Name: generation, amplification, and titration of recombinant respiratory syncytial viruses
Uploaded: 2019-04-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses at JoVE.com

Die Autoren danken Dr. Qin Yu von AstraZeneca R & D Boston, MA, USA, für die Bereitstellung der AZD4316 Droge. Die Autoren sind dankbar für die Cymages-Plattform für den Zugriff auf die ScanR Olympus Mikroskop, das durch unterstützt wurde aus der Region Ile-de-France (DIM eine Gesundheit) gewährt. Die Autoren erkennen Unterstützung von INSERM und der Universität Versailles Saint-Quentin.

1. materielle Vorbereitung
<ol><li>Zelle Medien zu kaufen (reduzierte Serum Medien, minimale unerlässlich [MEM] 10 x MEM und Dulbecco modifizierten Adlers Medium [DMEM]), Transfection Reagens und mikrokristalline Cellulose (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Erhalten folgenden Vektoren für reverse Genetik: die genomische Vector(s) und die Codierung des N-Proteins und der Polymerase komplexe Proteine Expressionsvektoren. Die genomischen Vektoren enthalten das volle cDNA Genom der RSV-GLP (p-RSV...

<ol>
	<li>Shi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+disease+burden+estimates+of+acute+lower+respiratory+infections+due+to+respiratory+syncytial+virus+in+young+children+in+2015:+a+systematic+review+and+modelling+study.">Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study.</a> The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).</li><li>Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+Syncytial+Virus+Infection+in+Elderly+and+High-Risk+Adults.">Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults.</a> The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).</li><li>DeVincenzo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+Oral+ALS-008176+in+a+Respiratory+Syncytial+Virus+Challenge+Study.">Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).</li><li>DeVincenzo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+GS-5806+Activity+in+a+Respiratory+Syncytial+Virus+Challenge+Study.">Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).</li><li>Afonso, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales:+update+2016.">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016.</a> Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).</li><li>Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+elongation+factor+of+respiratory+syncytial+virus,+a+nonsegmented+negative-strand+RNA+virus.">Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+bodies+are+a+site+of+ebolavirus+replication.">Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication.</a> Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).</li><li>Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+expression+redirects+vesicular+stomatitis+virus+RNA+synthesis+to+cytoplasmic+inclusions.">Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions.</a> PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958 (2010).</li><li>Lahaye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Characterization+of+Negri+Bodies+(NBs)+in+Rabies+Virus-Infected+Cells:+Evidence+that+NBs+Are+Sites+of+Viral+Transcription+and+Replication.">Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication.</a> Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).</li><li>Kolesnikova, L., M&#252;hlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+organization+of+recombinant+Marburg+virus+nucleoprotein:+comparison+with+Marburg+virus+inclusions.">Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions.</a> Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).</li><li>Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marburg+virus+inclusions:+A+virus-induced+microcompartment+and+interface+to+multivesicular+bodies+and+the+late+endosomal+compartment.">Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment.</a> European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).</li><li>Rincheval, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+cytoplasmic+inclusion+bodies+in+cells+infected+by+respiratory+syncytial+virus.">Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus.</a> Nature Communications. 8 (1), 563 (2017).</li><li>Santangelo, P. J., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+filamentous+viral+RNPs+prior+to+egress.">Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).</li><li>Lifland, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Nucleoprotein+and+Inclusion+Bodies+Antagonize+the+Innate+Immune+Response+Mediated+by+MDA5+and+MAVS.">Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS.</a> Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).</li><li>Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+inclusions+of+respiratory+syncytial+virus-infected+cells:+formation+of+inclusion+bodies+in+transfected+cells+that+coexpress+the+nucleoprotein,+the+phosphoprotein,+and+the+22K+protein.">Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein.</a> Virology. 195 (1), 243-247 (1993).</li><li>Brown, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+association+between+heat+shock+protein+70+and+the+respiratory+syncytial+virus+polymerase+complex+within+lipid-raft+membranes+during+virus+infection.">Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection.