Name: generation, amplification, and titration of recombinant respiratory syncytial viruses
Uploaded: 2019-04-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses at JoVE.com

De auteurs bedanken Dr. Qin Yu van AstraZeneca R & D Boston, MA, USA, voor het verstrekken van de drug AZD4316. De auteurs zijn dankbaar aan het Cymages platform voor toegang tot de ScanR Olympus Microscoop, die werd ondersteund door subsidies uit de regio Ile-de-France (DIM Eén gezondheid). De auteurs erkennen steun van het INSERM en de Universiteit van Versailles Saint-Quentin.

1. materiële voorbereiding
<ol><li>Cel media kopen (verminderde serum media, minimale essentiële media [MEM], 10 x MEM en Dulbecco gewijzigd van Eagle's medium [DMEM]), transfectiereagens en microkristallijne cellulose (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Verkrijgen van de volgende vectoren voor omgekeerde genetica: de genomische vector(s) en de codering van de N-eiwitten en de complexe eiwitten van polymerase expressievectoren. De genomische vectoren bevatten het volledige cDNA genoom van RSV-GFP (...

<ol>
	<li>Shi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+disease+burden+estimates+of+acute+lower+respiratory+infections+due+to+respiratory+syncytial+virus+in+young+children+in+2015:+a+systematic+review+and+modelling+study.">Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study.</a> The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).</li><li>Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+Syncytial+Virus+Infection+in+Elderly+and+High-Risk+Adults.">Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults.</a> The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).</li><li>DeVincenzo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+Oral+ALS-008176+in+a+Respiratory+Syncytial+Virus+Challenge+Study.">Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).</li><li>DeVincenzo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+GS-5806+Activity+in+a+Respiratory+Syncytial+Virus+Challenge+Study.">Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).</li><li>Afonso, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales:+update+2016.">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016.</a> Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).</li><li>Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+elongation+factor+of+respiratory+syncytial+virus,+a+nonsegmented+negative-strand+RNA+virus.">Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+bodies+are+a+site+of+ebolavirus+replication.">Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication.</a> Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).</li><li>Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+expression+redirects+vesicular+stomatitis+virus+RNA+synthesis+to+cytoplasmic+inclusions.">Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions.</a> PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958 (2010).</li><li>Lahaye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Characterization+of+Negri+Bodies+(NBs)+in+Rabies+Virus-Infected+Cells:+Evidence+that+NBs+Are+Sites+of+Viral+Transcription+and+Replication.">Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication.</a> Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).</li><li>Kolesnikova, L., M&#252;hlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+organization+of+recombinant+Marburg+virus+nucleoprotein:+comparison+with+Marburg+virus+inclusions.">Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions.</a> Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).</li><li>Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marburg+virus+inclusions:+A+virus-induced+microcompartment+and+interface+to+multivesicular+bodies+and+the+late+endosomal+compartment.">Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment.</a> European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).</li><li>Rincheval, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+cytoplasmic+inclusion+bodies+in+cells+infected+by+respiratory+syncytial+virus.">Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus.</a> Nature Communications. 8 (1), 563 (2017).</li><li>Santangelo, P. J., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+filamentous+viral+RNPs+prior+to+egress.">Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).</li><li>Lifland, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Nucleoprotein+and+Inclusion+Bodies+Antagonize+the+Innate+Immune+Response+Mediated+by+MDA5+and+MAVS.">Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS.</a> Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).</li><li>Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+inclusions+of+respiratory+syncytial+virus-infected+cells:+formation+of+inclusion+bodies+in+transfected+cells+that+coexpress+the+nucleoprotein,+the+phosphoprotein,+and+the+22K+protein.">Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein.</a> Virology. 195 (1), 243-247 (1993).</li><li>Brown, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+association+between+heat+shock+protein+70+and+the+respiratory+syncytial+virus+polymerase+complex+within+lipid-raft+membranes+during+virus+infection.">Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection.</a> Virology. 338 (1), 69-80 (2005).</li><li>Radhakrishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+analysis+of+purified+respiratory+syncytial+virus+particles+reveals+an+important+role+for+heat+shock+protein+90+in+virus+particle+assembly.">Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).</li><li>Racaniello, V. R., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloned+poliovirus+complementary+DNA+is+infectious+in+mammalian+cells.">Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells.</a> Science. 214 (4523), 916-919 (1981).</li><li>Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+rabies+viruses+from+cloned+cDNA.">Infectious rabies viruses from cloned cDNA.</a> The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).</li><li>Collins, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+infectious+human+respiratory+syncytial+virus+from+cloned+cDNA+confirms+an+essential+role+for+the+transcription+elongation+factor+from+the+5'+proximal+open+reading+frame+of+the+M2+mRNA+in+gene+expression+and+provides+a+capability+for+vaccine.">Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).</li><li>Rameix-Welti, M. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+replication+of+respiratory+syncytial+virus+in+cells+and+in+living+mice.">Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice.</a> Nature Communications. 5, 5104 (2014).</li><li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+(BRSV)+from+cDNA:+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture,+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter.">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).</li><li>Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+activity+and+molecular+mechanism+of+an+orally+active+respiratory+syncytial+virus+fusion+inhibitor.">Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).</li><li>Derscheid, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+respiratory+syncytial+virus+memphis+37+grown+in+HEp-2+cells+causes+more+severe+disease+in+lambs+than+virus+grown+in+vero+cells.">Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells.</a> Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).</li><li>McKimm-Breschkin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+plaque+assay+for+respiratory+syncytial+virus+-+direct+visualization+of+plaques+without+immunostaining.">A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus - direct visualization of plaques without immunostaining.</a> Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virology Journal. 7, 1-7 (2006).</li><li>Novina, C. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNAi+revolution.">The RNAi revolution.</a> Nature. 430 (6996), 161-164 (2004).</li><li>Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+inosine+5'-monophosphate+dehydrogenase+and+the+design+of+novel+inhibitors.">The structure of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors.</a> Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).</li><li>Beaucourt, S., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribavirin:+A+drug+active+against+many+viruses+with+multiple+effects+on+virus+replication+and+propagation.+Molecular+basis+of+ribavirin+resistance.">Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance.</a> Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).</li><li>Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Ribavirin+on+Respiratory+Syncytial+Virus+in+vitro.">Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).</li><li>Sim&#245;es, E. A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past,+Present+and+Future+Approaches+to+the+Prevention+and+Treatment+of+Respiratory+Syncytial+Virus+Infection+in+Children.">Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children.</a> Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).</li><li>Alvarez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-mediated+silencing+of+the+respiratory+syncytial+virus+nucleocapsid+defines+a+potent+antiviral+strategy.">RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).</li><li>DeVincenzo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+double-blind,+placebo-comtrolled+study+of+an+RNAi-based+therapy+directed+against+respiratory+syncytial+virus.">A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+a+CRISPR/Cas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells.">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).</li><li>Nikolic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negri+bodies+are+viral+factories+with+properties+of+liquid+organelles.">Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles.</a> Nature Communications. 8 (1), 58 (2017).</li></ol>

