Name: generation, amplification, and titration of recombinant respiratory syncytial viruses
Uploaded: 2019-04-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses at JoVE.com

Les auteurs remercient m. Qin Yu de AstraZeneca R & D Boston, MA, é.-u., pour fournir le médicament AZD4316. Les auteurs sont reconnaissants à la plateforme Cymages pour l’accès au microscope ScanR Olympus, qui était soutenu par des subventions de la région Ile-de-France (DIM ONE HEALTH). Les auteurs reconnaissent le soutien de l’INSERM et l’Université de Versailles Saint-Quentin.

1. matérielle préparation
<ol><li>Acheter des supports de la cellule (sérum réduit médias, minimales essentielles [MEM], 10 x MEM et Dulbecco de l’aigle modifié [DMEM]), réactif de transfection et cellulose microcristalline (voir Table des matières).</li>
	<li>Obtenir les vecteurs suivants de génétique inverse : la génomique vecteur (s) et les vecteurs d’expression codant pour la protéine N et les protéines complexe polymérase. Les vecteurs génomiques contiennent le génome complet ...

<ol>
	<li>Shi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+disease+burden+estimates+of+acute+lower+respiratory+infections+due+to+respiratory+syncytial+virus+in+young+children+in+2015:+a+systematic+review+and+modelling+study.">Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study.</a> The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).</li><li>Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+Syncytial+Virus+Infection+in+Elderly+and+High-Risk+Adults.">Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults.</a> The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).</li><li>DeVincenzo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+Oral+ALS-008176+in+a+Respiratory+Syncytial+Virus+Challenge+Study.">Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).</li><li>DeVincenzo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+GS-5806+Activity+in+a+Respiratory+Syncytial+Virus+Challenge+Study.">Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).</li><li>Afonso, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales:+update+2016.">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016.</a> Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).</li><li>Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+elongation+factor+of+respiratory+syncytial+virus,+a+nonsegmented+negative-strand+RNA+virus.">Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+bodies+are+a+site+of+ebolavirus+replication.">Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication.</a> Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).</li><li>Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+expression+redirects+vesicular+stomatitis+virus+RNA+synthesis+to+cytoplasmic+inclusions.">Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions.</a> PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958 (2010).</li><li>Lahaye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Characterization+of+Negri+Bodies+(NBs)+in+Rabies+Virus-Infected+Cells:+Evidence+that+NBs+Are+Sites+of+Viral+Transcription+and+Replication.">Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication.</a> Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).</li><li>Kolesnikova, L., M&#252;hlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+organization+of+recombinant+Marburg+virus+nucleoprotein:+comparison+with+Marburg+virus+inclusions.">Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions.</a> Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).</li><li>Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marburg+virus+inclusions:+A+virus-induced+microcompartment+and+interface+to+multivesicular+bodies+and+the+late+endosomal+compartment.">Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment.</a> European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).</li><li>Rincheval, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+cytoplasmic+inclusion+bodies+in+cells+infected+by+respiratory+syncytial+virus.">Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus.</a> Nature Communications. 8 (1), 563 (2017).</li><li>Santangelo, P. J., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+filamentous+viral+RNPs+prior+to+egress.">Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).</li><li>Lifland, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Nucleoprotein+and+Inclusion+Bodies+Antagonize+the+Innate+Immune+Response+Mediated+by+MDA5+and+MAVS.">Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS.</a> Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).</li><li>Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+inclusions+of+respiratory+syncytial+virus-infected+cells:+formation+of+inclusion+bodies+in+transfected+cells+that+coexpress+the+nucleoprotein,+the+phosphoprotein,+and+the+22K+protein.">Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein.</a> Virology. 195 (1), 243-247 (1993).</li><li>Brown, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+association+between+heat+shock+protein+70+and+the+respiratory+syncytial+virus+polymerase+complex+within+lipid-raft+membranes+during+virus+infection.">Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection.