Name: generation, amplification, and titration of recombinant respiratory syncytial viruses
Uploaded: 2019-04-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses at JoVE.com

Os autores agradecer Dr. Qin Yu da AstraZeneca R & D Boston, MA, EUA, para fornecer a droga AZD4316. Os autores são gratos à plataforma Cymages para acessar o microscópio ScanR Olympus, que foi apoiado por concede da região de Ile-de-France (uma só saúde DIM). Os autores reconhecem apoio do INSERM e a Universidade de Versailles Saint-Quentin.

1. material preparação
<ol><li>Compra de mídia de célula (soro reduzida mídia, mínimo essencial [MEM], 10 x MEM e Dulbecco modificada do meio da águia [DMEM]), reagente de transfeccao e celulose microcristalina (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Obter os seguintes vetores para genética reversa: o vector(s) genômica e os vetores de expressão de codificação da proteína N e as proteínas complexas de polimerase. Os genômicos vetores contêm o genoma completo do cDNA da RSV-GFP (p-RSV-GFP) ...

<ol>
	<li>Shi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+disease+burden+estimates+of+acute+lower+respiratory+infections+due+to+respiratory+syncytial+virus+in+young+children+in+2015:+a+systematic+review+and+modelling+study.">Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study.</a> The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).</li><li>Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+Syncytial+Virus+Infection+in+Elderly+and+High-Risk+Adults.">Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults.</a> The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).</li><li>DeVincenzo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+Oral+ALS-008176+in+a+Respiratory+Syncytial+Virus+Challenge+Study.">Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).</li><li>DeVincenzo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+GS-5806+Activity+in+a+Respiratory+Syncytial+Virus+Challenge+Study.">Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).</li><li>Afonso, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales:+update+2016.">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016.</a> Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).</li><li>Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+elongation+factor+of+respiratory+syncytial+virus,+a+nonsegmented+negative-strand+RNA+virus.">Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+bodies+are+a+site+of+ebolavirus+replication.">Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication.</a> Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).</li><li>Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+expression+redirects+vesicular+stomatitis+virus+RNA+synthesis+to+cytoplasmic+inclusions.">Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions.</a> PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958 (2010).</li><li>Lahaye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Characterization+of+Negri+Bodies+(NBs)+in+Rabies+Virus-Infected+Cells:+Evidence+that+NBs+Are+Sites+of+Viral+Transcription+and+Replication.">Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication.</a> Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).</li><li>Kolesnikova, L., M&#252;hlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+organization+of+recombinant+Marburg+virus+nucleoprotein:+comparison+with+Marburg+virus+inclusions.">Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions.</a> Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).</li><li>Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marburg+virus+inclusions:+A+virus-induced+microcompartment+and+interface+to+multivesicular+bodies+and+the+late+endosomal+compartment.">Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment.</a> European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).</li><li>Rincheval, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+cytoplasmic+inclusion+bodies+in+cells+infected+by+respiratory+syncytial+virus.">Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus.</a> Nature Communications. 8 (1), 563 (2017).</li><li>Santangelo, P. J., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+filamentous+viral+RNPs+prior+to+egress.">Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).</li><li>Lifland, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Nucleoprotein+and+Inclusion+Bodies+Antagonize+the+Innate+Immune+Response+Mediated+by+MDA5+and+MAVS.">Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS.</a> Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).</li><li>Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+inclusions+of+respiratory+syncytial+virus-infected+cells:+formation+of+inclusion+bodies+in+transfected+cells+that+coexpress+the+nucleoprotein,+the+phosphoprotein,+and+the+22K+protein.">Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein.</a> Virology. 195 (1), 243-247 (1993).</li><li>Brown, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+association+between+heat+shock+protein+70+and+the+respiratory+syncytial+virus+polymerase+complex+within+lipid-raft+membranes+during+virus+infection.">Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection.</a> Virology. 338 (1), 69-80 (2005).</li><li>Radhakrishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+analysis+of+purified+respiratory+syncytial+virus+particles+reveals+an+important+role+for+heat+shock+protein+90+in+virus+particle+assembly.">Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).</li><li>Racaniello, V. R., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloned+poliovirus+complementary+DNA+is+infectious+in+mammalian+cells.">Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells.</a> Science. 214 (4523), 916-919 (1981).</li><li>Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+rabies+viruses+from+cloned+cDNA.">Infectious rabies viruses from cloned cDNA.</a> The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).</li><li>Collins, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+infectious+human+respiratory+syncytial+virus+from+cloned+cDNA+confirms+an+essential+role+for+the+transcription+elongation+factor+from+the+5'+proximal+open+reading+frame+of+the+M2+mRNA+in+gene+expression+and+provides+a+capability+for+vaccine.">Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).</li><li>Rameix-Welti, M. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+replication+of+respiratory+syncytial+virus+in+cells+and+in+living+mice.">Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice.</a> Nature Communications. 5, 5104 (2014).</li><li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+(BRSV)+from+cDNA:+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture,+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter.">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).</li><li>Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+activity+and+molecular+mechanism+of+an+orally+active+respiratory+syncytial+virus+fusion+inhibitor.">Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).</li><li>Derscheid, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+respiratory+syncytial+virus+memphis+37+grown+in+HEp-2+cells+causes+more+severe+disease+in+lambs+than+virus+grown+in+vero+cells.">Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells.</a> Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).</li><li>McKimm-Breschkin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+plaque+assay+for+respiratory+syncytial+virus+-+direct+visualization+of+plaques+without+immunostaining.">A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus - direct visualization of plaques without immunostaining.</a> Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virology Journal. 7, 1-7 (2006).</li><li>Novina, C. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNAi+revolution.">The RNAi revolution.</a> Nature. 430 (6996), 161-164 (2004).</li><li>Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+inosine+5'-monophosphate+dehydrogenase+and+the+design+of+novel+inhibitors.">The structure of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors.</a> Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).</li><li>Beaucourt, S., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribavirin:+A+drug+active+against+many+viruses+with+multiple+effects+on+virus+replication+and+propagation.+Molecular+basis+of+ribavirin+resistance.">Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance.</a> Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).</li><li>Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Ribavirin+on+Respiratory+Syncytial+Virus+in+vitro.">Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).</li><li>Sim&#245;es, E. A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past,+Present+and+Future+Approaches+to+the+Prevention+and+Treatment+of+Respiratory+Syncytial+Virus+Infection+in+Children.">Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children.</a> Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).</li><li>Alvarez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-mediated+silencing+of+the+respiratory+syncytial+virus+nucleocapsid+defines+a+potent+antiviral+strategy.">RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).</li><li>DeVincenzo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+double-blind,+placebo-comtrolled+study+of+an+RNAi-based+therapy+directed+against+respiratory+syncytial+virus.">A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+a+CRISPR/Cas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells.">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).</li><li>Nikolic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negri+bodies+are+viral+factories+with+properties+of+liquid+organelles.">Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles.</a> Nature Communications. 8 (1), 58 (2017).</li></ol>