Hier presenteren we een methode van redding van recombinant RSVs van vijf plasmiden en hun versterking. De mogelijkheid om het manipuleren van het genoom van virussen heeft een revolutie teweeggebracht in virologie onderzoek om te testen van mutaties en express een extra gen of een tagged virale eiwitten. Het RSV hebben we beschreven en gebruikt als een voorbeeld in dit artikel een uiting van een verslaggever-gen, de RSV-GFP is (ongepubliceerd), en spreekt een M2-1 eiwit tot een GFP label12 gesmolten</s...

Menselijke RSV is de belangrijkste oorzaak van hospitalisatie voor acute respiratoire landstreekbesmetting in zuigelingen wereldwijd1. RSV is bovendien gekoppeld aan een aanzienlijke ziektelast in volwassenen vergelijkbaar met influenza, met de meeste van de hospitalisatie en sterfte last in de oudere2. Er zijn geen vaccins of specifieke antivirale middelen beschikbaar nog tegen RSV, maar veelbelovende nieuwe drugs zijn in ontwikkeling3,4. De complexiteit en de zwaarte van de technieken van kwantificering van RSV vermenigvuldiging belemmeren de zoekt antivirale middelen of vaccins ondanks huidige aanzienlijke inspanningen. De kwantificering van RSV vermenigvuldiging in vitro is over het algemeen gebaseerd op omslachtige, tijdrovende en dure methoden, die meestal in de analyse van de cytopathogeen effect door microscopie, immunokleuring, vermindering van de plaque testen, kwantitatieve bestaat reverse-transcriptase (qRT)-de Kettingreactie van de polymerase (PCR) en enzyme-linked immunosorbent assay proeven. Virussen met gemodificeerde genoom en het uiten van reporter genen, zoals codering voor de GFP, zijn meer geschikt voor dergelijke vertoningen. Gekoppeld aan het gebruik van geautomatiseerde plaat lezers, kunnen reporter gene-uitvoering recombinante virussen maken deze testen meer geschikt voor normalisatie en hoog-productie doeleinden.
RSV is een omhuld, nonsegmented negatief-sense RNA-virus dat tot het geslacht van de Orthopneumovirus van de Pneumoviridae familie, orde Mononegavirales5 behoort. Het RSV genoom is een single-strand, negatief-sense RNA van ongeveer 15 kb, waarin een noncoding regio op de 3' en 5' extremiteiten leider en Trailer en 10 transcriptionele eenheden codering 11 eiwitten. De genen worden als volgt gerangschikt: 3'-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (codering voor M2-1 en M2-2 eiwitten) en L-5'. De genomische RNA is strak verpakt door de nucleoproteïne N. Using encapsidated genomic RNA als een sjabloon, virale RNA-afhankelijke RNA-polymerase (RdRp) zal zorgen voor transcriptie en replicatie van de virale RNA. Virale RdRp bestaat uit het grote eiwit L die per se de polymeraseactiviteit nucleotide draagt, zijn verplichte cofactor de phosphoprotein P en de M2-1 proteïne die als een virale transcriptie functioneert factor6. In de geïnfecteerde cellen induceert RSV de vorming van cytoplasmatische insluitingen opneming instanties (IBs) genaamd. Morfologisch soortgelijke cytoplasmatische insluitingen zijn waargenomen voor diverse Mononegavirales7,8,9,10. Recente studies over rabiësvirus, vesiculaire stomatitis virus (VSV), Ebola-virus en RSV bleek dat virale RNA-synthese treedt op in IBs, dat kunnen dus worden beschouwd als virale fabrieken8,9,11, 12. de virus fabrieken concentreren de RNA en virale eiwitten nodig is voor virale RNA-synthese en bevatten ook cellulaire eiwitten13,14,15,16, 17. IBs vertonen een functionele subcompartment genaamd IB-geassocieerde korrels (IBAGs), die zich concentreren het nieuw synthetized ontluikende virale mRNA samen met de M2-1 proteïne. De genomische RNA en de L, P en N worden niet gedetecteerd in IBAGs. IBAGs zijn kleine dynamische bolvormige structuren binnen IBs die de eigenschappen van vloeibare organellen12vertonen. Ondanks de centrale rol van IBs in virale vermenigvuldiging, is zeer weinig bekend over de aard, de interne structuur, de vorming en de werking van deze virale fabrieken.
De expressie van het genoom van een poliovirus uit een cDNA ingeschakeld de productie van de eerste besmettelijke virale kloon in 198118. Voor single-stranded negatieve RNA virussen was het niet tot 1994 dat de productie van een eerste rabiësvirus na transfectie van plasmiden in cellen19 plaatsvond. Het eerste plasmide gebaseerde omgekeerde genetische systeem voor RSV werd gepubliceerd in 199520. Omgekeerde genetica hebben geleid tot belangrijke ontwikkelingen op het gebied van virologie. Kritisch inzicht in de replicatie en pathogenese van RNA-virussen heeft voorzien in de mogelijkheid van de invoering van specifieke wijzigingen in het virale genoom. Deze technologie heeft de ontwikkeling van vaccins ook aanzienlijk vergemakkelijkt doordat specifieke demping door middel van gerichte reeks wijzigingen. Genoom wijzigingen waardoor een snelle kwantificering van virale vermenigvuldiging sterk verbeterd de antivirale screening en de studie van hun werkingsmechanisme.