</a> Virology. 338 (1), 69-80 (2005).</li><li>Radhakrishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+analysis+of+purified+respiratory+syncytial+virus+particles+reveals+an+important+role+for+heat+shock+protein+90+in+virus+particle+assembly.">Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).</li><li>Racaniello, V. R., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloned+poliovirus+complementary+DNA+is+infectious+in+mammalian+cells.">Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells.</a> Science. 214 (4523), 916-919 (1981).</li><li>Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+rabies+viruses+from+cloned+cDNA.">Infectious rabies viruses from cloned cDNA.</a> The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).</li><li>Collins, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+infectious+human+respiratory+syncytial+virus+from+cloned+cDNA+confirms+an+essential+role+for+the+transcription+elongation+factor+from+the+5'+proximal+open+reading+frame+of+the+M2+mRNA+in+gene+expression+and+provides+a+capability+for+vaccine.">Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).</li><li>Rameix-Welti, M. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+replication+of+respiratory+syncytial+virus+in+cells+and+in+living+mice.">Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice.</a> Nature Communications. 5, 5104 (2014).</li><li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+(BRSV)+from+cDNA:+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture,+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter.">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).</li><li>Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+activity+and+molecular+mechanism+of+an+orally+active+respiratory+syncytial+virus+fusion+inhibitor.">Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).</li><li>Derscheid, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+respiratory+syncytial+virus+memphis+37+grown+in+HEp-2+cells+causes+more+severe+disease+in+lambs+than+virus+grown+in+vero+cells.">Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells.</a> Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).</li><li>McKimm-Breschkin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+plaque+assay+for+respiratory+syncytial+virus+-+direct+visualization+of+plaques+without+immunostaining.">A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus - direct visualization of plaques without immunostaining.</a> Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virology Journal. 7, 1-7 (2006).</li><li>Novina, C. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNAi+revolution.">The RNAi revolution.</a> Nature. 430 (6996), 161-164 (2004).</li><li>Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+inosine+5'-monophosphate+dehydrogenase+and+the+design+of+novel+inhibitors.">The structure of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors.</a> Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).</li><li>Beaucourt, S., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribavirin:+A+drug+active+against+many+viruses+with+multiple+effects+on+virus+replication+and+propagation.+Molecular+basis+of+ribavirin+resistance.">Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance.</a> Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).</li><li>Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Ribavirin+on+Respiratory+Syncytial+Virus+in+vitro.">Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).</li><li>Sim&#245;es, E. A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past,+Present+and+Future+Approaches+to+the+Prevention+and+Treatment+of+Respiratory+Syncytial+Virus+Infection+in+Children.">Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children.</a> Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).</li><li>Alvarez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-mediated+silencing+of+the+respiratory+syncytial+virus+nucleocapsid+defines+a+potent+antiviral+strategy.">RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).</li><li>DeVincenzo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+double-blind,+placebo-comtrolled+study+of+an+RNAi-based+therapy+directed+against+respiratory+syncytial+virus.">A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+a+CRISPR/Cas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells.">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).</li><li>Nikolic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negri+bodies+are+viral+factories+with+properties+of+liquid+organelles.">Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles.</a> Nature Communications. 8 (1), 58 (2017).</li></ol>

Nous présentons ici une méthode de sauvetage de recombinant RSVs de cinq plasmides et leur amplification. La possibilité de manipuler le génome du virus a révolutionné la recherche virologie afin de tester des mutations et exprimer un gène additionnel ou une protéine virale étiquetée. La RSV, nous avons décrit et utilisé comme un exemple de cet article est un virus exprimant un gène rapporteur, la RSV-GFP (inédit) et exprime une protéine M2-1 fusionnée à la GFP tag12. Sauvetage de...

