er mere velegnede til sådanne screeninger. Koblet til brug af automatiserede plade læsere, kan reporter gen-regnskabsmæssige rekombinant vira gøre disse assays mere egnet til standardisering og høj overførselshastighed.
RSV er et kappebærende, nonsegmented negative-følelse RNA-virus, som tilhører Orthopneumovirus -slægten af Pneumoviridae familie, orden Mononegavirales5. RSV genom er en enkelt-strenget, negative-følelse RNA omkring 15 KB, som indeholder en noncoding region i 3' og 5' yderpunkterne kaldet leder og Trailer og 10 transcriptional enheder kodning 11 proteiner. Generne, der er bestilt som følger: 3'-NS1, NS2, Nielsen, Pedersen, M, SH, G, F, M2 (kodning for M2-1 og M2-2 proteiner) og L-5'. Genomisk RNA er tæt pakket af nucleoprotein N. Brug encapsidated genomisk RNA som skabelon, viral RNA-afhængige RNA polymerase (RdRp) vil sikre transskription og replikering af viral RNA. Viral RdRp er sammensat af de store protein L, der bærer nukleotid polymerase aktivitet i sig selv, sin obligatoriske cofaktor phosphoprotein Pedersen og M2-1 protein, der fungerer som en viral transskription faktor6. I inficerede celler og inducerer RSV dannelse af cytoplasmatisk indeslutninger kaldet optagelse organer (IBs). Morfologisk tilsvarende cytoplasmatisk indeslutninger er blevet observeret for flere Mononegavirales7,8,9,10. De seneste undersøgelser af rabiesvirus, vesikulær stomatitis-virus (VSV), Ebola-virus og RSV viste at viral RNA syntese forekommer i IBs, som kan således betragtes som viral fabrikker8,9,11, 12. virus fabrikker koncentrere RNA og virale proteiner kræves til viral RNA syntese og også indeholde cellulære proteiner13,14,15,16, 17. IBs udviser en funktionel subcompartment kaldet IB-associerede granulat (IBAGs), som koncentrerer de nyligt synthetized spirende viral mRNA sammen med M2-1-protein. Genomisk RNA og L, P og N registreres ikke i IBAGs. IBAGs er små dynamiske sfæriske strukturer inde i IBs, der udviser egenskaber af flydende organeller12. Trods den centrale rolle på IBs i viral multiplikation, er meget lidt kendt om naturen, interne struktur, dannelsen og drift af disse viral fabrikker.
Udtryk af genomet af et poliovirus fra en cDNA aktiveret produktionen af den første smitsomme viral klon i 198118. For enkelt-strenget negative RNA-vira var det ikke indtil 1994, produktion af en første rabiesvirus efter Transfektion af plasmider i celler19 fandt sted. Den første plasmid-baserede omvendt genetiske system for RSV blev udgivet i 199520. Omvendt genetik har ført til store fremskridt inden for virologi. Mulighed for at indføre specifikke ændringer i det virale genom har givet kritisk indsigt i replikation og patogenese af RNA-vira. Denne teknologi har også i høj grad fremmet udviklingen af vacciner ved at tillade særlige dæmpning gennem målrettet række ændringer. Genom ændringer tillader en hurtig kvantificering af viral formering stærkt forbedret antiviral screening og undersøgelse af deres virkemåde.
Selvom tidligere beskrevet, forbliver at opnå genetisk modificerede RSVs delikat. Vi detalje her, en protokol til at oprette to typer af rekombinante HRSV, henholdsvis udtrykke RSV-normal god landbrugspraksis eller RSV-M2-1-normal god landbrugspraksis. I denne protokol beskriver vi Transfektion forudsætninger for at redde de nye rekombinante vira, samt deres forstærkning at opnå viral bestande med høj titer, velegnet til reproducerbare eksperimenter. Opførelsen af den omvendte genetik vektorer er i sig selv ikke beskrevet her. Vi beskrive metoder for optimal høst og indefrysning af viral bestande. Den mest nøjagtige metode til kvantificering af viral smitsomme partikler forbliver plaque assay. Celler er inficeret med serielle fortyndinger af de analyserede suspension og inkuberes med en overlejring, der forbyder udbredelse af frie viruspartikler i supernatanten. I sådanne forhold, vil virussen kun inficere sammenhængende celler danner en "plaque" for hver indledende smittefarlige partikel. I den konventionelle RSV titrering assay, er plaques afsløret ved immunfarvning og regnes under mikroskopisk observation. Denne metode er dyrt og tidskrævende. Her beskrev vi, en meget enkel protokol for en RSV plaque analyse ved hjælp af mikrokrystallinsk cellulose overlay, der giver mulighed for dannelse af plaques synlige for det blotte øje. Vi viser, hvordan RSV-normal god landbrugspraksis kan bruges til foranstaltning RSV replikering og således, at kvantificere effekten af antivirale lægemidler. Ved at kombinere omvendt genetik og live imaging-teknologi, demonstrere vi hvordan RSV-M2-1-NGL giver forskerne til at visualisere M2-1 i levende celler og følge dynamikken i intracellulære viral strukturer, såsom IBs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm &#181; dish for live cell imaging</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel RC-591</td>
			<td>FMC BioPolymer</td>
			<td>Avicel RC-591</td>
			<td>Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSRT7/5</td>
			<td></td>
			<td>not commercially available</td>
			<td>See ref 22. Buchholz et al, 1999</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT90132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for observations</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73 Olympus microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for videomicroscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>ScanR Olympus microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEp-2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (10X), no glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11430030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41090-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 ReagentPlus, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td>not commercially available</td>
			<td>see ref 21. Rameix-Welti et al, 2014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>See Saw Rocker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA GAPDH</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus siRNA 
			D-001810-10-05</td>
			<td>SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA IMPDH2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human 
			L-004330-00-0005</td>
			<td>SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. 
			Individual references and sequences 
			J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; 
			J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; 
			J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; 
			J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA RSV N</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus custom siRNA</td>
			<td>UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiRNA NT</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiRNA transfection reagent</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03</td>
			<td>Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate 7.5% solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Tecan infinite M200PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, amplification, and titration of recombinant respiratory syncytial viruses