Hoewel eerder beschreven, blijft verkrijgen van genetisch gemodificeerde RSVs gevoelig. Hier, detail we een protocol bij het maken van twee soorten recombinante HRSV, respectievelijk uiting van RSV-GFP of RSV-M2-1-GFP. In dit protocol beschrijven we de voorwaarden van de transfectie moest redden de nieuwe recombinante virussen, evenals hun versterking te verkrijgen van virale voorraden met hoge titer, geschikt voor reproduceerbare experimenten. De bouw van het reverse genetics vectoren wordt per se hier niet beschreven. We worden methoden beschreven voor de optimale oogsten en invriezen van virale voorraden. De meest nauwkeurige methode te kwantificeren virale besmettelijke deeltjes blijft plaque assay. Cellen zijn besmet met seriële verdunningen van de geanalyseerde schorsing en geïncubeerd met een overlay die de verspreiding van gratis virale deeltjes in het supernatant verbiedt. In dergelijke omstandigheden, zal het virus alleen aangrenzende cellen vormen een "plaque" voor elk initiële infectieuze deeltje infecteren. In de conventionele RSV titratie assay, zijn plaques geopenbaard door immunokleuring en geteld onder microscopische observatie. Deze methode is duurder en tijdrovender. We beschreven hier een heel simpel protocol voor een RSV plaque assay met microkristallijne cellulose overlay waarmee de vorming van plaques zichtbaar met het blote oog. We laten zien hoe RSV-GFP kan worden gebruikt op maatregel RSV replicatie en, dus, op het kwantificeren van de impact van antivirale middelen. Omgekeerde genetica en levende imaging technologie te combineren, we laten zien hoe de RSV-M2-1-GFP wetenschappers te visualiseren M2-1 in levende cellen en volgen de dynamiek van intracellulaire virale structuren, zoals IBs toestaat.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm &#181; dish for live cell imaging</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel RC-591</td>
			<td>FMC BioPolymer</td>
			<td>Avicel RC-591</td>
			<td>Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSRT7/5</td>
			<td></td>
			<td>not commercially available</td>
			<td>See ref 22. Buchholz et al, 1999</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT90132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for observations</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73 Olympus microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for videomicroscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>ScanR Olympus microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEp-2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (10X), no glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11430030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41090-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 ReagentPlus, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td>not commercially available</td>
			<td>see ref 21. Rameix-Welti et al, 2014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>See Saw Rocker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA GAPDH</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus siRNA 
			D-001810-10-05</td>
			<td>SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA IMPDH2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human 
			L-004330-00-0005</td>
			<td>SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. 
			Individual references and sequences 
			J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; 
			J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; 
			J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; 
			J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA RSV N</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus custom siRNA</td>
			<td>UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiRNA NT</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiRNA transfection reagent</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03</td>
			<td>Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate 7.5% solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Tecan infinite M200PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, amplification, and titration of recombinant respiratory syncytial viruses

