Name: generation, amplification, and titration of recombinant respiratory syncytial viruses
Uploaded: 2019-04-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Qin Yu fra AstraZeneca R & D Boston, MA, USA, for å gi AZD4316 stoffet. Forfatterne er takknemlig til Cymages plattform for tilgang til ScanR Olympus mikroskopet, som ble støttet av tilskudd fra regionen Ile-de-France (svak en helse). Forfatterne bekrefter støtte fra INSERM og Versailles Saint-Quentin universitetet.

1. materialet forberedelse
<ol><li>Kjøpe cellen media (redusert serum media, minimum essential media [minne], 10 x MEM og Dulbecco modifiserte Eagle's medium [DMEM]), hva reagens, og mikrokrystallinsk cellulose (se Tabell for materiale).</li>
	<li>Få følgende vektorer for omvendt genetikk: genomic vector(s) og uttrykk vektorer koding N protein og polymerase komplekse proteiner. Genomic vektorer inneholder full cDNA genomet av RSV-GFP (p-RSV-GFP) og RSV-M2-1GFP (p-RSV-M2-1GFP) nedstrøms fra bacterio...

<ol>
	<li>Shi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+disease+burden+estimates+of+acute+lower+respiratory+infections+due+to+respiratory+syncytial+virus+in+young+children+in+2015:+a+systematic+review+and+modelling+study.">Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study.</a> The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).</li><li>Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+Syncytial+Virus+Infection+in+Elderly+and+High-Risk+Adults.">Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults.</a> The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).</li><li>DeVincenzo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+Oral+ALS-008176+in+a+Respiratory+Syncytial+Virus+Challenge+Study.">Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).</li><li>DeVincenzo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+GS-5806+Activity+in+a+Respiratory+Syncytial+Virus+Challenge+Study.">Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).</li><li>Afonso, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales:+update+2016.">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016.</a> Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).</li><li>Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+elongation+factor+of+respiratory+syncytial+virus,+a+nonsegmented+negative-strand+RNA+virus.">Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+bodies+are+a+site+of+ebolavirus+replication.">Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication.</a> Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).</li><li>Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+expression+redirects+vesicular+stomatitis+virus+RNA+synthesis+to+cytoplasmic+inclusions.">Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions.</a> PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958 (2010).</li><li>Lahaye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Characterization+of+Negri+Bodies+(NBs)+in+Rabies+Virus-Infected+Cells:+Evidence+that+NBs+Are+Sites+of+Viral+Transcription+and+Replication.">Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication.</a> Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).</li><li>Kolesnikova, L., M&#252;hlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+organization+of+recombinant+Marburg+virus+nucleoprotein:+comparison+with+Marburg+virus+inclusions.">Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions.</a> Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).</li><li>Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marburg+virus+inclusions:+A+virus-induced+microcompartment+and+interface+to+multivesicular+bodies+and+the+late+endosomal+compartment.">Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment.</a> European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).</li><li>Rincheval, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+cytoplasmic+inclusion+bodies+in+cells+infected+by+respiratory+syncytial+virus.">Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus.</a> Nature Communications. 8 (1), 563 (2017).</li><li>Santangelo, P. J., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+filamentous+viral+RNPs+prior+to+egress.">Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).</li><li>Lifland, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Nucleoprotein+and+Inclusion+Bodies+Antagonize+the+Innate+Immune+Response+Mediated+by+MDA5+and+MAVS.">Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS.</a> Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).</li><li>Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+inclusions+of+respiratory+syncytial+virus-infected+cells:+formation+of+inclusion+bodies+in+transfected+cells+that+coexpress+the+nucleoprotein,+the+phosphoprotein,+and+the+22K+protein.">Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein.</a> Virology. 195 (1), 243-247 (1993).</li><li>Brown, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+association+between+heat+shock+protein+70+and+the+respiratory+syncytial+virus+polymerase+complex+within+lipid-raft+membranes+during+virus+infection.">Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection.</a> Virology. 