VRS humaine est la principale cause d’hospitalisation chez les infections respiratoires aiguës dans les bébés dans le monde1. En outre, le VRS est associé à une morbidité importante dans comparable à la grippe, avec la plus grande partie de l’hospitalisation et la charge de mortalité dans les personnes âgées de2adultes. Il n’y aucun vaccins ou des antiviraux spécifiques disponibles encore contre RSV, mais promettant de nouveaux médicaments sont en développement3,4. La complexité et la lourdeur des techniques de quantification de la multiplication de la RSV font obstacle à la recherche d’antiviraux ou vaccins malgré des efforts considérables actuels. La quantification de la multiplication de RSV in vitro est généralement fondée sur des méthodes laborieux, longues et coûteux, qui consistent principalement en l’analyse de l’effet cytopathogène par microscopie, immunomarquage, réduction de la plaque essais, quantitatives la transcriptase inverse (EIR)-réaction en chaîne par polymérase (PCR) et les immuno-essais de dosage. Virus avec des génomes modifiés et exprimant des gènes rapporteurs, comme ceux codant pour la GFP, sont plus adaptés pour ces projections. Couplé à l’usage des lecteurs de plaques automatisé, virus recombinants porteurs de gène de journaliste peuvent faire ces dosages plus adapté à la normalisation et haut débit.
Le VRS est un virus à ARN sens négatif enveloppé, un qui appartient au genre Orthopneumovirus de la Pneumoviridae famille, ordre Mononegavirales5. Le génome de la RSV est un ARN monocaténaire, sens négatif d’environ 15 Ko, qui contient une région non codante aux extrémités 3' et 5' appelé Leader et remorque et 10 unités de transcriptionnelles codant des 11 protéines. Les gènes sont classés comme suit : 3'-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (codant pour des protéines M2-1 et M2-2) et L-5'. L’ARN génomique est étroitement conditionné par la nucléoprotéine N. Using l’ARN génomique encapsidés comme gabarit, virale ARN polymérase ARN dépendante (RdRp) assurera la transcription et la réplication de l’ARN viral. RdRp virale est composé de la protéine grande L qui porte l’activité polymérase de nucléotide en soi, son cofacteur obligatoire la phosphoprotéine de P et la protéine M2-1 qui fonctionne comme une transcription virale facteur6. Dans les cellules infectées, RSV induit la formation d’inclusions cytoplasmiques appelées inclusions (IBs). Les inclusions cytoplasmiques morphologiquement semblables ont été observées pour plusieurs Mononegavirales7,8,9,10. Études récentes sur le virus rabique, virus de la stomatite vésiculaire (VSV), virus Ebola et RSV a montré que la synthèse de l’ARN virale s’effectue en IBs, qui peuvent ainsi être considérés comme usines virales8,9,11, 12. les usines de virus concentré l’ARN et des protéines virales requis pour la synthèse de l’ARN virale et contiennent également des protéines cellulaires13,14,15,16, 17. IBs présentent un plus fonctionnel appelé IB associées aux granules (IBAGs), qui concentrent la nouvellement synthétisée ARNm viral naissant ainsi que de la protéine M2-1. L’ARN génomique et le L, P et N ne sont pas détectés dans IBAGs. IBAGs sont de petites structures sphériques dynamiques à l’intérieur de l’ISB qui présentent les propriétés des organites liquide12. Malgré le rôle central de l’IBs dans la multiplication virale, on sait peu sur la nature, structure interne, formation et exploitation de ces usines virales.
L’expression du génome d’un poliovirus chez un ADNc a permis la production du premier clone virale infectieuse en 1981,18. Pour négatifs virus à ARN simple brin, ce n’est qu’en 1994 que la production d’un premier virus de la rage après transfection des plasmides dans les cellules19 a eu lieu. La première axée sur le plasmide inverse système génétique pour RSV a été publié en 1995,20. Génétique inverse ont conduit à des avancées majeures dans le domaine de la virologie. La possibilité d’introduire des modifications spécifiques dans le génome viral a fourni un aperçu critique de la réplication et la pathogenèse des virus à ARN. Cette technologie a également grandement facilité le développement de vaccins en permettant atténuation spécifique ciblés série de modifications. Modifications du génome qui permet un dosage rapide de multiplication virale grandement amélioré le contrôle antiviral et étude de leur mode d’action.