Brugen af rekombinant vira er blevet afgørende i grundlæggende eller anvendt virologi. Omvendt genetik har vist sig for at være en meget kraftfuld teknologi, både til at dechifrere virusreplikation mekanismer og til at studere antivirale lægemidler eller skabe udviklingsplatform for vacciner. Konstruktion og manipulation af en reverse genetiske system for en negativ-strenget RNA-virus, såsom en respiratorisk syncytialvirus (RSV), dog stadig er delikat og kræver særlig knowhow. RSV genom er en enkelt-strenget, negative-følelse RNA omkring 15 KB, der fungerer som en skabelon for både viral RNA replikering og transskription. Vores omvendte genetik systemet bruger en cDNA kopi af det menneskelige RSV lange stamme genom (HRSV). Denne cDNA samt cDNAs kodning virale proteiner af komplekse polymerase (L, P, N og M2-1), er placeret i individuelle udtryk vektorer under T7 polymerase styringsforløb. Transfektion af disse elementer i BSR-T7/5 celler, som stabilt express T7 polymerase, tillader cytoplasmatisk replikering og transskription af af rekombinante RSV, giver anledning til genetisk modificerede virioner. En ny RSV, som er til stede på cellens overflade og i cellekultur supernatant BSRT7/5, er samlet for at inficere menneskelige HEp-2 celler for viral forstærkning. To eller tre runder af forstærkning er nødvendig for at opnå viral bestande indeholdende 1 x 106 til 1 x 107 plaquedannelse enheder (PFU) / mL. Metoder for den optimale høst, frysning og titrering af viral bestande er beskrevet her i detaljer. Vi illustrerer den protokol, der er præsenteret her ved at oprette to rekombinant vira henholdsvis udtrykke gratis grøn fluorescerende proteiner (NGL) (RSV-NGL) eller viral M2-1 smeltet til normal god landbrugspraksis (RSV-M2-1-NGL). Vi viser hvordan RSV-NGL til at kvantificere RSV replikering og RSV-M2-1-NGL at visualisere viral strukturer samt viral protein dynamics i levende celler, ved hjælp af video mikroskopi-teknikker.

I dette arbejde beskrev vi en detaljeret protokol for at producere rekombinant RSV vira at udtrykke en fluorescerende proteiner (figur 2). I pRSV-normal god landbrugspraksis, blev normal god landbrugspraksis genet introduceret mellem P og M gener, som beskrevet for kirsebær genet i tidligere udgivne arbejde21. I pRSV-M2-1-NGL, M2 gen var urørt og en yderligere genet koder for M2-1-normal god landbrugspraksis var indsat mellem SH og G...

Watch this Scientific Journal Video about Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses at JoVE.com

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Vi beskriver en metode til at generere og forstærke genetisk modificerede respiratorisk syncytial virus (RSVs) og en optimeret plaque assay for RSVs. Vi illustrere denne protokol ved at oprette to rekombinant vira, der henholdsvis giver mulighed for kvantificering af RSV replikering og live analyse af RSV integrering organer og inklusion organer-associerede granulat dynamik.