</a> Virology. 338 (1), 69-80 (2005).</li><li>Radhakrishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+analysis+of+purified+respiratory+syncytial+virus+particles+reveals+an+important+role+for+heat+shock+protein+90+in+virus+particle+assembly.">Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).</li><li>Racaniello, V. R., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloned+poliovirus+complementary+DNA+is+infectious+in+mammalian+cells.">Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells.</a> Science. 214 (4523), 916-919 (1981).</li><li>Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+rabies+viruses+from+cloned+cDNA.">Infectious rabies viruses from cloned cDNA.</a> The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).</li><li>Collins, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+infectious+human+respiratory+syncytial+virus+from+cloned+cDNA+confirms+an+essential+role+for+the+transcription+elongation+factor+from+the+5'+proximal+open+reading+frame+of+the+M2+mRNA+in+gene+expression+and+provides+a+capability+for+vaccine.">Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).</li><li>Rameix-Welti, M. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+replication+of+respiratory+syncytial+virus+in+cells+and+in+living+mice.">Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice.</a> Nature Communications. 5, 5104 (2014).</li><li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+(BRSV)+from+cDNA:+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture,+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter.">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).</li><li>Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+activity+and+molecular+mechanism+of+an+orally+active+respiratory+syncytial+virus+fusion+inhibitor.">Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).</li><li>Derscheid, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+respiratory+syncytial+virus+memphis+37+grown+in+HEp-2+cells+causes+more+severe+disease+in+lambs+than+virus+grown+in+vero+cells.">Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells.</a> Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).</li><li>McKimm-Breschkin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+plaque+assay+for+respiratory+syncytial+virus+-+direct+visualization+of+plaques+without+immunostaining.">A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus - direct visualization of plaques without immunostaining.</a> Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virology Journal. 7, 1-7 (2006).</li><li>Novina, C. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNAi+revolution.">The RNAi revolution.</a> Nature. 430 (6996), 161-164 (2004).</li><li>Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+inosine+5'-monophosphate+dehydrogenase+and+the+design+of+novel+inhibitors.">The structure of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors.</a> Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).</li><li>Beaucourt, S., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribavirin:+A+drug+active+against+many+viruses+with+multiple+effects+on+virus+replication+and+propagation.+Molecular+basis+of+ribavirin+resistance.">Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance.</a> Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).</li><li>Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Ribavirin+on+Respiratory+Syncytial+Virus+in+vitro.">Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).</li><li>Sim&#245;es, E. A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past,+Present+and+Future+Approaches+to+the+Prevention+and+Treatment+of+Respiratory+Syncytial+Virus+Infection+in+Children.">Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children.</a> Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).</li><li>Alvarez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-mediated+silencing+of+the+respiratory+syncytial+virus+nucleocapsid+defines+a+potent+antiviral+strategy.">RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).</li><li>DeVincenzo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+double-blind,+placebo-comtrolled+study+of+an+RNAi-based+therapy+directed+against+respiratory+syncytial+virus.">A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+a+CRISPR/Cas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells.">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).</li><li>Nikolic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negri+bodies+are+viral+factories+with+properties+of+liquid+organelles.">Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles.</a> Nature Communications. 8 (1), 58 (2017).</li></ol>

Hier präsentieren wir eine Methode zur Rettung des rekombinanten RSV aus fünf Plasmide und ihre Verstärkung. Die Fähigkeit zu manipulieren, das Genom der Viren revolutioniert Virologie-Forschung, um Mutationen zu testen und ein zusätzliches Gen oder ein tagged viral Protein ausdrücken. Der RSV haben wir beschrieben und als ein Beispiel in diesem Artikel ist ein Virus mit dem Ausdruck ein Reportergen, RSV-GLP (unveröffentlicht) und drückt eine M2-1-Protein mit einem GLP-Tag12verschmolzen. R...