338 (1), 69-80 (2005).</li><li>Radhakrishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+analysis+of+purified+respiratory+syncytial+virus+particles+reveals+an+important+role+for+heat+shock+protein+90+in+virus+particle+assembly.">Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).</li><li>Racaniello, V. R., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloned+poliovirus+complementary+DNA+is+infectious+in+mammalian+cells.">Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells.</a> Science. 214 (4523), 916-919 (1981).</li><li>Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+rabies+viruses+from+cloned+cDNA.">Infectious rabies viruses from cloned cDNA.</a> The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).</li><li>Collins, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+infectious+human+respiratory+syncytial+virus+from+cloned+cDNA+confirms+an+essential+role+for+the+transcription+elongation+factor+from+the+5'+proximal+open+reading+frame+of+the+M2+mRNA+in+gene+expression+and+provides+a+capability+for+vaccine.">Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).</li><li>Rameix-Welti, M. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+replication+of+respiratory+syncytial+virus+in+cells+and+in+living+mice.">Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice.</a> Nature Communications. 5, 5104 (2014).</li><li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+(BRSV)+from+cDNA:+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture,+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter.">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).</li><li>Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+activity+and+molecular+mechanism+of+an+orally+active+respiratory+syncytial+virus+fusion+inhibitor.">Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).</li><li>Derscheid, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+respiratory+syncytial+virus+memphis+37+grown+in+HEp-2+cells+causes+more+severe+disease+in+lambs+than+virus+grown+in+vero+cells.">Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells.</a> Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).</li><li>McKimm-Breschkin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+plaque+assay+for+respiratory+syncytial+virus+-+direct+visualization+of+plaques+without+immunostaining.">A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus - direct visualization of plaques without immunostaining.</a> Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virology Journal. 7, 1-7 (2006).</li><li>Novina, C. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNAi+revolution.">The RNAi revolution.</a> Nature. 430 (6996), 161-164 (2004).</li><li>Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+inosine+5'-monophosphate+dehydrogenase+and+the+design+of+novel+inhibitors.">The structure of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors.</a> Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).</li><li>Beaucourt, S., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribavirin:+A+drug+active+against+many+viruses+with+multiple+effects+on+virus+replication+and+propagation.+Molecular+basis+of+ribavirin+resistance.">Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance.</a> Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).</li><li>Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Ribavirin+on+Respiratory+Syncytial+Virus+in+vitro.">Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).</li><li>Sim&#245;es, E. A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past,+Present+and+Future+Approaches+to+the+Prevention+and+Treatment+of+Respiratory+Syncytial+Virus+Infection+in+Children.">Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children.</a> Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).</li><li>Alvarez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-mediated+silencing+of+the+respiratory+syncytial+virus+nucleocapsid+defines+a+potent+antiviral+strategy.">RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).</li><li>DeVincenzo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+double-blind,+placebo-comtrolled+study+of+an+RNAi-based+therapy+directed+against+respiratory+syncytial+virus.">A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+a+CRISPR/Cas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells.">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).</li><li>Nikolic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negri+bodies+are+viral+factories+with+properties+of+liquid+organelles.">Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles.</a> Nature Communications. 8 (1), 58 (2017).</li></ol>

Her presenterer vi en metode for redning av rekombinant RSVs fra fem plasmider, og deres forsterkning. Muligheten til å manipulere genomet av virus har revolusjonert virologi forskning for å teste mutasjoner og uttrykke en ekstra genet eller et merket viral protein. RSV vi har beskrevet og brukes som et eksempel i denne artikkelen er et virus uttrykke en reporter genet, RSV-GFP (upublisert) og uttrykker en M2-1 protein smeltet sammen til en GFP kode12. RSV redning er utfordrende og krever praksi...