Generation, forstærkning og titrering af rekombinant respiratorisk Syncytial virus

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Brugen af rekombinant virus er en kraftfuld teknologi både til at dechifrere den virale replikation mekanismer og til at give udvikling platforme for vacciner. Ligeledes er generering af viral bestand af god kvalitet afgørende for hver viral undersøgelse fra den mest grundlæggende forskning til de anvendte undersøgelser. Redning af rekombinant virus, optimal høst, frysning og titrering af RSV-bestande er kritiske metoder til alle virologiske undersøgelser.De kan betragtes som traditionelle, men forbliver følsomme og kræver særlig ekspertise. Dagen før transfektion suspenderes BSR-T7/5 celler i komplet medium ved 0,5 millioner celler pr. milliliterkoncentration. Fordel to milliliter af celleaffjedringen pr. brønd i en seks-brøndplade.Inkuber pladen ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid, indtil de når 80-90% sammenløb den næste dag. For at redde hver virus, først blande optøet reverse genetik vektorer i et rør, derefter gå videre til transfektion, efter transfektion reagens producentens protokol. Dernæst tilsættes 250 mikroliter af det reducerede serummedium til de blandede vektorer.I et andet rør fortyndes 10 mikroliter af dette transinfektionsreageser i 250 mikroliter af det reducerede serummedium. Forsigtigt vortex begge rør og vente i fem minutter. Bland indholdet af begge rør og vent i 20 minutter ved stuetemperatur.I mellemtiden skylles BSR-T7/5 cellerne med en milliliter af det reducerede serummedium og distribueres 1,5 milliliter minimum af essentielle mediebiotikumfrit suppleret med 10 % føtal kalveserum pr. brønd. Hvis det er nødvendigt, inkubere ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid miljø. Efter 20-minutters inkubation, tilsæt 500 mikroliter af transfektion mix i hver brønd.Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid miljø i tre dage. For at overvåge redningseffektiviteten observere ved GFP fluorescens under et omvendt fluorescensmikroskop ved 20X forstørrelse én gang om dagen. På den tredje dag i transfektion, ridse celler i hver brønd af den transficerede BSR-T7/5 seks-brønd plade.Overfør celler og supernatant af hver brønd i et sterilt to milliliter mikrocentrifugerør. For at frigøre den reddede virus fra cellemembranerne, vortex hvert rør kraftigt i mindst 30 sekunder. For den første forstærkning af de reddede vira, først fjerne kulturmediet fra HEp-2 plade seedet dagen før, derefter hurtigt tilføje 500 mikroliter pr brønd af den friske passage-nul viral suspension.Placer HEp-2 plade ved 37 grader Celsius på en vippe rocker for blød omrøring i to timer. For at producere den første passage af de reddede vira skal du kassere 500 mikroliter af inokulummen og tilføje to milliliter MEM med 2% FCS. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid i tre dage.For at overvåge infektionen under et omvendt fluorescensmikroskop ved 20X-forstørrelse skal GFP fluorescens af HEp-2-cellerne, der er inficeret med passage-nul suspensionen én gang om dagen, observeres. Under et brightfield mikroskop observere udseendet af små syncytia og celle udstationering, som afspejler RSV cytopatiske effekt. For at forstærke de reddede vira fortyndes først den virale suspension af FCS-fri MEM for at opnå en 3-milliliter suspension ved 50.000 PFU pr. milliliter, og fjern derefter mediet fra HEp-2-kolben.Tilsæt hurtigt den tre milliliter viral suspension og inkubere kolben ved 37 grader Celsius på en vippe rocker for blød omrøring i to timer. Derefter fjernes og kasseres inokulumet, og der tilsættes 15 milliliter MEM med 2 %FCS. Inkubere ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid i to til fire dage.For at vurdere det rigtige tidspunkt til at høste virus, kontrollere celle morfologi og GFP fluorescens under en omvendt fluorescens mikroskop ved 20X forstørrelse. Bemærk, at dette normalt er, når 50% til 80% af HEp-2 cellelaget er løsrevet på grund af RSV cytopatisk effekt, der opstår mellem 48 og 72 timer efter infektion. Næste skrabe alle celler ved hjælp af en celle skraber.Saml både cellerne og supernatanten sammen og overfør dem til et 50-milliliter centrifugerør. Der tilsættes 1/10 af mængden af 10X RSV-bevaringsløsningen. Vortex rørene kraftigt i fem sekunder og centrifuge i fem minutter ved 200 gange g for at afklare suspensionen.Overfør supernatanten til et 50-milliliterrør. Vortex kort og aliquot suspensionen i kryogenrør mærket med alkohol-resistente tags. Sænk røret i forkølet, minus 80 grader-Celsius alkohol i mindst en time og opbevar dem på minus 