Menschlichen RSV ist die führende Ursache der Hospitalisierung für akute Infektion der Atemwege in Säuglinge weltweit1. RSV ist darüber hinaus mit einer erheblichen Krankheitslast bei Erwachsenen vergleichbar mit Grippe, mit die meisten Krankenhausaufenthalt und Sterblichkeit in der ältere2Belastung verbunden. Gibt es keine Impfstoffe oder spezifische antivirale Medikamente noch gegen RSV, aber vielversprechende neue Medikamente sind in Entwicklung3,4. Die Komplexität und die Schwere der Techniken der Quantifizierung der RSV Multiplikation erschweren die Suche nach antivirale Medikamente oder Impfstoffe trotz erheblicher Anstrengungen. Die Quantifizierung der RSV Multiplikation in-vitro-basiert im Allgemeinen auf teure, mühsame und zeitraubende Methoden bestehen vor allem in der Analyse des zytopathischen Effekts durch Plaque-Reduzierung, Mikroskopie, Immunostaining Assays, quantitative (qRT) Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Enzym-linked Immunosorbentprobe Tests zu bestimmen. Viren mit modifizierten Genomen und mit dem Ausdruck Reporter-Gene, wie die Codierung für die GFP, eignen sich eher für solche Vorführungen. Gekoppelt an die Verwendung von automatisierten Platte Leser, machen Reporter-gen tragenden rekombinante Viren diese Assays für Standardisierung und Hochdurchsatz-Zwecke besser geeignet.
RSV ist eine behüllte, nonsegmented negativen Sinne RNA-Virus, das gehört zur Gattung der Pneumoviridae Familie, Ordnung Mononegavirales5 Orthopneumovirus . Der RSV-Genom ist eine Single-Strang, negativen Sinn RNA von ca. 15 kb, enthält eine forensisches Region an den 3' und 5' Extremitäten genannt Führer und Anhänger und 10 transkriptionelle Einheiten 11 Proteine codieren. Die Gene sind wie folgt sortiert: 3'-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (M2-1 und M2-2 Proteine kodieren) und L-5 ". Die genomische RNA ist fest Nucleoprotein N. Using Encapsidated genomische RNA als Vorlage verpackt, virale RNA-abhängige RNA-Polymerase (Trichothecene) Transkription und Replikation der viralen RNA zu gewährleisten. Virale Trichothecene besteht aus der großen Protein L trägt die Nukleotid-Polymeraseaktivität schlechthin, seine obligatorische Cofaktor Phosphoprotein P und das M2-1-Protein, das Funktionen wie eine virale Transkription Faktor6. In infizierten Zellen induziert RSV die Bildung von zytoplasmatischen Einschlüssen Einschlusskörperchen (IBs) genannt. Morphologisch ähnliche zytoplasmatischen Einschlüssen sind für mehrere Mononegavirales7,8,9,10beobachtet worden. Neuere Untersuchungen zu den Tollwut-Virus, vesikuläre Stomatitis-Virus (VSV) und Ebola-Virus RSV hat gezeigt, dass virale RNA-Synthese tritt in IBs, die somit als virale Fabriken8,9,11, angesehen werden kann 12. Virus Fabriken konzentrieren die RNA und virale Proteine für virale RNA-Synthese benötigt und enthalten auch zelluläre Proteine13,14,15,16, 17. IBs weisen eine funktionale Subkompartiment genannt IB-assoziierten Granulat (IBAGs), die sich darauf konzentrieren die neu dazu im Entstehen begriffenen viralen mRNA zusammen mit dem M2-1-Protein. Die genomische RNA und die L, P und N werden in IBAGs nicht erkannt. IBAGs sind kleine dynamische kugelförmigen Strukturen im Inneren IBs, die die Eigenschaften des flüssigen Organellen12aufweisen. Trotz der zentralen Rolle von IBs in virale Vermehrung ist sehr wenig über Natur, interne Struktur, Entstehung und Betrieb dieser viralen Fabriken bekannt.