Menneskelige RSV er den ledende årsaken til sykehusinnleggelse for akutt luftveisinfeksjon i spedbarn verden1. I tillegg er RSV forbundet med en betydelig sykdomsbyrde hos voksne sammenlignes med influensa, med de fleste sykehusinnleggelse og dødelighet byrden i eldre2. Det er ingen vaksiner eller bestemte antivirale tilgjengelig ennå mot RSV, men lovende nye stoffer er i utvikling3,4. Kompleksiteten og tyngde teknikker for kvantifisering av RSV multiplikasjon hindre Søk etter antivirale eller vaksiner til tross for dagens betydelig innsats. Kvantifisering av RSV multiplikasjon i vitro er vanligvis basert på arbeidskrevende, tidkrevende og kostbare metoder, som består hovedsakelig i analyse av cytopathic effekten av plakk reduksjon, mikroskopi, immunostai-analyser, kvantitativ revers transkriptase (qRT)-polymerasekjedereaksjons (PCR) og enzym knyttet immunosorbent analysen tester. Virus med endrede genomer og uttrykke reporter gener, som de koding for GFP, er mer egnet for slike visninger. Kombinert bruk av automatiserte plate lesere, kan reporter gen-bærer rekombinant virus gjøre disse analyser mer egnet for standardisering og høy gjennomstrømming.
RSV er en innhyllet, nonsegmented negative-sense RNA virus som tilhører Orthopneumovirus slekten Pneumoviridae familie, ordre Mononegavirales5. RSV genomet er en enkelt-strand, negativ-sense RNA ca 15 KB, som inneholder et noncoding område på 3 og 5' ekstremiteter kalt leder og tilhenger og 10 transcriptional enheter koding 11 proteiner. Gener er organisert slik: 3-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (koding for M2-1 og M2-2 proteiner) og L-5'. Den genomisk RNA er tett pakket av nucleoprotein N. bruke encapsidated genomisk RNA som en mal, viral RNA-avhengig RNA polymerase (RdRp) vil sikre transkripsjon og replikering av viral RNA. Viral RdRp består av store protein L som bærer nukleotid polymerase aktiviteten i seg selv, sin obligatorisk kofaktor fosfoprotein som P og M2-1 protein som fungerer som en viral transkripsjon faktor6. I infiserte celler induserer RSV dannelsen av cytoplasmatiske Inneslutninger kalt inkludering organer (IBs). Morphologically lignende cytoplasmatiske inclusions har observert flere Mononegavirales7,8,9,10. Nyere studier på rabiat virus, vesicular stomatitt virus (VSV), Ebolaviruset og RSV viste at viral RNA syntese oppstår i IBs, som kan dermed betraktes som viral fabrikker8,9,11, 12. virus fabrikkene konsentrere RNA og virale proteiner kreves for viral RNA syntese og også inneholde mobilnettet proteiner13,14,15,16, 17. IBs viser en funksjonell subcompartment kalt IB-assosiert granulater (IBAGs), som konsentrere det nylig synthetized begynnende viral mRNA sammen med M2-1 protein. Den genomisk RNA og L, P og N gjenkjennes ikke i IBAGs. IBAGs er små dynamisk sfærisk strukturer inne IBs som viser egenskapene for flytende organeller12. Til tross for den sentrale rollen av IBs i viral multiplikasjon, er svært lite kjent om naturen, intern struktur, formasjon og drift av disse viral fabrikker.
Uttrykket i genomet til en poliovirus fra en cDNA aktivert produksjonen av den første smittsomme viral klone i 198118. For enkelt-strandet negative RNA-virus var det ikke før 1994 at produksjonen av første Rabiat virus etter transfection av plasmider i celler19 fant sted. Den første plasmider-baserte omvendt genetisk systemet for RSV ble utgitt i 199520. Omvendt genetikk har ført til store fremskritt innen virologi. Muligheten til å innføre endringer i viral genomet har gitt kritisk innsikt i replikering og patogenesen av RNA-virus. Denne teknologien har også mye lettere utviklingen av vaccines ved at bestemte demping gjennom målrettet rekke modifikasjoner. Genova endringer slik at en rask kvantifisering av viral multiplikasjon sterkt forbedret antiviral screening og studie av deres virkemåte.