Aqui nós apresentamos um método de resgate de recombinante RSVs de cinco plasmídeos e sua amplificação. A capacidade de manipular o genoma do vírus tem revolucionado a pesquisa de virologia para testar as mutações e expressar um gene adicional ou uma proteína viral marcada. A RSV temos descrito e usado como exemplo neste artigo é um vírus que está expressando um gene repórter, o RSV-GFP (não publicado) e expressa uma proteína M2-1 fundida a uma marca GFP12. Resgate de RSV é desafia...

RSV humana é a principal causa de hospitalização por infecção aguda do trato respiratório em crianças em todo o mundo1. Além disso, a RSV é associado com um fardo de doença substancial em adultos comparáveis à gripe, com a maioria da hospitalização e carga de mortalidade no idoso2. Não existem vacinas ou específicas antivirais disponíveis ainda contra RSV, mas prometendo novas drogas estão em desenvolvimento3,4. A complexidade e o peso das técnicas de quantificação de multiplicação RSV impedem a busca de antivirais ou vacinas, apesar dos esforços consideráveis atuais. A quantificação de multiplicação RSV in vitro geralmente é baseada em métodos trabalhosos, demorados e caros, que consistem principalmente na análise do efeito citopático por microscopia, imunocoloração, redução de placa bacteriana, ensaios, quantitativos transcriptase reversa (qRT)-reação em cadeia da polimerase (PCR) e testes de ensaio enzima-lig da imunoabsorção. Vírus com genomas modificadas e expressar genes repórter, tais como aqueles que codifica para o GFP, são mais adequados para tais projeções. Juntamente com a utilização de leitores de placa automatizado, vírus recombinantes gene portadores de repórter podem fazer estes ensaios mais adequados para fins de padronização e alta produtividade.
RSV é um vírus de RNA sentido negativo envelopado, conjuntos que pertence ao gênero Orthopneumovirus do Pneumoviridae familiar, ordem Mononegavirales5. O genoma da RSV é um single-strand, negativo-sentido RNA de cerca de 15 kb, que contém uma região não-codificante as extremidades 3' e 5' chamado Leader e Trailer e 10 unidades transcricionais codificação 11 proteínas. Os genes estão ordenados da seguinte forma: 3'-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (codificação para proteínas M2-1 e M2-2) e L-5'. O RNA genômico é firmemente embalado pela cadeia s. Using o RNA genômico encapsidated como um modelo, viral RNA-dependente do RNA polimerase (RdRp) garantirá a transcrição e replicação do RNA viral. RdRp viral é composto da proteína grande L que exerce a atividade de polimerase nucleotídeo por si, seu cofator obrigatório o phosphoprotein P e a proteína M2-1, que funciona como uma transcrição viral fator6. Em células infectadas, RSV induz a formação de inclusões citoplasmáticas, chamado de corpos de inclusão (IBs). Inclusões citoplasmáticas morfologicamente semelhantes têm sido observadas por várias Mononegavirales7,8,9,10. Estudos recentes sobre o vírus da raiva, vírus da estomatite vesicular (VSV), vírus Ebola e RSV mostrou que a síntese de RNA viral ocorre na IBs, que assim podem ser consideradas como fábricas viral8,9,11, 12. as fábricas de vírus concentrar o RNA e as proteínas virais necessárias para a síntese de RNA viral e também contêm proteínas celulares13,14,15,16, 17. SII exibem um subcompartment funcional chamado grânulos de IB-associado (IBAGs), que concentram o recém synthetized nascente mRNA viral juntamente com a proteína M2-1. O genoma RNA e a L, P e N não são detectadas em IBAGs. IBAGs são pequenas estruturas esféricas dinâmicas dentro IBs que exibem as propriedades do líquido organelas12. Apesar do papel central da IBs na multiplicação viral, muito pouco é conhecido sobre a natureza, estrutura interna, formação e operação destas fábricas viral.
A expressão do genoma de um vírus de um cDNA permitiu a produção do primeiro clone infeccioso viral em 198118. Para single-stranded vírus de RNA negativos, não foi até 1994 que a produção de um vírus de raiva primeira seguindo transfection de plasmídeos em células19 teve lugar. O primeiro baseado em plasmídeo reverso sistema genético para RSV foi publicado em 1995,20. Genética reversa têm levado a grandes avanços no campo da virologia. A possibilidade de introduzir modificações específicas no genoma viral forneceu insights críticos sobre a replicação e a patogênese dos vírus de RNA. Esta tecnologia também muito tem facilitado o desenvolvimento de vacinas permitindo atenuação específica através de uma série específica de modificações. Modificações de genoma, permitindo uma rápida quantificação de multiplicação viral grandemente melhoraram a triagem antiviral e estudo do seu modo de ação.