80 grader Celsius.For at udføre en plaque titrering assay, først gøre 2X minimum væsentlige medium ved at fortynde kommercielle 10X MEM med sterilt vand og tilføje L-glutamin, 1, 000 enheder pr milliliter penicillin, og en milligram per milliliter streptomycin. Ryst fortyndingen kraftigt og opbevar den ved fire grader Celsius, og tilsæt derefter 900 mikroliter af den FCS-frie MEM til seks rør. Tø virus aliquots og vortex dem kraftigt i fem sekunder.For at gøre serielle fortyndinger, først tilføje 100 mikroliter af virus til 900 mikroliter af mediet i det første rør. Sæt hætten på røret og bland dens indhold ved vortexing i et par sekunder, tilsæt derefter 100 mikroliter af den første fortynding til 900 mikroliter af mediet i det andet rør. Sæt hætten på røret og vortex.Gentag denne procedure, indtil det sjette rør. Skriv virus navn og den fulde fortyndinger på HEp-2 12-brønd plader. Tilføj et mærke, der passer til pladen og dens dæksel, fordi de kan adskilles under farvning.Fjern mediet fra pladerne og fordel 400 mikroliter af en fortynding pr. brønd. Inkuber pladerne ved 37 grader Celsius i to timer for virus adsorption. Under virus adsorption, forberede mikrokrystallinsk cellulose overlay ved først at justere pH af 2X MEM til omkring 7,2 med en steril natriumbikarbonat opløsning på 7,5% efter farveindikatoren.For at opnå 100 milliliter af overlejringen tilsættes 10 milliliter 2X MEM, 10 milliliter 2,4%monokrystallinær celluloseaffjedring og 80 milliliter mem suppleret med 2%FCS og blandes kraftigt. Ved afslutningen af den to-timers inkubation, tilføje to til tre milliliter af overlay til hver brønd af de 12-brønd plader uden at fjerne inokulum. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid i seks dage.At plette cellerne med krystal violet opløsning, først forsigtigt ryste pladerne til at tage den mikrokrystallinske cellulose overlay. Fjern supernatanterne og vask cellerne to gange med 1X PBS, tilsæt derefter en til to milliliter af krystalvioletopløsningen og vent 10 til 15 minutter. Fjern opløsningen, som kan genbruges til efterfølgende pladefarvning.Endelig beregne virus titers som en brøkdel af antallet af synlige plaques i brøndene af de tørre plader og inoculum volumen og fortynding. Udførelse af en plaque assay på den negative kontrol, transflettet med kun udtrykket plasmider af N, P, L og M2-1 afslørede ingen plak ved den laveste fortynding. Titerne fra de transficerede celler forventedes at være over 100 PFU pr. milliliter, hvis redningen var effektiv.Titerne steg over passagerne for at nå en million til 10 millioner PFU pr. milliliter ved passage et eller to. Takket være disse fluorescerende vira kan hæmning af RSV-ekspression ved siRNA rettet mod proteinet N og det cellulære protein IMPDH let observeres og måles. I modsætning hertil blev et stærkt GFP-signal på kontrolceller transficeret med ikke-målrettet siRNA eller celler transficeret med siRNA mod det cellulære protein GAPDH observeret og målt.Ligeledes disse vira aktiveret nem observation af hæmning af RSV multiplikation af en antiviral stof forbindelse. Sporing af fluorescerende protein M2-1 i HEp-2-inficerede celler viste IBs og IB-associerede granulat som meget dynamiske strukturer. IBs blev observeret som mobile og sfæriske strukturer i stand til at smelte og danne større sfæriske indeslutninger.IB-associerede granulat undergik kontinuerlig samling-demontering cykler med dannelsen af små IB-associerede granulat, der voksede, smeltet til store IB-associerede granulat, og derefter forsvandt. Protokollen for plaktitrering af RSV ved hjælp af mikrokrystallinsk celluloseoverlejring kan let tilpasses andre celler og/eller andre vira. Det vil kræve justering af koncentrationen af mikrokrystallinsk cellulose.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Produktion og Titering af rekombinant adeno-associeret virale vektorer

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Protein misfoldning Cyklisk Amplifikation af Prioner

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Etablering af en Liquid-dækket kultur Polarized humane luftveje Epitelial Calu-3-celler til at studere Host celle respons på luftvejspatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Fremstilling af rekombinant arenavirus for Vaccine Development i FDA-godkendte Vero celler

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput Screening for Bredspektret Chemical hæmmere af RNA virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administration af rekombinant influenzavacciner i kimære musemodeller at studere slimhindeimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...