Selv om tidligere beskrevet, fortsatt skaffe genmodifiserte RSVs delikate. Her, detalj vi en protokoll for å opprette to typer rekombinant HRSV, henholdsvis uttrykke RSV-GFP eller RSV-M2-1-GFP. I denne protokollen beskrive vi hva betingelsene for å redde de nye rekombinant virusene, samt deres forsterkning å få viral aksjer med høy titer, egnet for reproduserbar experimentations. Byggingen av den omvendte genetikk vektorer beskrives sådan ikke her. Vi gjør beskrive metoder for optimal høsting og frysing av viral aksjer. Den mest nøyaktige metoden å kvantifisere viral smittsomme partikler forblir plakk analysen. Celler er infisert med føljetong fortynninger av analysert suspensjon og inkubert med overlegg som forbyr spredningen av gratis virus partikler i nedbryting. I slike forhold, vil viruset bare infisere sammenhengende celler danner en "plakk" for hver første smittsomme partikkel. I konvensjonell RSV titrering analysen, er plaketter avslørt av immunostaining og regnet under mikroskopisk observasjon. Denne metoden er dyrt og tidkrevende. Her beskrev vi en veldig enkel protokoll for RSV plakk analysen bruker mikrokrystallinsk cellulose overlegg som gjør at dannelsen av plaketter synlig for det blotte øye. Vi viser hvordan RSV-GFP kan brukes å mål RSV replikering, og dermed å kvantifisere effekten av antivirale midler. Kombinere omvendt genetikk og live bildeteknologi, viser vi hvordan RSV-M2-1-GFP tillater forskere å visualisere M2-1 i levende celler og følge dynamikken i intracellulær viral strukturer, for eksempel IBs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm &#181; dish for live cell imaging</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel RC-591</td>
			<td>FMC BioPolymer</td>
			<td>Avicel RC-591</td>
			<td>Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSRT7/5</td>
			<td></td>
			<td>not commercially available</td>
			<td>See ref 22. Buchholz et al, 1999</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT90132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for observations</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73 Olympus microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for videomicroscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>ScanR Olympus microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEp-2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (10X), no glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11430030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41090-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 ReagentPlus, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td>not commercially available</td>
			<td>see ref 21. Rameix-Welti et al, 2014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>See Saw Rocker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA GAPDH</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus siRNA 
			D-001810-10-05</td>
			<td>SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA IMPDH2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human 
			L-004330-00-0005</td>
			<td>SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. 
			Individual references and sequences 
			J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; 
			J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; 
			J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; 
			J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA RSV N</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus custom siRNA</td>
			<td>UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiRNA NT</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiRNA transfection reagent</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03</td>
			<td>Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate 7.5% solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Tecan infinite M200PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, amplification, and titration of recombinant respiratory syncytial viruses

Bruk av rekombinant virus blitt avgjørende i grunnleggende eller anvendt virologi. Omvendt genetikk har vist seg for å være en ekstremt kraftig teknologi, både å dechiffrere viral replikasjon mekanismer og å studere antivirale eller gi utviklingsplattform for vaksiner. Bygging og manipulering av et omvendt genetisk system for en negativ-strand RNA virus som en respiratorisk syncytial virus (RSV), men fortsatt delikate og krever spesiell kunnskap. RSV genomet er en enkelt-strand, negativ-sense RNA ca 15 KB som fungerer som en mal for både viral RNA replikering og transkripsjon. Omvendt genetikk systemet bruker en cDNA kopi av menneskelig RSV lang stamme genomet (HRSV). Dette cDNA, samt cDNAs koding virale proteiner av polymerase komplekse (L, P, N og M2-1), plassert i individuelle uttrykk vektorer under T7 utvalg kontroll sekvenser. Hva disse elementene i BSR-T7/5 celler som stabilt express T7 utvalg, tillater cytoplasmatiske replikering og transkripsjon av rekombinant RSV, gir opphav til genetisk modifisert virions. En ny RSV, som finnes på celleoverflaten og kultur nedbryting BSRT7/5, er samlet for å infisere HEp-2 menneskeceller for viral forsterkning. To eller tre runder med forsterkning er nødvendig for å oppnå viral aksjer som inneholder 1 x 106 1 x 107 plakk-forming enheter (PFU) / mL. Metodene for optimal høsting, frysing og titrering viral aksjer er beskrevet her i detalj. Vi illustrerer protokollen presentert her ved å opprette to rekombinant virus henholdsvis uttrykke gratis grønn fluorescerende protein (GFP) (RSV-GFP) eller viral M2-1 del GFP (RSV-M2-1-GFP). Viser vi hvordan du bruker RSV-GFP for å kvantifisere RSV replikering og RSV-M2-1-GFP å visualisere viral strukturer, samt viral protein dynamikk i levende celler, ved hjelp av video mikroskopi teknikker.