Embora anteriormente descrito, obter RSVs geneticamente modificados continua a ser delicado. Aqui, detalhamos um protocolo para criar dois tipos de HRSV recombinante, respectivamente, expressando RSV-GFP ou RSV-M2-1-GFP. Neste protocolo, descrevemos as condições de transfeccao necessárias para resgatar os novos vírus recombinantes, bem como sua amplificação para obter ações virais com título elevado, apropriado para experimentações reprodutíveis. A construção de vetores a genética reversa por si não está descrita aqui. Descrevemos os métodos de colheita ideal e congelamento de estoques virais. O método mais preciso para quantificar as partículas virais infecciosas permanece o ensaio da chapa. Células são infectadas com diluições em série da suspensão analisada e incubadas com uma sobreposição que proíbe a difusão de partículas virais livres no sobrenadante. Em tais condições, o vírus só irá infectar células contíguas, formando uma "placa" para cada partícula infecciosa inicial. No ensaio de titulação convencional de RSV, placas são reveladas por imunocoloração e contadas sob observação microscópica. Este método é caro e demorado. Aqui descrevemos um protocolo muito simples para um ensaio de placa RSV usando sobreposição de celulose microcristalina que permite a formação de placas visíveis a olho nu. Mostramos como RSV-GFP pode ser usado para replicação de RSV medida e, assim, para quantificar o impacto de antivirais. Combinação genética reversa e tecnologia de imagem ao vivo, demonstramos como RSV-M2-1-GFP permite aos cientistas para visualizar M2-1 em células vivas e a seguir a dinâmica das estruturas virais intracelulares, tais como IBs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm &#181; dish for live cell imaging</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel RC-591</td>
			<td>FMC BioPolymer</td>
			<td>Avicel RC-591</td>
			<td>Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSRT7/5</td>
			<td></td>
			<td>not commercially available</td>
			<td>See ref 22. Buchholz et al, 1999</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT90132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for observations</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73 Olympus microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for videomicroscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>ScanR Olympus microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEp-2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (10X), no glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11430030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41090-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 ReagentPlus, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td>not commercially available</td>
			<td>see ref 21. Rameix-Welti et al, 2014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>See Saw Rocker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA GAPDH</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus siRNA 
			D-001810-10-05</td>
			<td>SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA IMPDH2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human 
			L-004330-00-0005</td>
			<td>SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. 
			Individual references and sequences 
			J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; 
			J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; 
			J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; 
			J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA RSV N</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus custom siRNA</td>
			<td>UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiRNA NT</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiRNA transfection reagent</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03</td>
			<td>Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate 7.5% solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Tecan infinite M200PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, amplification, and titration of recombinant respiratory syncytial viruses