Het gebruik van recombinante virussen is in basic of toegepaste Virologie van cruciaal belang geworden. Omgekeerde genetica heeft bewezen een uiterst krachtige technologie, zowel ontcijferen van virale replicatie mechanismen te bestuderen van antivirale middelen of ontwikkelplatform voor vaccins. De bouw en de manipulatie van een omgekeerde genetische systeem voor een negatieve-streng RNA-virus zoals een respiratoir syncytieel virus (RSV), echter blijft gevoelige en speciale kennis vereist. Het RSV genoom is een single-strand, negatief-sense RNA van ongeveer 15 kb dat als een sjabloon voor zowel virale RNA replicatie en transcriptie fungeert. Onze omgekeerde genetica-systeem gebruikt een cDNA kopie van het menselijk genoom van de RSV lange stam (HRSV). Dit cDNA, evenals de cDNAs virale eiwitten van de polymerase van complexe codering (L, P, N en M2-1), worden in afzonderlijke expressievectoren onder T7 polymerase besturingsprocessen geplaatst. De transfectie van deze elementen in de BSR-T7/5 cellen, die stabiel express T7 polymerase, kan men cytoplasmatische replicatie en transcriptie van de recombinante RSV, die aanleiding geven tot genetisch gemodificeerde virionen. Een nieuwe RSV, die aanwezig is op het celoppervlak en in het supernatant van cultuur van BSRT7/5, wordt verzameld om te infecteren menselijke HEp-2 cellen voor virale versterking. Twee of drie rondes van versterking nodig zijn om te verkrijgen van virale bouillon met 1 x 10,6 tot en met 1 x 107 plaque-vormende eenheden (PFU) / mL. Methoden voor de optimale oogsten, bevriezing en titratie van virale voorraden worden hier in detail beschreven. We illustreren het protocol hier gepresenteerd door het creëren van twee recombinante virussen respectievelijk uiten gratis groen fluorescente proteïne (GFP) (RSV-GFP) of virale M2-1 gesmolten tot GFP (RSV-M2-1-GFP). We laten zien hoe met RSV-GFP kwantificeren RSV replicatie en de RSV-M2-1-GFP te visualiseren van virale structuren, evenals de dynamiek van de virale eiwitten in levende cellen, met behulp van video microscopie technieken.