Bien que décrite précédemment, obtention d’organismes génétiquement modifiés RSVs reste délicate. Ici, nous détaillons un protocole pour créer deux types de recombinaison HRSV, exprimant respectivement RSV-GFP ou RSV-M2-1-GFP. Dans ce protocole, nous décrivons les conditions de transfection nécessaires pour secourir les nouveaux virus recombinants, ainsi que leur amplification afin d’obtenir des stocks viraux avec un titre élevé, adapté aux expérimentations reproductibles. La construction des vecteurs de la génétique inverse en soi n’est pas décrit ici. Nous décrivent les méthodes de récolte optimale et gel des stocks viraux. La méthode la plus précise pour mesurer les particules infectieuses virales reste essai de plaque. Cellules sont infectées par des dilutions successives de la suspension analysée et incubées avec une surcouche qui interdit la diffusion de particules virales libres dans le surnageant. Dans de telles conditions, le virus infectera seulement des cellules contiguës formant une « plaque » pour chaque particule infectieuse initial. Dans l’essai de titrage de RSV classique, les plaques sont révélés par immunomarquage et comptés sous observation microscopique. Cette méthode est coûteuse et fastidieuse. Ici, nous avons décrit un protocole très simple pour un essai de plaque RSV à l’aide de superposition de cellulose microcristalline qui permet la formation de plaques visibles à le œil nu. Nous montrons comment RSV-GFP permet de mesure RSV réplication et, partant, de quantifier l’impact des antiviraux. La combinaison génétique inverse et technologie de l’imagerie live, nous démontrons comment RSV-M2-1-GFP permet aux chercheurs de visualiser M2-1 dans des cellules vivantes et de suivre la dynamique des structures virales intracellulaires, comme IBs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm &#181; dish for live cell imaging</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel RC-591</td>
			<td>FMC BioPolymer</td>
			<td>Avicel RC-591</td>
			<td>Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSRT7/5</td>
			<td></td>
			<td>not commercially available</td>
			<td>See ref 22. Buchholz et al, 1999</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT90132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for observations</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73 Olympus microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for videomicroscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>ScanR Olympus microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEp-2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (10X), no glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11430030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41090-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 ReagentPlus, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td>not commercially available</td>
			<td>see ref 21. Rameix-Welti et al, 2014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>See Saw Rocker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA GAPDH</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus siRNA 
			D-001810-10-05</td>
			<td>SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA IMPDH2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human 
			L-004330-00-0005</td>
			<td>SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. 
			Individual references and sequences 
			J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; 
			J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; 
			J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; 
			J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA RSV N</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus custom siRNA</td>
			<td>UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiRNA NT</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiRNA transfection reagent</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03</td>
			<td>Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate 7.5% solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Tecan infinite M200PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, amplification, and titration of recombinant respiratory syncytial viruses