O uso de vírus recombinantes tornou-se crucial em virologia básica ou aplicada. Genética reversa tem sido provada para ser uma tecnologia extremamente poderosa, tanto para decifrar os mecanismos de replicação viral e para estudar antivirais ou fornecer a plataforma de desenvolvimento de vacinas. A construção e manipulação de um sistema de genética reversa para um negativo-vertente vírus RNA como um vírus sincicial respiratório (VSR), no entanto, continua a ser delicados e requer conhecimentos especiais. O genoma da RSV é um single-strand, negativo-sentido RNA de cerca de 15 kb, o que serve como um modelo para replicação do RNA viral e transcrição. Nosso sistema de genética reversa utiliza uma cópia de cDNA do genoma humano de longa estirpe de RSV (HRSV). Este cDNA, bem como a codificação de proteínas virais do complexo da polimerase de cDNAs (L, P, N e M2-1), são colocados em vetores de expressão individual sob sequências de controle do polymerase T7. O transfection desses elementos nas células de BSR-T7/5, que expressam estàvel polymerase T7, permite a replicação citoplasmática e transcrição de recombinação RSV, dando origem a virions geneticamente modificados. Uma nova RSV, que está presente na superfície da célula e no sobrenadante de cultura de BSRT7/5, está reunida para infectar células humanas de HEp-2 para amplificação viral. Duas ou três rodadas de amplificação são necessárias para obter ações virais contendo 1 x 106 a 1 x 107 unidades formadoras de placa (PFU) / mL. Métodos para o ideal da colheita, congelamento e titulação de estoques virais são descritos aqui em detalhes. Ilustramos o protocolo aqui apresentado, criando dois vírus recombinantes expressando respectivamente livre proteína verde fluorescente (GFP) (RSV-GFP) ou viral M2-1 fundida a GFP (RSV-M2-1-GFP). Mostramos como usar RSV-GFP para quantificar a replicação RSV e a RSV-M2-1-GFP para visualizar estruturas virais, bem como a dinâmica da proteína viral em células vivas, usando técnicas de vídeo microscopia.

Neste trabalho, descrevemos um protocolo detalhado para produzir recombinantes vírus RSV, expressando uma proteína fluorescente (Figura 2). Em pRSV-GFP, o gene GFP foi introduzido entre os genes P e M, conforme descrito para o gene cereja em trabalho anteriormente publicado21. No pRSV-M2-1-GFP, o gene M2 foi deixado intocado e um adicional gene que codifica para M2-1-GFP foi inserido entre os genes SH e G12. A...