Der Ausdruck des Genoms des Poliovirus aus einer cDNA aktiviert die Produktion des ersten ansteckende virale Klons in 198118. Für negative einzelsträngigen RNA-Viren fand es nicht bis 1994 die Produktion eines ersten Tollwut-Virus nach Transfektion von Plasmiden in Zellen19 statt. Das erste Plasmid-basierte reverse genetische System für RSV erschien 199520. Reverse Genetik führten zu großen Fortschritten auf dem Gebiet der Virologie. Die Möglichkeit der Einführung von spezifischen Änderungen in das virale Genom hat kritische Einblicke in die Replikation und Pathogenese von RNA-Viren zur Verfügung gestellt. Diese Technologie hat die Entwicklung von Impfstoffen auch erheblich erleichtert, indem es spezifische Dämpfung durch gezielte Reihe von Modifikationen erlaubt. Genom Änderungen erlauben eine schnelle Quantifizierung der viralen Vermehrung erheblich verbessert die antivirale Screening und Untersuchung von ihrer Wirkungsweise.
Obwohl zuvor beschrieben, bleibt die Erlangung genetisch veränderten RSV zart. Hier zeigen wir ein Protokoll erstelle ich zwei Arten von rekombinanten HRSV, RSV-GFP oder RSV-M2-1-GFP bzw. zum Ausdruck zu bringen. In diesem Protokoll beschreiben wir die Transfektion Voraussetzungen für die neue rekombinanten Viren, sowie ihre Verstärkung zu viralen Aktien mit hoher Titer, geeignet für reproduzierbare Experimente zu retten. Der Bau der reversen Genetik Vektoren ist per se nicht beschrieben. Wir beschreiben Methoden für die optimale ernten und Einfrieren von viralen Bestände. Die genaueste Methode, infektiöse Viruspartikel zu quantifizieren bleibt Plaque-Assay. Zellen sind infiziert mit seriellen Verdünnungen der analysierten Suspension und inkubiert mit einem Overlay, das verbietet die Verbreitung von freien Viruspartikel im Überstand. Unter solchen Bedingungen wird der Virus nur zusammenhängende Zellen, aus denen eine "Tafel" für jedes erste infektiöse Partikel infizieren. In der konventionellen RSV-Titration-Assay sind Gedenktafeln von Immunostaining aufgedeckt und unter mikroskopischer Beobachtung gezählt. Diese Methode ist teuer und zeitaufwändig. Hier haben wir ein sehr einfaches Protokoll für eine RSV-Plaque-Assay mikrokristalline Cellulose verwenden, die es die Bildung von Plaques, die mit bloßem Auge sichtbar ermöglicht. Wir zeigen, wie RSV-GFP Maßnahme RSV Replikation und damit zum verwendet werden kann die Auswirkungen der antiviralen Medikamenten zu quantifizieren. Kombination von reverse Genetik und live-imaging-Technologie, zeigen wir Ihnen wie RSV-M2-1-GFP ermöglicht es Wissenschaftlern, M2-1 in lebenden Zellen zu visualisieren und die Dynamik der intrazellulären viralen Strukturen wie IBs zu folgen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm &#181; dish for live cell imaging</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel RC-591</td>
			<td>FMC BioPolymer</td>
			<td>Avicel RC-591</td>
			<td>Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSRT7/5</td>
			<td></td>
			<td>not commercially available</td>
			<td>See ref 22. Buchholz et al, 1999</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT90132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for observations</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73 Olympus microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for videomicroscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>ScanR Olympus microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEp-2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (10X), no glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11430030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41090-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 ReagentPlus, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td>not commercially available</td>
			<td>see ref 21. Rameix-Welti et al, 2014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>See Saw Rocker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA GAPDH</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus siRNA 
			D-001810-10-05</td>
			<td>SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA IMPDH2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human 
			L-004330-00-0005</td>
			<td>SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. 