L’utilisation de virus recombinants est devenu cruciale en virologie fondamentale ou appliquée. Génétique inverse s’est avérée pour être une technologie extrêmement puissante, tant pour décrypter les mécanismes de réplication virale et à étudier les antiviraux ou fournir la plate-forme de développement pour les vaccins. La construction et la manipulation d’un système génétique inverse pour un négatif-strand RNA virus comme un virus respiratoire syncytial (VRS), cependant, reste délicates et nécessite des savoir-faire spécial. Le génome de la RSV est un ARN monocaténaire, sens négatif d’environ 15 Ko qui sert de matrice pour viral replication RNA et transcription. Notre système de génétique inverse utilise une copie de cDNA du génome humain RSV souche longue (HRSV). Cet ADNc, mais aussi des CDNA codant pour des protéines virales de la polymérase complexe (L, P, N et M2-1), est placés dans des vecteurs d’expression individuelle en vertu de séquences de contrôle polymérase T7. La transfection de ces éléments dans les cellules de BSR-T7/5, qui expriment le stablement polymérase T7, permet la réplication cytoplasmique et la transcription de la RSV recombinante, donnant lieu à des virions génétiquement modifiées. Une nouvelle RSV, qui est présent à la surface cellulaire et dans le surnageant de culture de BSRT7/5, est recueillie pour infecter des cellules humaines de HEp-2 pour l’amplification virale. Deux ou trois rondes d’amplification sont nécessaires pour obtenir des stocks viraux contenant 1 x 106 à 1 x 107 unités de formation de plaques (PFU) / mL. Méthodes d’optimal de récolte, gel et titrage des stocks viraux sont décrites ici en détail. Nous illustrons le protocole présenté ici en créant deux virus recombinants exprimant respectivement gratuit protéine fluorescente verte (GFP) (RSV-GFP) ou virale M2-1 fusionnée à la GFP (RSV-M2-1-GFP). Nous montrons comment utiliser RSV-GFP pour quantifier la réplication RSV et la RSV-M2-1-GFP de visualiser les structures virales, ainsi que la dynamique de protéine virale dans des cellules vivantes, en utilisant des techniques de microscopie vidéo.

