Name: generation, amplification, and titration of recombinant respiratory syncytial viruses
Uploaded: 2019-04-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses at JoVE.com

著者は、AZD4316 医薬品を提供するためアストラゼネカ ・ R & D ボストン、マサチューセッツ州、米国から博士秦湯に感謝します。著者、Cymages プラットフォームを ScanR オリンパス顕微鏡へのアクセスに感謝してこれに支えられ地域イル (薄暗い 1 つ健康) から助成金します。著者は、INSERM とベルサイユ サンカンタンにある大学からのサポートを認めます。

1 材料の準備
<ol><li>携帯メディアを購入 (減らされた血清メディア、最低限不可欠なメディア [MEM]、MEM、およびダルベッコ x 10 のイーグル培地 [DMEM] を更新)、トランスフェクション試薬と微結晶セルロース (材料の表を参照)。</li>
	<li>次ベクトル逆遺伝学: ゲノムの vector(s) と N 蛋白質およびポリメラーゼ複合タンパク質をエンコード表現のベクトル。ゲノムのベクトルは、バク?...

<ol>
	<li>Shi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+disease+burden+estimates+of+acute+lower+respiratory+infections+due+to+respiratory+syncytial+virus+in+young+children+in+2015:+a+systematic+review+and+modelling+study.">Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study.</a> The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).</li><li>Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+Syncytial+Virus+Infection+in+Elderly+and+High-Risk+Adults.">Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults.</a> The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).</li><li>DeVincenzo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+Oral+ALS-008176+in+a+Respiratory+Syncytial+Virus+Challenge+Study.">Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).</li><li>DeVincenzo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+GS-5806+Activity+in+a+Respiratory+Syncytial+Virus+Challenge+Study.">Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).</li><li>Afonso, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales:+update+2016.">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016.</a> Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).</li><li>Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+elongation+factor+of+respiratory+syncytial+virus,+a+nonsegmented+negative-strand+RNA+virus.">Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+bodies+are+a+site+of+ebolavirus+replication.">Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication.</a> Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).</li><li>Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+expression+redirects+vesicular+stomatitis+virus+RNA+synthesis+to+cytoplasmic+inclusions.">Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions.</a> PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958 (2010).</li><li>Lahaye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Characterization+of+Negri+Bodies+(NBs)+in+Rabies+Virus-Infected+Cells:+Evidence+that+NBs+Are+Sites+of+Viral+Transcription+and+Replication.">Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication.</a> Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).</li><li>Kolesnikova, L., M&#252;hlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+organization+of+recombinant+Marburg+virus+nucleoprotein:+comparison+with+Marburg+virus+inclusions.">Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions.</a> Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).</li><li>Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marburg+virus+inclusions:+A+virus-induced+microcompartment+and+interface+to+multivesicular+bodies+and+the+late+endosomal+compartment.">Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment.</a> European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).</li><li>Rincheval, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+cytoplasmic+inclusion+bodies+in+cells+infected+by+respiratory+syncytial+virus.">Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus.</a> Nature Communications. 8 (1), 563 (2017).</li><li>Santangelo, P. J., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+filamentous+viral+RNPs+prior+to+egress.">Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).</li><li>Lifland, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Nucleoprotein+and+Inclusion+Bodies+Antagonize+the+Innate+Immune+Response+Mediated+by+MDA5+and+MAVS.">Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS.</a> Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).</li><li>Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+inclusions+of+respiratory+syncytial+virus-infected+cells:+formation+of+inclusion+bodies+in+transfected+cells+that+coexpress+the+nucleoprotein,+the+phosphoprotein,+and+the+22K+protein.">Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein.</a> Virology. 195 (1), 243-247 (1993).</li><li>Brown, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+association+between+heat+shock+protein+70+and+the+respiratory+syncytial+virus+polymerase+complex+within+lipid-raft+membranes+during+virus+infection.">Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection.</a> Virology. 338 (1), 69-80 (2005).</li><li>Radhakrishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+analysis+of+purified+respiratory+syncytial+virus+particles+reveals+an+important+role+for+heat+shock+protein+90+in+virus+particle+assembly.">Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).</li><li>Racaniello, V. R., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloned+poliovirus+complementary+DNA+is+infectious+in+mammalian+cells.">Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells.</a> Science. 214 (4523), 916-919 (1981).</li><li>Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+rabies+viruses+from+cloned+cDNA.">Infectious rabies viruses from cloned cDNA.</a> The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).</li><li>Collins, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+infectious+human+respiratory+syncytial+virus+from+cloned+cDNA+confirms+an+essential+role+for+the+transcription+elongation+factor+from+the+5'+proximal+open+reading+frame+of+the+M2+mRNA+in+gene+expression+and+provides+a+capability+for+vaccine.">Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).</li><li>Rameix-Welti, M. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+replication+of+respiratory+syncytial+virus+in+cells+and+in+living+mice.">Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice.</a> Nature Communications. 5, 5104 (2014).</li><li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+(BRSV)+from+cDNA:+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture,+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter.">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).</li><li>Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+activity+and+molecular+mechanism+of+an+orally+active+respiratory+syncytial+virus+fusion+inhibitor.">Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).</li><li>Derscheid, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+respiratory+syncytial+virus+memphis+37+grown+in+HEp-2+cells+causes+more+severe+disease+in+lambs+than+virus+grown+in+vero+cells.">Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells.</a> Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).</li><li>McKimm-Breschkin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+plaque+assay+for+respiratory+syncytial+virus+-+direct+visualization+of+plaques+without+immunostaining.">A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus - direct visualization of plaques without immunostaining.</a> Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virology Journal. 7, 1-7 (2006).</li><li>Novina, C. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNAi+revolution.">The RNAi revolution.</a> Nature. 430 (6996), 161-164 (2004).</li><li>Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+inosine+5'-monophosphate+dehydrogenase+and+the+design+of+novel+inhibitors.">The structure of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors.</a> Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).</li><li>Beaucourt, S., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribavirin:+A+drug+active+against+many+viruses+with+multiple+effects+on+virus+replication+and+propagation.+Molecular+basis+of+ribavirin+resistance.">Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance.</a> Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).</li><li>Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Ribavirin+on+Respiratory+Syncytial+Virus+in+vitro.">Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).</li><li>Sim&#245;es, E. A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past,+Present+and+Future+Approaches+to+the+Prevention+and+Treatment+of+Respiratory+Syncytial+Virus+Infection+in+Children.">Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children.</a> Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).</li><li>Alvarez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-mediated+silencing+of+the+respiratory+syncytial+virus+nucleocapsid+defines+a+potent+antiviral+strategy.">RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).</li><li>DeVincenzo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+double-blind,+placebo-comtrolled+study+of+an+RNAi-based+therapy+directed+against+respiratory+syncytial+virus.">A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+a+CRISPR/Cas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells.">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).</li><li>Nikolic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negri+bodies+are+viral+factories+with+properties+of+liquid+organelles.">Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles.</a> Nature Communications. 8 (1), 58 (2017).</li></ol>