In dit werk beschreven we een gedetailleerd protocol voor de productie van recombinante virussen van RSV uiting van een fluorescente proteïne (Figuur 2). In pRSV-GFP, is het GFP-gen tussen de P en M genen, geïntroduceerd als beschreven voor het Cherry gen in eerder gepubliceerde werk21. In de pRSV-M2-1-GFP, de M2 gene was links onaangeroerd en een extra gen dat codeert voor M2-1-GFP werd ingevoegd tussen SH en G genen<sup class="xref...

Watch this Scientific Journal Video about Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses at JoVE.com

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Beschrijven we een methode voor het genereren van en sturen genetisch gemodificeerde respiratoir syncytieel virussen (RSVs) en een geoptimaliseerde plaque assay voor RSVs. We illustreren dit protocol door het creëren van twee recombinante virussen die respectievelijk toestaan kwantificering van RSV replicatie en live analyse van RSV opneming organen en integratie-organen-geassocieerde korrels dynamiek.

Generatie, versterking en titratie van recombinante respiratoir syncytieel virussen

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Het gebruik van recombinant virussen is een krachtige technologie om zowel de virale replicatiemechanismen te ontcijferen als ontwikkelingsplatforms voor vaccins te bieden. Evenzo is het genereren van virale voorraad van goede kwaliteit cruciaal voor elke virale studie, van het meest fundamentele onderzoek tot de toegepaste studies. Redding van recombinant virussen, optimale oogst, bevriezing, en titratie van RSV voorraden zijn kritische methoden voor alle virologische studies.Ze kunnen als traditioneel worden beschouwd, maar blijven delicaat en vereisen specifieke expertise. De dag voor de transfectie, schorsen BSR-T7/5 cellen in volledig medium op 0,5 miljoen cellen per milliliter concentratie. Verdeel twee milliliter van de celopening per put in een zes-put plaat.Incubeer de plaat op 37 graden Celsius in 5% kooldioxide totdat ze 80-90% samenvloeiing de volgende dag. Om elk virus te redden, eerst mengen ontdooide omgekeerde genetica vectoren in een buis, ga dan over tot transfectie, volgens de transfectie reagens fabrikant protocol. Voeg vervolgens 250 microliter van het gereduceerde serummedium toe aan de gemengde vectoren.Verdun in een andere buis 10 microliter van dit transfectiereagens in 250 microliter van het verlaagde serummedium. Voorzichtig vortex beide buizen en wacht vijf minuten. Meng de inhoud van beide buizen en wacht 20 minuten op kamertemperatuur.Spoel ondertussen de BSR-T7/5 cellen met één milliliter van het verlaagde serummedium en verdeel 1,5 milliliter minimaal essentiële mediaantibiotica vrij aangevuld met 10% foetaal kalfsserum per put. Indien nodig, uitbroeden bij 37 graden Celsius in 5%kooldioxide milieu. Voeg na de incubatie van 20 minuten 500 microliters van de transfectiemix in elke put toe.Incubeer de cellen op 37 graden Celsius in 5%koolstofdioxide milieu gedurende drie dagen. Om de reddingsefficiëntie te controleren, observeer u bij GFP-fluorescentie onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop bij 20X-vergroting eenmaal per dag. Op de derde dag van transfectie, krascellen in elke put van de transfected BSR-T7/5 zes-put plaat.Breng cellen en supernatant van elke put in een steriele twee milliliter microcentrifuge buis. Om het geredde virus uit de celmembranen vrij te geven, moet elke buis minstens 30 seconden krachtig worden verwijderd. Voor de eerste versterking van de geredde virussen, eerst verwijderen van de cultuur medium van de HEp-2 plaat gezaaid de dag ervoor, dan snel toe te voegen 500 microliter per put van de verse passage-nul virale suspensie.Plaats de HEp-2 plaat op 37 graden Celsius op een wip rocker voor zachte agitatie voor twee uur. Om de eerste passage van de geredde virussen te produceren, gooi 500 microliter van het entmateriaal weg en voeg twee milliliter MEM toe met 2% FCS. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius in 5%kooldioxide gedurende drie dagen.Om de infectie te controleren onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop bij 20X vergroting, observeren GFP fluorescentie van de HEp-2 cellen besmet met de passage-nul suspensie eenmaal per dag. Let onder een helderveldmicroscoop op het uiterlijk van kleine syncytia en celloslating, die het RSV-cytopathische effect weerspiegelt. Om de geredde virussen te versterken, verdun eerst de virale schorsing van FCS-vrije MEM om een schorsing van drie milliliter te verkrijgen bij 50.000 PFU per milliliter, verwijder vervolgens het medium uit de HEp-2-kolf.Voeg snel de drie-milliliter virale suspensie toe en broed de kolf bij 37 graden Celsius uit op een wiprocker voor zachte agitatie gedurende twee uur. Verwijder en gooi het eneculum weg en voeg 15 milliliter MEM toe met 2%FCS. Incubeer bij 37 graden Celsius in 5%kooldioxide gedurende twee tot vier dagen.Om het juiste moment te schatten om de virussen te oogsten, controleer de celmorfologie en GFP-fluorescentie onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop bij vergroting van 20x. Merk op dat dit meestal is wanneer 50% tot 80% van de HEp-2 cellaag wordt losgemaakt als gevolg van de RSV cytopathische effect dat optreedt tussen 48 en 72 uur na infectie. Schrapen vervolgens alle cellen met behulp van een cel schraper.Verzamel zowel de cellen als de supernatant samen en breng ze over naar een 50-milliliter centrifugebuis. Voeg 1/10 van het volume van de 10X RSV conserveringsoplossing toe. Vortex de buizen krachtig gedurende vijf seconden en centrifugeren gedurende vijf minuten op 200 keer g om de suspensie te verduidelijken.Breng de supernatant over op een buis van 50 milliliter. Vortex kort en aliquot de suspensie in cryogene buizen gelabeld met alcohol-resistente tags. Dompel de buis onder in voorgekoelde, min 80 graden Celsius alcohol gedurende ten minste een uur en bewaar ze op min 80 graden Celsius.Om een plaque titratie test uit te voeren, maak eerst 2X minimale essentiële medium door het verdunnen van commerciële 10X MEM met steriel water en het toevoegen van L-glutamine, 1, 000 eenheden per milliliter penicilline, en een milligram per milliliter streptomycine. Schud de verdunning krachtig en bewaar het op vier graden Celsius en voeg vervolgens 900 microliter van de FCS-vrije MEM toe aan zes buizen. Ontdooi het virus aliquots en vortex ze krachtig gedurende vijf seconden.Om seriële verdunningen te maken, voeg eerst 100 microliter van het virus toe aan 900 microliter van het medium in de eerste buis. Leg de dop op de buis en meng de inhoud door vortexing voor een paar seconden, voeg dan 100 microliter van de eerste verdunning tot 900 microliter van het medium in de tweede buis. Leg de dop op de buis en vortex.Herhaal deze procedure tot de zesde buis. Schrijf de naam van het virus en de volledige verdunningen op de HEp-2 12-well platen. Voeg een merk aan de plaat en de dekking, omdat ze kunnen worden gescheiden tijdens het bevlekken.Haal het medium uit de platen en verdeel 400 microliter van één verdunning per put. Incubeer de platen op 37 graden Celsius gedurende twee uur voor virus adsorptie. Bereid tijdens de virusadsorptie de microkristallijne celluloseoverlay voor door eerst de pH van het 2X MEM aan te passen aan ongeveer 7,2 met een steriele natriumbicarbonaatoplossing met 7,5% na de kleurindicator.Om 100 milliliter van de overlay te verkrijgen, voeg 10 milliliter 2x