I dette arbeidet beskrev vi en detaljert protokoll for å produsere rekombinant RSV virus uttrykke et fluorescerende protein (figur 2). I pRSV-GFP, ble GFP genet innført mellom P og M genene, som kirsebær genet i tidligere utgitte verk21. I den pRSV-M2-1-GFP, M2 genet ble stående urørt og en ekstra genet koding for M2-1-GFP ble satt inn mellom SH og G gener12. Det første trinnet, tilsvarende til redning av ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses at JoVE.com

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Vi beskriver en metode for å generere og forsterke genetisk endret respiratorisk syncytial virus (RSVs) og en optimalisert plakk analysen for RSVs. Vi illustrerer denne protokollen ved å opprette to rekombinant virus som henholdsvis tillate kvantifisering av RSV replikering og live analyse av RSV inkludering organer og inkludering organer-assosiert granulater dynamikk.

Generasjon, forsterkning og titrering rekombinant respiratorisk Syncytial virus

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Bruken av rekombinante virus er en kraftig teknologi både for å tyde virusreplikasjonsmekanismene og for å gi utviklingsplattformer for vaksiner. Likeledes, generasjon av god kvalitet viral lager er avgjørende for hver viral studie fra den mest grunnleggende forskning til anvendte studier. Redning av rekombinante virus, optimal høsting, frysing og titrering av RSV-bestander er kritiske metoder for alle virologiske studier.De kan betraktes som tradisjonelle, men forblir delikate og krever spesifikk kompetanse. Dagen før transfection, suspendere BSR-T7/5 celler i komplett medium ved 0,5 millioner celler per milliliter konsentrasjon. Fordel to milliliter av cellefjæringen per brønn i en seksbrønns plate.Inkuber platen ved 37 grader Celsius i 5% karbondioksid til de når 80-90% samløpet neste dag. For å redde hvert virus, først blande tint omvendt genetikk vektorer i et rør, deretter gå videre til transfection, etter transfection reagens produsentens protokoll. Deretter legger du til 250 mikroliter av det reduserte serummediet til de blandede vektorene.I et annet rør fortynnes 10 mikroliter av denne transfection reagensen i 250 mikroliter av det reduserte serummediet. Forsiktig virvle begge rørene og vent i fem minutter. Bland innholdet i begge rørene og vent i 20 minutter ved romtemperatur.Skyll BSR-T7/5-cellene med én milliliter av det reduserte serummediet og fordel 1,5 milliliter minimum essensielle medieantibiotika gratis supplert med 10 % føtalkalvenserum per brønn. Om nødvendig inkuber ved 37 grader Celsius i 5% karbondioksidmiljø. Etter den 20-minutters inkubasjonen, legg til 500 mikroliter av transfeksjonsblandingen i hver brønn.Inkuber cellene ved 37 grader Celsius i 5% karbondioksidmiljø i tre dager. For å overvåke redningseffektiviteten, observere ved GFP fluorescens under et omvendt fluorescensmikroskop ved 20X forstørrelse en gang per dag. På den tredje dagen av transfection, skrapeceller i hver brønn av den trans infiserte BSR-T7/5 seks-brønns plate.Overfør celler og overnaturlige av hver brønn til et sterilt to milliliter mikrocentrifugerør. For å frigjøre det reddet viruset fra cellemembranene, virvler hvert rør kraftig i minst 30 sekunder. For den første forsterkningen av de reddet virusene, først fjerne kulturmediet fra HEp-2 plate seeded dagen før, og deretter raskt