ここで 5 つのプラスミドから組換え RSVs の救助の方法とその増幅を提案します。ウイルスのゲノムを操作する機能の突然変異をテストし、追加の遺伝子やタグ ウイルスの蛋白質を表現するウイルス学革命をもたらしました。RSV について説明し、この記事の例はレポーターの遺伝子、RSV GFP (未発表)、M2 1 タンパク質 GFP タグ12融合した表現を発現するウイルスとして使用しま?...

人間 RSV は、幼児の世界1入院急性上気道感染症の主要な原因です。また、RSV は成人インフルエンザ、ほとんどの入院および死亡率の負担で高齢者2と同等の実質的な疾病に関連付けられます。ないワクチンまたは特定の抗ウイルス薬まだ rsv、しかし、有望な新薬は、開発3,4。複雑さと RSV の乗算の定量化技術の重さは、抗ウイルス剤やワクチンは現在相当な努力にもかかわらずの検索を妨げます。RSV 乗算体外の定量化は一般的に骨の折れる、時間がかかり、高価なメソッドで、顕微鏡、染色、プラーク除去アッセイ、定量的細胞変性効果の解析を中心に構成に基づいてください。逆転写酵素 (qRT)-ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR)、酵素抗体アッセイのテスト。変更されたゲノムなどのレポーター遺伝子発現とウイルスは、GFP のコーディング、そのようなスクリーニングに適しています。自動プレート リーダーの使用を組み合わせることで、レポーター遺伝子組換えウイルスの遺伝子を運ぶことができますこれらの試標準化と高スループットのために適して。
RSV はエンベロープ、処理負センス RNA ウイルスPneumoviridae家族、順序モノネガ ウイルス目5のOrthopneumovirus属に属するです。RSV ゲノム リーダーとトレーラーと 10 転写ユニット 11 タンパク質をエンコードと呼ばれる 3' と 5' の四肢の非翻訳領域を含む約 15 kb の一本鎖、否定的な感覚の RNA であります。遺伝子の順序: 3'-NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2 (M2 1 そして M2 2 蛋白質のためエンコード)、L-5'。ゲノム RNA はしっかり蛋白テンプレートとして N を使用以上のゲノム RNA によってパッケージ化、ウイルスの RNA 依存した RNA ポリメラーゼ (RdRp) は転写とウイルス RNA の複製になります。ウイルスの酵素はヌクレオチド合成酵素活性をそれ自体運ぶ大きい蛋白質 L から成る、その必須の補酵素 P リン蛋白質およびウイルスの転写として機能する M2 1 蛋白質因子6。感染した細胞は、RSV は封入体 (IBs) と呼ばれる細胞質包有物の形成を誘導します。いくつかモノネガ ウイルス目7,8,9,10の類似した形態の細胞質包有物が観察されています。狂犬病ウイルス、水胞性口炎ウイルス (VSV)、エボラ ウイルス、ibs は、みなすことができる従ってウイルス工場8,9,11,ウイルスの RNA 合成が発生することを示した RSV に関する最近の研究12. ウイルス工場 RNA のウイルスの RNA 合成に必要なウイルス蛋白質の集中、また細胞蛋白質13,14,15,16,を含む17. IBs 展示集中する IB 関連顆粒 (IBAGs) と呼ばれる、機能班、新しく synthetized M2 1 蛋白質と共に新生ウイルス mRNA。ゲノム RNA と L、P、および N は、IBAGs では検出されません。IBAGs は、液体細胞小器官12の性質を示す IBs の中小さな動的球形構造です。ウイルスの増殖に IBs の中心的役割にもかかわらず自然、内部構造、形成、およびこれらのウイルスの工場の操作についてほとんど知られています。
CDNA からポリオ ウイルスのゲノムの発現には、1981年18で最初の感染ウイルスのクローンの生産が可能。一本鎖マイナス RNA ウイルスだった 1994 年まで次のプラスミドのトランスフェクション細胞19に最初の狂犬病ウイルスの生産が行われたこと。最初プラスミドを用いた逆遺伝システム RSV は 1995年20に掲載されました。逆遺伝学ウイルス学の分野に大きな進歩をもたらした。ウイルスのゲノムに特定の変更を導入する可能性は、レプリケーションおよび RNA ウイルスの病因に重要な洞察力を提供しています。この技術も大幅変更の対象となる一連の特定の減衰によりワクチンの開発を促進しています。大きく急速なウイルスの増殖の定量化を許可するゲノムの変更が改善されたは、抗ウイルスのスクリーニングとアクションの彼らのモードの研究.
説明したが微妙なまま遺伝子組み換え RSVs を取得します。ここでは、我々 はそれぞれ表現 RSV GFP や RSV M2 1 GFP 遺伝子組換えの HRSV の 2 種類を作成するためのプロトコルを詳しく説明します。このプロトコルでは高価、再現性のある実験に適したウイルス株を取得する彼らの増幅と同様、新しい遺伝子組換えウイルスを救出するために必要なトランスフェクション条件について述べる。逆遺伝学のベクトルの建設自体がないここで説明します。最適な収穫・ ウイルス株の凍結方法について述べること。ウイルスの感染性粒子を定量化する最も正確な方法のままプラクの試金。細胞分析の懸濁液のシリアル希薄に感染して、培養上清で無料のウイルス粒子の拡散を禁止するオーバーレイを使って。このような条件でセルごとの初期感染粒子の「プラーク」を形成はウイルスに感染のみ。従来の RSV 滴定分析では、プラクは免疫染色によって明らかに、顕微鏡下でカウントします。このメソッドは高価で時間がかかるです。ここで我々 は肉眼に目に見えないプラークの形成を可能にする微結晶性セルロースのオーバーレイを使用して RSV プラクの試金のための非常に単純なプロトコルを説明します。RSV レプリケーションを測定して、したがって、する、RSV GFP を使用する方法を示す抗ウイルス剤の影響を定量化します。逆遺伝学、ライブ イメージング技術を組み合わせて、RSV M2 1 GFP により生細胞における M2 1 を視覚化し、IBs などの細胞内のウイルス構造のダイナミクスに従うの科学者、方法を紹介します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm &#181; dish for live cell imaging</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel RC-591</td>
			<td>FMC BioPolymer</td>
			<td>Avicel RC-591</td>
			<td>Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSRT7/5</td>
			<td></td>
			<td>not commercially available</td>
			<td>See ref 22. Buchholz et al, 1999</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT90132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for observations</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73 Olympus microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for videomicroscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>ScanR Olympus microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEp-2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (10X), no glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11430030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41090-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 ReagentPlus, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td>not commercially available</td>
			<td>see ref 21. Rameix-Welti et al, 2014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>See Saw Rocker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA GAPDH</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus siRNA 
			D-001810-10-05</td>
			<td>SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA IMPDH2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human 
			L-004330-00-0005</td>
			<td>SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. 
			Individual references and sequences 
			J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; 
			J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; 
			J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; 
			J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA RSV N</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus custom siRNA</td>
			<td>UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiRNA NT</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiRNA transfection reagent</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03</td>
			<td>Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate 7.5% solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Tecan infinite M200PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, amplification, and titration of recombinant respiratory syncytial viruses