Dans cet ouvrage, nous décrit un protocole détaillé pour produire des virus recombinants de RSV, exprimant une protéine fluorescente (Figure 2). Au pRSV-GFP, le gène de la GFP a été introduit entre les gènes P et M, comme pour le gène cerise en œuvre précédemment publiée21. Dans le pRSV-M2-1-GFP, le gène M2 a été laissé intact et un gène supplémentaire codant pour M2-1-GFP a été inséré entre SH et G gènes<sup cl...

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Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Nous décrivons une méthode permettant de générer et amplifier les organismes génétiquement modifiés virus syncytiales respiratoires (RSVs) et un dosage de plaque optimisé pour RSVs. Nous illustrons ce protocole en créant deux virus recombinants qui sont respectivement permettent la quantification de la réplication de la RSV et analyse des corps d’inclusion de RSV et dynamiques associés à corps d’inclusion des granules en direct.

Génération, Amplification et titrage du virus Syncytial respiratoires recombinants

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

L’utilisation de virus recombinants est une technologie puissante à la fois pour déchiffrer les mécanismes de réplication virale et pour fournir des plates-formes de développement pour les vaccins. De même, la génération de stocks viraux de bonne qualité est cruciale pour chaque étude virale, de la recherche la plus fondamentale aux études appliquées. Le sauvetage des virus recombinants, la récolte optimale, la congélation et la titration des stocks de VRS sont des méthodes essentielles pour toutes les études virologiques.Ils peuvent être considérés comme traditionnels, mais restent délicats et nécessitent une expertise spécifique. La veille de la transfection, suspendre les cellules BSR-T7/5 en milieu complet à 0,5 million de cellules par concentration millilitre. Répartir deux millilitres de suspension cellulaire par puits dans une plaque de six puits.Incuber la plaque à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5 % jusqu’à ce qu’elle atteigne 80 à 90 % de la confluence le lendemain. Pour sauver chaque virus, mélangez d’abord les vecteurs génétiques inversés décongelés dans un tube, puis passez à la transfection, suivant le protocole du fabricant de réavants de transfection. Ajouter ensuite 250 microlitres du milieu de sérum réduit aux vecteurs mixtes.Dans un autre tube, diluer 10 microlitres de ce réagent transfection dans 250 microlitres du milieu de sérum réduit. Vortexer doucement les deux tubes et attendre cinq minutes. Mélanger le contenu des deux tubes et attendre 20 minutes à température ambiante.Pendant ce temps, rincer les cellules BSR-T7/5 avec un millilitre du milieu de sérum réduit et distribuer 1,5 millilitre d’antibiotiques moyens essentiels minimum gratuit complété avec 10% sérum de veau fœtal par puits. Si nécessaire, incuber à 37 degrés Celsius dans un environnement de dioxyde de carbone de 5 %. Après l’incubation de 20 minutes, ajouter 500 microlitres du mélange de transfection dans chaque puits.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un environnement de dioxyde de carbone de 5% pendant trois jours. Pour surveiller l’efficacité du sauvetage, observez la fluorescence du GFP au microscope à fluorescence inversée à 20 X grossissement une fois par jour. Le troisième jour de transfection, gratter les cellules dans chaque puits de la plaque transfectée BSR-T7/5 six puits.Transférer les cellules et le supernatant de chaque puits dans un tube stérile de microcentrifugeuse de deux millilitres. Pour libérer le virus sauvé des membranes cellulaires, vortex chaque tube vigoureusement pendant au moins 30 secondes. Pour la première amplification des virus sauvés, retirez d’abord le milieu de culture de la plaque HEp-2 ensemencée la veille, puis ajoutez rapidement 500 microlitres par puits de la suspension virale fraîche passage zéro.Placez la plaque HEp-2 à 37 degrés Celsius sur un rocker à scie à scie pour une agitation douce pendant deux heures. Pour produire le premier passage des virus sauvés, jetez 500 microlitres de l’inoculum et ajoutez deux millilitres de MEM avec 2% de FCS. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5 % pendant trois jours.Pour surveiller l’infection au microscope à fluorescence inversée à 20 X grossissement, observez la fluorescence GFP des cellules HEp-2 infectées par la suspension de passage zéro une fois par jour. Sous un microscope à champ lumineux, observez l’apparition d’une petite syncytie et d’un décollement cellulaire, ce qui reflète l’effet cytopathique du VRS. Pour amplifier les virus sauvés, diluez d’abord la suspension virale du MEM sans FCS pour obtenir une suspension de trois millilitres à 50 000 PFU par millilitre, puis retirez le milieu du flacon HEp-2.Ajoutez rapidement la suspension virale de trois millilitres et incubez le flacon à 37 degrés Celsius sur un rocker à scie à scie pour une agitation douce pendant deux heures. Ensuite, retirez et jetez l’inoculum et ajoutez 15 millilitres de MEM avec 2%FCS. Incuber à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5 % pendant deux à quatre jours.Pour estimer le bon moment pour récolter les virus, vérifiez la morphologie cellulaire et la fluorescence GFP au microscope à fluorescence inversée à 20X grossissement. Notez que c’est généralement lorsque 50% à 80% de la couche cellulaire HEp-2 est détaché en raison de l’effet cytopathique RSV qui se produit entre 48 et 72 heures après l’infection. Ensuite, grattez toutes les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire.Recueillir les cellules et le supernatant ensemble et les transférer dans un tube centrifugeuse de 50 millilitres. Ajouter 1/10 du volume de la solution de conservation 10X RSV. Vortex les tubes vigoureusement pendant cinq secondes et centrifugeuse pendant cinq minutes à 200 fois g pour clarifier la suspension.Transférer le supernatant dans un tube de 50 