legge til 500 mikroliter per brønn av den friske passasje-null viral suspensjon.Plasser HEp-2-platen ved 37 grader Celsius på en seesaw rocker for myk agitasjon i to timer. For å produsere den første passasjen av de reddet virusene, kast 500 mikroliter av inokulumet og legg til to milliliter MEM med 2% FCS. Inkuber platen ved 37 grader Celsius i 5% karbondioksid i tre dager.For å overvåke infeksjonen under et invertert fluorescensmikroskop ved 20X forstørrelse, følg GFP-fluorescensen til HEp-2-cellene som er infisert med passasjen-null suspensjon en gang per dag. Under et brightfield mikroskop, observere utseendet av liten syncytia og celle løsrivelse, noe som gjenspeiler RSV cytopatisk effekt. For å forsterke de reddet virusene, først fortynne viral suspensjon av FCS-fri MEM å få en tre-milliliter suspensjon på 50,000 PFU per milliliter, deretter fjerne mediet fra HEp-2 kolbe.Legg raskt til den tre milliliter virale suspensjonen og inkuber kolben ved 37 grader Celsius på en seesaw rocker for myk agitasjon i to timer. Deretter fjerner og kast inoculum og tilsett 15 milliliter MEM med 2% FCS. Inkuber ved 37 grader Celsius i 5% karbondioksid i to til fire dager.For å estimere riktig tidspunkt for å høste virusene, sjekk cellemorfologien og GFP fluorescens under et omvendt fluorescensmikroskop ved 20X forstørrelse. Vær oppmerksom på at dette vanligvis er når 50% til 80% av HEp-2 cellelaget er løsrevet på grunn av RSV cytopatisk effekt som oppstår mellom 48 og 72 timer etter infeksjon. Deretter skraper du alle cellene ved hjelp av en celleskraper.Samle både cellene og supernatant sammen og overføre dem til en 50-milliliter sentrifuge rør. Legg til 1/10 av volumet av 10X RSV bevaring løsning. Vortex rørene kraftig i fem sekunder og sentrifuge i fem minutter på 200 ganger g for å avklare suspensjonen.Overfør det overnaturlige til et 50-milliliter rør. Vortex kort og aliquot suspensjon i kryogene rør merket med alkoholresistente koder. Senk røret i forhåndskjølt, minus 80 grader Celsius alkohol i minst en time og lagre dem på minus 80 grader Celsius.For å utføre en plakktitreringsanalyse, først gjøre 2X minimum viktig medium ved å fortynne kommersielle 10X MEM med sterilt vann og legge L-glutamin, 1, 000 enheter per milliliter penicillin, og ett mg per milliliter streptomycin. Rist fortynningen kraftig og lagre den ved fire grader Celsius, og legg deretter til 900 mikroliter av FCS-frie MEM til seks rør. Tin viruset aliquots og vortex dem kraftig i fem sekunder.For å lage seriefortynninger, legg først til 100 mikroliter av viruset til 900 mikroliter av mediet i det første røret. Sett hetten på røret og bland innholdet ved å virvle i noen sekunder, og legg deretter til 100 mikroliter av den første fortynningen til 900 mikroliter av mediet i det andre røret. Sett hetten på røret og virvelen.Gjenta denne prosedyren til det sjette røret. Skriv virusnavnet og de fullstendige fortynningene på HEp-2 12-brønnplatene. Legg til et merke for å matche platen og dekselet fordi de kan skilles under farging.Fjern mediet fra platene og fordel 400 mikroliter av en fortynning per brønn. Inkuber platene ved 37 grader Celsius i to timer for virus adsorpsjon. Under virus adsorpsjon, forberede mikrokrystallinsk cellulose overlegg ved først å justere pH av 2X MEM til rundt 7,2 med en steril natriumbikarbonat løsning på 7,5% etter