			Individual references and sequences 
			J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; 
			J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; 
			J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; 
			J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA RSV N</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus custom siRNA</td>
			<td>UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiRNA NT</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiRNA transfection reagent</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03</td>
			<td>Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate 7.5% solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Tecan infinite M200PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, amplification, and titration of recombinant respiratory syncytial viruses

Der Einsatz von rekombinanten Viren ist entscheidend in der Basis- oder angewandte Virologie geworden. Reverse Genetik ist nachgewiesen worden, werden eine extrem leistungsfähige Technologie, sowohl virale Replikationsmechanismen zu entschlüsseln und zu studieren antivirale Medikamente oder Impfstoffe Entwicklungsplattform vorsehen. Den Bau und die Manipulation von einem reverse genetische System für einen negativ-Strang RNA-Virus wie ein respiratory syncytial Virus (RSV), allerdings bleibt zart und erfordert spezielles Know-how. Der RSV-Genom ist eine Single-Strang, negativen Sinn RNA von ca. 15 kb, die als Vorlage für die virale RNA-Replikation und Transkription dient. Unser reverse Genetik-System nutzt eine cDNA-Kopie des RSV lange Belastung Humangenoms (HRSV). Diese cDNA sowie cDNAs Codierung virale Proteine der komplexen Polymerase (L, P, N und M2-1) befinden sich in einzelnen Expressionsvektoren unter T7 Polymerase Steuersequenzen. Die Transfektion dieser Elemente in BSR-T7/5 Zellen, die stabil T7 Polymerase ausdrücken, ermöglicht die zytoplasmatischen Replikation und Transkription der rekombinanten RSV zu gentechnisch veränderten Virionen. Eine neue RSV, die an der Zelloberfläche und in der Kultur Überstand des BSRT7/5 vorliegt, ist versammelt, um menschliche HEp-2 Zellen für virale Verstärkung zu infizieren. Zwei oder drei Runden der Verstärkung sind erforderlich, um virale Bestände mit 1 x 106 bis 1 x 107 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) / mL. Methoden für die optimale Ernte, Einfrieren und Titration der viralen Bestände sind hier ausführlich beschrieben. Wir illustrieren das Protokoll hier vorgestellten durch die Schaffung von zwei rekombinanter Viren bzw. Ausdruck freies grünes fluoreszierendes Protein (GFP) (RSV-GFP) oder viralen M2-1 mit GFP (RSV-M2-1-GFP) verschmolzen. Wir zeigen, wie mithilfe von RSV-GFP um RSV-Replikation und der RSV-M2-1-GFP viralen Strukturen sowie virale Proteindynamik in lebenden Zellen visualisieren mit Videomikroskopie Techniken zu quantifizieren.

In dieser Arbeit beschrieben, ein detailliertes Protokoll zur Herstellung rekombinanter RSV-Viren mit dem Ausdruck eines fluoreszierenden Proteins (Abbildung 2). Im pRSV-GFP wurde das GFP-gen zwischen dem P und M gen eingeführt, wie für die Kirsche gen zuvor veröffentlichte Arbeit21beschrieben. In pRSV-M2-1-GFP das M2-gen war unangetastet gelassen und ein zusätzliches Gen Kodierung für M2-1-GFP zwischen SH und G Gene<sup class="xr...

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Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung und Verstärkung genetisch modifiziert respiratory syncytial Viren (RSV) und eine optimierte Plaque-Assay für RSV. Wir veranschaulichen dieses Protokolls durch die Schaffung von zwei rekombinanter Viren, die Quantifizierung der RSV-Replikation ermöglichen bzw. live-Analyse des RSV Einschlusskörperchen und Einschlusskörperchen-assoziierten Granulat Dynamik.