組換えウイルスの使用は、基礎、応用のウイルス学で非常に重要になっています。逆遺伝学は、ウイルスの複製メカニズムを解読してする研究抗ウイルス薬やワクチンの開発プラットフォームを提供する両方の非常に強力な技術を実証されています。構築とマイナス鎖 RNA ウイルス呼吸器合胞体ウイルス (RSV) などの逆遺伝学的システムの操作ただし、微妙なまま、特別なノウハウが必要です。RSV ゲノム ウイルス RNA 複製と転写の両方のテンプレートとして機能する約 15 kb の一本鎖、否定的な感覚の RNA であります。私たちリバース ・ ジェネティクス システムは、人間の RSV 長い株ゲノム (HRSV) の cDNA コピーを使用します。この cDNA、Cdna 複雑なポリメラーゼのウイルス蛋白質 (L、P、N、および M2 1) と同様は、T7 ポリメラーゼ制御シーケンスの下の個々 の表現のベクトルに配置されます。T7 ポリメラーゼを安定して表現、BSR T7/5 細胞でこれらの要素のトランスフェクションにより細胞質の複製と遺伝子組換えの RSV の転写遺伝子組み換えウイルス粒子に上昇を与えます。ウイルスの増幅の HEp 2 細胞に感染する細胞表面の BSRT7/5 の培養上清中に存在である新しい RSV が収集されます。増幅の 2 つまたは 3 つのラウンドは、1 x 106 1 x 107プラーク形成単位 (PFU) を含むウイルス株を入手する必要が/mL。最適な収穫、凍結、及びウイルス株の滴定の方法は詳細のとおりです。私たちはそれぞれ無料緑色蛍光タンパク質 (GFP) (rs ウイルス ・ GFP) を表現する 2 つの遺伝子組換えウイルスを作成することによってここに示されるプロトコルを説明またはウイルス M2 1 GFP (RSV M2 1 GFP) の融合。RSV のレプリケーションおよびビデオ顕微鏡技術を用いた生細胞におけるウイルス タンパク質ダイナミクスと同様、ウイルスの構造を視覚化する RSV M2 1 GFP を定量化する rs ウイルス ・ GFP を使用する方法を示します。

この作品では、(図 2) の蛍光蛋白を発現する組換えの RSV ウイルスを生成する詳細なプロトコルについて説明しました。PRSV GFP、GFP 遺伝子は前述の過去に発表された21の桜遺伝子の P および M 遺伝子の間導入されました。PRSV-M2-1-GFP で M2 遺伝子は手つかずに残されたし、SH G 遺伝子12間挿入された M2 1 GFP の追加?...

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Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

生成する方法について述べる、RSVs の呼吸器合胞体ウイルス (RSVs) と最適化されたプラクの試金を変更遺伝子を増幅します。RSV レプリケーションの定量化しライブ RSV 封入体と顆粒の封入体のダイナミクスの分析、それぞれ 2 つの組換えウイルスを作成することによってこのプロトコルを示しています。