millilitres. Vortex brièvement et aliquot la suspension dans des tubes cryogéniques étiquetés avec des étiquettes résistantes à l’alcool. Plongez le tube dans de l’alcool pré-refroidi, moins 80 degrés Celsius pendant au moins une heure et conservez-les à moins 80 degrés Celsius.Pour effectuer un test de titration de plaque, faites d’abord 2X minimum moyen essentiel en diluant commercial 10X MEM avec de l’eau stérile et en ajoutant de la L-glutamine, 1000 unités par pénicilline millilitre, et un milligramme par streptomycine millilitre. Secouez vigoureusement la dilution et rangez-la à quatre degrés Celsius, puis ajoutez 900 microlitres du MEM sans FCS à six tubes. Décongelez les aliquots de virus et vortexez-les vigoureusement pendant cinq secondes.Pour faire des dilutions en série, ajoutez d’abord 100 microlitres du virus à 900 microlitres du milieu dans le premier tube. Mettre le bouchon sur le tube et mélanger son contenu en tourbillonnant pendant quelques secondes, puis ajouter 100 microlitres de la première dilution à 900 microlitres du milieu dans le deuxième tube. Mettez le bouchon sur le tube et le vortex.Répétez cette procédure jusqu’au sixième tube. Écrivez le nom du virus et les dilutions complètes sur les plaques HEp-2 12-well. Ajouter une marque pour correspondre à la plaque et son couvercle, car ils peuvent être séparés pendant la coloration.Retirer le milieu des plaques et distribuer 400 microlitres d’une dilution par puits. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant deux heures pour l’adsorption du virus. Pendant l’adsorption de virus, préparez la superposition de cellulose de microcrystalline en ajustant d’abord le pH du MEM 2X à environ 7,2 avec une solution stérile de bicarbonate de sodium à 7,5% suivant l’indicateur de couleur.Pour obtenir 100 millilitres de la superposition, ajouter 10 millilitres de 2X MEM, 10 millilitres de suspension de cellulose monocrystalline de 2,4%, et 80 millilitres du MEM complétés par 2%FCS et mélanger vigoureusement. À la fin de l’incubation de deux heures, ajouter deux à trois millilitres de la superposition à chaque puits des plaques de 12 puits sans enlever l’inoculum. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5 % pendant six jours.Pour tacher les cellules avec la solution violette cristalline, secouez d’abord doucement les plaques pour enlever la superposition de cellulose microcrystalline. Retirer les supernatants et laver les cellules deux fois avec 1X PBS, puis ajouter un à deux millilitres de la solution violette cristalline et attendre 10 à 15 minutes. Retirez la solution, qui peut être réutilisée pour la coloration ultérieure des plaques.Enfin calculer les titres de virus comme une fraction du nombre de plaques visibles dans les puits des plaques sèches et le volume d’inoculum et la dilution. L’exécution d’un essai de plaque sur le contrôle négatif, transfected avec seulement les plasmides d’expression de N, P, L, et M2-1 n’a indiqué aucune plaque à la dilution la plus basse. On s’attendait à ce que les titres obtenus à partir des cellules transfected soient au-dessus de 100 PFU par millilitre si le sauvetage était efficace.Les titres ont augmenté au fil des passages pour atteindre un million à 10 millions de PFU par millilitre au passage un ou deux. Grâce à ces virus fluorescents, l’inhibition de l’expression du VRS par siRNA ciblant la protéine N et la protéine cellulaire IMPDH peut être facilement observée et mesurée. En revanche, un signal GFP fort sur les cellules témoins transfectées avec le siRNA non ciblé ou les cellules transfectées avec le siRNA contre la protéine cellulaire GAPDH a été observé et mesuré.De même, ces virus ont permis une observation facile de l’inhibition de la multiplication du VRS par un composé antiviral. Le suivi de la protéine fluorescente M2-1 dans les cellules infectées par le HEp-2 a montré que les IBs et les granules associés à l’IB étaient des structures très dynamiques. Les IB ont été observés comme des structures mobiles et sphériques capables de fusionner et de former de plus grandes inclusions sphériques.Les granules IB-associés ont subi des cycles continus d’assemblage-démontage avec la formation de petits granules IB-associés qui ont grandi, fusionnés dans de grands granules IB-associés, et ont alors disparu. Le protocole de titration de plaque du RSV utilisant la superposition de cellulose de microcrystalline peut être facilement adapté à d’autres cellules et/ou à d’autres virus. Il faudra ajuster la concentration de la cellulose microcrystalline.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Génération de virus recombinants de la grippe des ADN plasmidique

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Recherche

Immunologie et infection

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolement des variantes des virus à ARN de Fidelity et caractérisation de la fréquence de mutation de virus

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Production et titrage des adéno-associé recombinant vecteurs viraux

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Protein Misfolding Cyclic Amplification des prions

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

L&#39;établissement d&#39;une culture liquide recouvert de Airway humaines épithéliales polarisées cellules Calu-3 pour étudier la réponse cellulaire aux agents pathogènes respiratoires hôte<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Génération de Arenavirus recombinant pour le développement de vaccins approuvés par la FDA des cellules Vero

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Criblage à haut débit pour à large spectre inhibiteurs chimiques de l&#39;ARN virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Administration intranasale de vaccins contre la grippe recombinant chimérique dans les modèles de souris pour étudier l&#39;immunité muqueuse

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...