Erzeugung, Verstärkung und Titration von rekombinanten Respiratory Syncytial Viren

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Der Einsatz rekombinanter Viren ist eine leistungsstarke Technologie, um sowohl die Virusreplikationsmechanismen zu entschlüsseln als auch Entwicklungsplattformen für Impfstoffe bereitzustellen. Ebenso ist die Erzeugung von qualitativ hochwertigen Virusbeständen für jede virale Studie von der grundlagendsten Forschung bis zu den angewandten Studien von entscheidender Bedeutung. Die Rettung rekombinanter Viren, die optimale Ernte, das Einfrieren und die Titration von RSV-Beständen sind entscheidende Methoden für alle virologischen Studien.Sie können als traditionell betrachtet werden, bleiben aber heikel und erfordern spezifisches Fachwissen. Am Tag vor der Transfektion bSR-T7/5-Zellen in vollständigem Medium bei 0,5 Millionen Zellen pro Milliliter Konzentration aussetzen. Verteilen Sie zwei Milliliter der Zellsuspension pro Brunnen in einer Sechs-Well-Platte.Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid, bis sie am nächsten Tag 80-90% Konfluenz erreichen. Um jedes Virus zu retten, mischen Sie zuerst aufgetaute Reverse-Genetik-Vektoren in einer Röhre, dann gehen Sie zur Transfektion, nach dem Transfektionreagenz-Hersteller-Protokoll. Als nächstes fügen Sie 250 Mikroliter des reduzierten Serummediums zu den gemischten Vektoren hinzu.In einem anderen Rohr 10 Mikroliter dieses Transfektionsreagenzes in 250 Mikroliter des reduzierten Serummediums verdünnen. Sanft wirbeln beide Röhren und warten Sie für fünf Minuten. Mischen Sie den Inhalt beider Rohre und warten Sie 20 Minuten bei Raumtemperatur.In der Zwischenzeit spülen Sie die BSR-T7/5-Zellen mit einem Milliliter des reduzierten Serummediums ab und verteilen Sie 1,5 Milliliter an minimalen essentiellen Medienantibiotika frei, ergänzt mit 10% fetalem Kalbsserum pro Brunnen. Bei Bedarf bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid-Umgebung inkubieren. Nach der 20-minütigen Inkubation 500 Mikroliter der Transfektionsmischung in jeden Brunnen geben.Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid-Umgebung für drei Tage. Um die Rettungseffizienz zu überwachen, beobachten Sie bei GFP Fluoreszenz unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop bei 20-facher Vergrößerung einmal pro Tag. Am dritten Tag der Transfektion kratzen Zellen in jedem Brunnen der transfizierten BSR-T7/5 Sechs-Well-Platte.Übertragen Sie Zellen und Überstand von jedem Brunnen in eine sterile Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhre. Um das gerettete Virus aus den Zellmembranen zu lösen, wirbeln Sie jede Röhre mindestens 30 Sekunden lang kräftig aus. Für die erste Verstärkung der geretteten Viren, entfernen Sie zuerst das Kulturmedium aus der HEp-2-Platte, die am Vortag gesät wurde, dann schnell 500 Mikroliter pro Brunnen der frischen Passage-Null-Virussuspension hinzufügen.Legen Sie die HEp-2-Platte bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden auf eine Wippe, um sanft zu rühren. Um die erste Passage der geretteten Viren zu produzieren, entsorgen Sie 500 Mikroliter des Inokulums und fügen Sie zwei Milliliter MEM mit 2%FCS hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für drei Tage.Um die Infektion unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop bei 20-facher Vergrößerung zu überwachen, beobachten Sie die GFP-Fluoreszenz der HEp-2-Zellen, die einmal pro Tag mit der Passage-Null-Suspension infiziert sind. Beobachten Sie unter einem Hellfeldmikroskop das