fargeindikatoren.For å få 100 milliliter av overlegget, tilsett 10 milliliter 2X MEM, 10 milliliter 2,4% monokrystallinsk cellulose suspensjon, og 80 milliliter av MEM supplert med 2% FCS og bland kraftig. På slutten av to timers inkubasjon, legg til to til tre milliliter av overlegget til hver brønn av de 12-brønnsplatene uten å fjerne inokulumet. Inkuber platen ved 37 grader Celsius i 5% karbondioksid i seks dager.For å flekke cellene med krystallfiolett oppløsning, rist først platene forsiktig for å ta av mikrokrystallinsk celluloseoverlegget. Fjern supernativa og vask cellene to ganger med 1X PBS, legg deretter til en til to milliliter av den krystallfiolette løsningen og vent 10 til 15 minutter. Fjern oppløsningen, som kan brukes om igjen for etterfølgende platefarging.Til slutt beregner viruset titers som en brøkdel av antall synlige plakk i brønnene av de tørre platene og inokusvolumet og fortynningen. Utføre en plakett analyse på den negative kontrollen, transfected med bare uttrykket plasmids av N, P, L, og M2-1 avslørte ingen plakk på den laveste fortynning. Titerne som ble oppnådd fra de trans infiserte cellene var forventet å være over 100 PFU per milliliter hvis redningen var effektiv.Titers økte over passasjene for å nå en million til 10 millioner PFU per milliliter ved passering en eller to. Takket være disse fluorescerende virusene kan hemming av RSV-uttrykk ved å siRNA rettet mot proteinet N og det cellulære proteinet IMPDH lett observeres og måles. I motsetning ble et sterkt GFP-signal på kontrollceller transfisert med ikke-målretting siRNA eller celler transfisert med siRNA mot det cellulære proteinet GAPDH observert og målt.Likeledes disse virusene aktivert enkel observasjon av hemming av RSV multiplikasjon av en antiviral narkotika sammensatte. Sporing av det fluorescerende proteinet M2-1 i HEp-2-infiserte celler viste IBs og IB-tilknyttede granulat som svært dynamiske strukturer. IBs ble observert som mobile og sfæriske strukturer i stand til å smelte og å danne større sfæriske inneslutninger.IB-tilknyttede granulat gjennomgikk kontinuerlige monteringsdemonteringssykluser med dannelsen av små IB-tilknyttede granulater som vokste, smeltet sammen til store IB-tilknyttede granulater, og forsvant deretter. Protokollen for plakktitrering av RSV ved hjelp av mikrokrystallinsk celluloseoverlegg kan enkelt tilpasses andre celler og/eller andre virus. Det vil kreve justering av konsentrasjonen av mikrokrystallinsk cellulose.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Produksjon og Titering av rekombinant Adeno-assosiert virale vektorer

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Protein misfolding Syklisk Forsterkning av Prioner

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Etablering av en flytende dekket Culture of Polarized Menneskelig Airway Epiteliale Calu-3 Cells å studere Host Cell Response til luftveispatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Generasjon av rekombinant arenavirus for Vaccine Development i FDA-godkjente Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Høy gjennomstrømming Screening for Bredspektret Chemical hemmere av RNA-virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administrering av rekombinant influensavaksiner i Chimerisk musemodeller for å studere slimhinneimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...