世代、増幅、および組換え呼吸器合胞体ウイルスの滴定

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

組換えウイルスの使用は、ウイルス複製メカニズムを解読し、ワクチンの開発プラットフォームを提供する強力な技術です。同様に、良質のウイルスストックの生成は、最も基本的な研究から応用研究まで、すべてのウイルス研究にとって非常に重要です。組換えウイルスの救出、最適な収穫、凍結、およびRSV株の滴定は、すべてのウイルス学的研究にとって重要な方法です。彼らは伝統的と見なされるかもしれませんが、繊細なままであり、特定の専門知識を必要とします。トランスフェクションの前日、BSR-T7/5細胞を完全培地で1ミリリットル当たり0.5百万細胞で中断する。6ウェルプレートにウェルあたり2ミリリットルの細胞懸濁液を分配する。翌日80~90%の合流に達するまで、5%の二酸化炭素で37°Cでプレートをインキュベートします。各ウイルスを救出するために、まずチューブ内の逆遺伝学のベクターを解凍混合し、トランスフェクション試薬メーカーのプロトコルに従ってトランスフェクションに進みます。次に、還元した血清培地の250マイクロリットルを混合ベクターに加える。別のチューブでは、このトランスフェクション試薬の10マイクロリットルを250マイクロリットルの還元血清培地で希釈する。両方のチューブを穏やかに渦し、5分間待ちます。両方のチューブの内容物を混ぜ、室温で20分待ちます。一方、BSR-T7/5細胞を1ミリリットルの減らされた血清培地でリンスし、1.5ミリリットルの最小必須培地抗生物質を1.5ミリリットル無料で配布し、1ウェルあたり10%の胎児子牛血清を添加する。必要に応じて、5%の二酸化炭素環境で摂氏37度でインキュベートします。20分間のインキュベーションの後、各井戸に500マイクロリットルのトランスフェクションミックスを加えます。5%の二酸化炭素環境で37°Cで細胞を3日間インキュベートする。救助効率を監視するには、1日1回20倍の蛍光顕微鏡で蛍光を反転してGFPで観察します。トランスフェクションの3日目に、トランスフェクションBSR-T7/5 6ウェルプレートの各ウェルに細胞を傷つける。細胞と上清を各ウェルに無菌2ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移す。細胞膜から救出されたウイルスを放出するために、各チューブを少なくとも30秒間激しく渦を起たむ。救出されたウイルスの最初の増幅のために、最初に前日に播種されたHEp-2プレートから培養培地を取り除き、次に新鮮な通路ゼロウイルス懸濁液のウェルあたり500マイクロリットルを素早く加える。HEp-2プレートをシーソーロッカーの上に摂氏37度で2時間置き、柔らかい攪拌を行います。救出されたウイルスの最初の通路を作り出すために、接種物の500マイクロリットルを捨て、2%FCSでMEMの2ミリリットルを加える。3日間の5%の二酸化炭素で37°Cでプレートをインキュベートします。20倍の蛍光顕微鏡下での感染をモニターするには、1日1回、通過ゼロ懸濁液に感染したHEp-2細胞の蛍光GFPを観察する。明視野顕微鏡下で、RSV細胞パシー効果を反映した小さな同期および細胞剥離の出現を観察する。救出されたウイルスを増幅するために、まずFCSフリーMEMのウイルス懸濁液を希釈し、1ミリリットル当たり50,000PFUで3ミリリットルの懸濁液を得てから、次いでHEp-2フラスコから培地を取り除く。3ミリリットルのウイルス懸濁液を素早く加え、シーソーロッカーに37°Cでフラスコを2時間の柔らかい攪拌のためにインキュベートします。次に、接種を取り除いて廃棄し、2%FCSで15ミリリットルのMEMを追加します。2~4日間、5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートする。ウイルスを収穫する適切な時期を推定するには、20倍の蛍光顕微鏡で細胞の形態とGFP蛍光をチェックします。これは通常、感染後48〜72時間の間に起こるRSV細胞パシー効果のためにHEp-2細胞層の50%〜80%が剥離される場合に注意してください。次に、セルスクレーパーを使用してすべてのセルをスクレイプします。細胞と上清の両方を一緒に収集し、50ミリリットルの遠心分離管に移します。10X RSV保全ソリューションのボリュームの1/10を追加します。チューブを5秒間激しく、遠心分離機を200回gで5分間ボルテックスして懸濁液を明らかにする。上清を50ミリリットルのチューブに移します。渦はアルコール耐性タグで標識された極低温管の懸濁液を短時間、アリコートする。チューブを少なくとも1時間冷やしてマイナス80度のアルコールに浸し、マイナス80度で保管します。プラーク滴定アッセイを行う場合は、まず、市販の10X MEMを滅菌水で希釈し、L-グルタミン、1ミリリットルペニシリンあたり1,000単位、ミリリットルレンサマイシンあたり1ミリグラムを添加して、2倍の最小必須培地を作ります。希釈液を激しく振り、摂氏4度で保存し、FCSフリーMEMの900マイクロリットルを6本のチューブに加えます。