MEM, 10 milliliter van 2,4% monokristallijne cellulose suspensie, en 80 milliliter van de MEM aangevuld met 2%FCS en meng krachtig. Voeg aan het einde van de twee uur durende incubatie twee tot drie milliliter van de overlay toe aan elke put van de 12-putplaten zonder het entmateriaal te verwijderen. Broed de plaat zes dagen lang in 5%kooldioxide.Om de cellen te bevlekken met kristalviolet oplossing, schud eerst voorzichtig de platen om de microkristallijne cellulose overlay af te nemen. Verwijder de supernatants en was de cellen twee keer met 1X PBS, voeg vervolgens een tot twee milliliter van de kristalviooloplossing toe en wacht 10 tot 15 minuten. Verwijder de oplossing, die kan worden hergebruikt voor latere plaat-vlekken.Bereken ten slotte de virustiters als een fractie van het aantal zichtbare plaques in de putten van de droge platen en het entmateriaalvolume en de verdunning. Het uitvoeren van een plaque test op de negatieve controle, doorgetast met alleen de uitdrukking plasmiden van N, P, L, en M2-1 bleek geen plaque bij de laagste verdunning. De titers verkregen uit de transfected cellen werden verwacht dat meer dan 100 PFU per milliliter als de redding efficiënt was.De titers verhoogd over de passages te bereiken een miljoen tot 10 miljoen PFU per milliliter bij passage een of twee. Dankzij deze fluorescerende virussen kan remming van RSV-expressie door siRNA gericht op het eiwit N en het cellulaire eiwit IMPDH gemakkelijk worden waargenomen en gemeten. Daarentegen werd een sterk GFP-signaal op controlecellen getransfecteerd met niet-targeting siRNA of cellen die met siRNA werden getransfecteerd tegen het cellulaire eiwit GAPDH.Ook deze virussen maakten een gemakkelijke observatie van de remming van RSV vermenigvuldiging door een antivirale drug verbinding. Het volgen van het fluorescerende eiwit M2-1 in HEp-2 geïnfecteerde cellen toonde IBs en IB-geassocieerde korrels als zeer dynamische structuren. IBs werden waargenomen als mobiele en bolvormige structuren in staat om te smelten en grotere bolvormige insluitsels te vormen.IB-geassocieerde korrels ondergingen continue assemblage-demontage cycli met de vorming van kleine IB-geassocieerde korrels die groeiden, versmolten tot grote IB-geassocieerde korrels, en vervolgens verdwenen. Het protocol van plaque titratie van RSV met behulp van microkristallijne cellulose overlay kan gemakkelijk worden aangepast aan andere cellen en/ of andere virussen. Het vereist aanpassing van de concentratie van de microkristallijncellulose.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Generatie van recombinant griepvirus uit plasmide-DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolatie van Fidelity Varianten van RNA-virussen en Karakterisering van mutatie van de virussen Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Productie en Titering van recombinant adeno-geassocieerde virale vectoren

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Eiwit misfolding Cyclische Versterking van prionen

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Tot oprichting van een Liquid bedekte cultuur van gepolariseerde menselijke luchtwegen Epiteel Calu-3 cellen aan Host Cell Reactie op respiratoire pathogenen Studie<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Generatie van recombinant arenavirus for Vaccine Development in FDA-goedgekeurde Vero cellen

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput screening voor Breed-spectrum Chemische Remmers van RNA-virussen

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasale toediening van recombinante Influenza Vaccines in Chimerisch muismodellen om mucosale immuniteit bestuderen

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...