Auftreten von kleiner Synzytia und Zellablösung, die den zytopathischen RSV-Effekt widerspiegelt. Um die geretteten Viren zu verstärken, verdünnen Sie zunächst die virale Suspension des FCS-freien MEM, um eine Drei-Milliliter-Suspension bei 50 000 PFU pro Milliliter zu erhalten, und entfernen Sie dann das Medium aus dem HEp-2-Kolben.Fügen Sie schnell die drei Milliliter virale Suspension hinzu und inkubieren Sie den Kolben bei 37 Grad Celsius auf einer Wippe Für weiche Serregung für zwei Stunden. Als nächstes entfernen und entsorgen Sie das Inoculum und fügen Sie 15 Milliliter MEM mit 2%FCS hinzu. Bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für zwei bis vier Tage inkubieren.Um den richtigen Zeitpunkt für die Ernte der Viren zu schätzen, überprüfen Sie die Zellmorphologie und GFP-Fluoreszenz unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop bei 20-facher Vergrößerung. Beachten Sie, dass dies in der Regel der Fall ist, wenn 50% bis 80% der HEp-2-Zellschicht aufgrund der zytopathischen RSV-Wirkung, die zwischen 48 und 72 Stunden nach der Infektion auftritt, abgetrennt wird. Als nächstes kratzen Sie alle Zellen mit einem Zellschaber.Sammeln Sie sowohl die Zellen als auch den Überstand zusammen und übertragen Sie sie in ein 50-Milliliter-Zentrifugenrohr. Fügen Sie 1/10 des Volumens der 10X RSV-Konservierungslösung hinzu. Wirbeln Sie die Rohre kräftig für fünf Sekunden und Zentrifuge für fünf Minuten bei 200 mal g, um die Suspension zu klären.Übertragen Sie den Überstand in ein 50-Milliliter-Rohr. Wirbel kurz und aliquot die Suspension in kryogenen Röhren mit alkoholbeständigen Tags gekennzeichnet. Tauchen Sie die Röhre mindestens eine Stunde lang in vorgekühlten, minus 80 Grad Celsius Alkohol ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius.Um eine Plaque-Titration Assay durchzuführen, machen Sie zuerst 2X minimum wesentliche Medium durch Verdünnung kommerziellen 10X MEM mit sterilem Wasser und Zugabe von L-Glutamin, 1 000 Einheiten pro Milliliter Penicillin, und ein Milligramm pro Milliliter Streptomycin. Schütteln Sie die Verdünnung kräftig und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius, dann fügen Sie 900 Mikroliter des FCS-freien MEM zu sechs Röhren hinzu. Tauen Sie das Virus aliquots und wirbeln sie kräftig für fünf Sekunden.Um serielle Verdünnungen zu machen, fügen Sie zuerst 100 Mikroliter des Virus zu 900 Mikroliter des Mediums in der ersten Röhre hinzu. Legen Sie die Kappe auf das Rohr und mischen Sie seinen Inhalt durch Wirbeln für ein paar Sekunden, dann fügen Sie 100 Mikroliter der ersten Verdünnung zu 900 Mikroliter des Mediums in der zweiten Röhre. Setzen Sie die Kappe auf das Rohr und Wirbel.Wiederholen Sie diesen Vorgang bis zum sechsten Rohr. Schreiben Sie den Virusnamen und die vollständigen Verdünnungen auf die HEp-2 12-Well-Platten. Fügen Sie eine Markierung hinzu, die zu der Platte und ihrer Abdeckung passt, da sie während der Färbung getrennt werden können.Entfernen Sie das Medium von den Platten und verteilen Sie 400 Mikroliter einer Verdünnung pro Brunnen. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden für Virusadsorption. Bereiten Sie während der Virusadsorption das mikrokristalline Cellulose-Overlay vor, indem Sie zunächst den pH-Wert des 2X MEM auf etwa 7,2 mit einer sterilen Natriumbicarbonatlösung auf 7,5 % nach dem Farbindikator einstellen.Um 100 Milliliter des Overlays zu erhalten, fügen Sie 10 Milliliter 2X MEM, 10 Milliliter 2,4% monokristalline Cellulosesuspension und 80 Milliliter des MEM mit 2%FCS und kräftig mischen. Am Ende der zweistündigen Inkubation zwei bis drei Milliliter der Überlagerung zu jedem Brunnen der 12-Well-Platten hinzufügen, ohne das Inokulum zu entfernen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für sechs Tage.Um die Zellen mit kristallvioletter Lösung zu färben, schütteln Sie zunächst sanft die Platten, um die mikrokristalline Cellulose-Overlay abzunehmen. Entfernen Sie die Überräube und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1X PBS, dann fügen Sie ein bis zwei Milliliter der kristallvioletten Lösung und warten Sie 10 bis 15 Minuten. Entfernen Sie die Lösung, die für die nachfolgende Plattenfärbung wiederverwendet werden kann.Berechnen Sie schließlich die Virustitter als Bruchteil der Anzahl der sichtbaren Plaques in den Brunnen der Trockenenplatten und des Inokulumvolumens und der Verdünnung. Die Durchführung eines Plaque-Assays auf die Negativkontrolle, transfiziert mit nur der Expression Plasmide von N, P, L, und M2-1 ergab keine Plaque bei der niedrigsten Verdünnung. Die Titer, die aus den transfizierten Zellen gewonnen wurden, sollten über 100 PFU pro Milliliter liegen, wenn die Rettung effizient war.Die Titer stiegen über die Passagen auf eine Million bis 10 Millionen PFU pro Milliliter in Durchgang eins oder zwei. Dank dieser fluoreszierenden Viren kann die Hemmung der RSV-Expression durch siRNA, die auf das Protein N und das Zellprotein IMPDH abzielt, leicht beobachtet und gemessen werden. Im Gegensatz dazu wurde ein starkes GFP-Signal an Kontrollzellen beobachtet, die mit nicht zielgerichteter siRNA transfiziert wurden, oder Zellen, die mit siRNA gegen das zelluläre Protein GAPDH transfiziert wurden, und gemessen.Ebenso ermöglichten diese Viren eine einfache Beobachtung der Hemmung der RSV-Multiplikation durch eine antivirale Wirkstoffverbindung. Die Verfolgung des fluoreszierenden Proteins M2-1 in HEp-2-infizierten Zellen zeigte IBs und IB-assoziierte Granulate als sehr dynamische Strukturen. IBs wurden als mobile und kugelförmige Strukturen beobachtet, die in der Lage sind, zu verschmelzen und größere kugelförmige Einschlüsse zu bilden.IB-assoziierte Granulate durchliefen kontinuierliche Montage-Demontage-Zyklen mit der Bildung von kleinen IB-assoziierten Granulaten, die wuchsen, zu großen IB-assoziierten Granulaten verschmolzen und dann verschwanden. Das Protokoll der Plaquetitration von RSV mit mikrokristalliner Zellulose-Overlay kann leicht an andere Zellen und/oder andere Viren angepasst werden. Es erfordert eine Anpassung der Konzentration der mikrokristallinen Cellulose.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolierung von Fidelity Varianten von RNA-Viren und Charakterisierung von Virus-Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Produktion und Titrierung von rekombinanten Adeno-assoziierte virale Vektoren

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Proteinfehlfaltungen Cyclic Amplification von Prionen

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Aufbau einer Liquid-bedeckten Kultur Polarized Menschliche Airway Epithelial Calu-3-Zellen, um Host-Zell-Antwort, um Atemwegspathogene Studie<em&gt; In-vitro-</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Erzeugung von rekombinanten Arenavirus für die Impfstoffentwicklung in FDA-zugelassenen Vero-Zellen

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Die intranasale Verabreichung von rekombinantem Influenza Vaccines in chimären Maus-Modelle zu Mucosale Immunität Studieren

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...