ウイルスのアリコートを解凍し、5秒間精力的にそれらを渦。連続希釈を行うために、最初のチューブ内の培地の900マイクロリットルにウイルスの100マイクロリットルを追加します。キャップをチューブに置き、数秒間渦を入れて内容物を混ぜ、第2チューブの培地の900マイクロリットルに最初の希釈液の100マイクロリットルを加えます。キャップをチューブと渦に置きます。6本目のチューブまでこの手順を繰り返します。HEp-2 12ウェルプレートにウイルス名と完全な希釈液を書いてください。プレートとカバーに合わせてマークを追加します。プレートから培地を取り出し、ウェルあたり1希釈の400マイクロリットルを分配します。ウイルス吸着のために2時間摂氏37度でプレートをインキュベートします。ウイルス吸着中、最初に2X MEMのpHを7.2程度に調整し、7.5%の無菌炭酸ナトリウム溶液を色表示に従って調製します。100ミリリットルのオーバーレイを得るために、2X MEMの10ミリリットル、2.4%単結晶セルロース懸濁液の10ミリリットル、および2%FCSを補ったMEMの80ミリリットルを加え、激しく混ぜます。2時間のインキュベーションの終わりに、接種を取り除かずに12ウェルプレートの各ウェルに2〜3ミリリットルのオーバーレイを加えます。5%の二酸化炭素で37°Cでプレートを6日間インキュベートします。結晶バイオレット溶液で細胞を染色するには、まずプレートを軽く振って微結晶セルロースオーバーレイを取り除きます。上清を取り除き、1X PBSで細胞を2回洗い、水晶紫色溶液を1~2ミリリットル加え、10~15分待ちます。溶液を取り除き、その後のプレート染色に再利用できます。最後に、ウイルス価をドライプレートのウェル内の目に見えるプラークの数の割合と、接種量と希釈量として計算します。陰性対照に対してプラークアッセイを行い、N、P、L、およびM2-1の発現プラスミドのみでトランスフェクトした場合、最も低い希釈ではプラークが認めなくなった。トランスフェクトされた細胞から得られた力乗器は、救助が効率的であれば、1ミリリットル当たり100 PFUを超えると予想された。力乗器は、通路1〜2のミリリットル当たり100万〜1000万PFUに達するために通路の上に増加しました。これらの蛍光ウイルスのおかげで、siRNAを標的とするsiRNAによるRSV発現の阻害は、インプDHタンパク質とを標的とし、容易に観察および測定することができる。これに対し、細胞タンパク質GAPDHに対してsiRNAをトランスフェクトした非標的siRNAまたは細胞をトランスフェクトしたコントロール細胞に対する強力なGFPシグナルを観察し、測定した。同様にこれらのウイルスは抗ウイルス薬化合物によるRSV増殖の阻害の容易な観察を可能にした。HEp-2感染細胞における蛍光タンパク質M2-1を追跡すると、IB関連顆粒とIB関連顆粒が非常に動的な構造として示された。IBは、より大きな球状の含み物を形成するために融合し、形成することができる移動式および球形構造として観察された。IB関連顆粒は、成長した小さなIB関連顆粒の形成と連続的な組み立て分解サイクルを受け、大きなIB関連顆粒に融合し、その後消失した。微結晶セルロースオーバーレイを用いたRSVのプラーク滴定のプロトコルは、他の細胞および/または他のウイルスに容易に適応され得る。それは、微結晶セルロースの濃度を調整する必要があります。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

ウイルスの変異頻度のRNAウイルスと特性の忠実性の変異の分離

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

組換えアデノ随伴ウイルスベクターの産生と力価測定

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

プリオンのタンパク質のミスフォールディングサイクリック増幅

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

呼吸器病原体に対する宿主細胞応答を研究するために偏ヒト気道上皮Calu-3細胞の液体に覆われた文化の確立<em&gt;インビトロ</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

FDAの承認を受けたVero細胞におけるワクチン開発のための組換えアレナウイルスの生成

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNAウイルスの広域スペクトルの化学抑制剤のためのハイスループットスクリーニング

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

キメラマウスモデルにおける組換えインフルエンザワクチンの鼻腔内投与は、粘膜免疫を研究するために、

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...