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Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Nós descrevemos um método para gerar e amplificar geneticamente modificado vírus sincicial respiratórios (RSVs) e um ensaio de placa otimizado para RSVs. Ilustramos este protocolo criando dois vírus recombinantes que respectivamente permitem quantificação de replicação RSV e análise de corpos de inclusão RSV e grânulos associada a corpos de inclusão dinâmica de viver.

Geração, amplificação e titulação do vírus sincicial respiratórios recombinantes

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

O uso de vírus recombinantes é uma tecnologia poderosa tanto para decifrar os mecanismos de replicação viral quanto para fornecer plataformas de desenvolvimento para vacinas. Da mesma forma, a geração de estoque viral de boa qualidade é crucial para todos os estudos virais desde a pesquisa mais fundamental até os estudos aplicados. O resgate de vírus recombinantes, a colheita, o congelamento e a titulação dos estoques de RSV são métodos críticos para todos os estudos virológicos.Eles podem ser considerados tradicionais, mas permanecem delicados e requerem especialização específica. Um dia antes da transfecção, suspenda as células BSR-T7/5 em meio completo a 0,5 milhões de células por concentração mililitro. Distribua dois mililitros da suspensão da célula por poço em uma placa de seis poços.Incubar a placa a 37 graus Celsius em dióxido de carbono de 5% até atingir 80-90% de confluência no dia seguinte. Para resgatar cada vírus, primeiro misture vetores de genética reversa descongelados em um tubo, depois proceder à transfecção, seguindo o protocolo do fabricante do reagente de transfecção. Em seguida, adicione 250 microliters do meio sérico reduzido aos vetores mistos.Em outro tubo, diluir 10 microlitres deste reagente de transfecção em 250 microliters do meio soro reduzido. Bata suavemente os dois tubos e espere por cinco minutos. Misture o conteúdo de ambos os tubos e espere 20 minutos em temperatura ambiente.Enquanto isso, enxágue as células BSR-T7/5 com um mililitro do meio sérico reduzido e distribua 1,5 mililitro de antibióticos de mídia essenciais mínimos complementados com soro de bezerro fetal de 10% por poço. Se necessário, incubar a 37 graus Celsius em ambiente de dióxido de carbono de 5%. Após a incubação de 20 minutos, adicione 500 microliters da mistura de transfecção em cada poço.Incubar as células a 37 graus Celsius em ambiente de dióxido de carbono de 5% por três dias. Para monitorar a eficiência de resgate, observe a fluorescência GFP sob um microscópio de fluorescência invertida a 20X de ampliação uma vez por dia. No terceiro dia de transfecção, arranhe células em cada poço da placa de seis poços BSR-T7/5 transfeccionada.Transfira células e supernascer de cada poço em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros estéreis. Para liberar o vírus resgatado das membranas celulares, vórtice cada tubo vigorosamente por pelo menos 30 segundos. Para a primeira amplificação dos vírus resgatados, primeiro remova o meio de cultura da placa HEp-2 semeada no dia anterior, depois adicione rapidamente 500 microlitros por poço da suspensão viral de passagem fresca-zero.Coloque a placa HEp-2 a 37 graus Celsius em um roqueiro de gangorra para agitação suave por duas horas. Para produzir a primeira passagem dos vírus resgatados, descarte 500 microliters do inóculo e adicione dois mililitros de MEM com 2% de FCS. Incubar a placa a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por três dias.Para monitorar a infecção sob um microscópio de fluorescência invertida na ampliação de 20X, observe a fluorescência GFP das células HEp-2 infectadas com a suspensão de passagem zero uma vez por dia. Sob um microscópio de campo brilhante, observe a aparência de pequena sincronia e descolamento celular, o que reflete o efeito citopático RSV. Para amplificar os vírus resgatados, primeiro dilua a suspensão viral do MEM livre de FCS para obter uma suspensão de três mililitros a 50.000 PFU por mililitro, em seguida, remova o meio do frasco HEp-2.Adicione rapidamente a suspensão viral de três mililitros e incubar o frasco a 37 graus Celsius em um roqueiro de gangorra para agitação suave por duas horas. Em seguida, remova e descarte o inóculo e adicione 15 mililitros de MEM com 2%de FCS. Incubar a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por dois a quatro dias.Para estimar o momento certo para colher os vírus, verifique a morfologia celular e a fluorescência GFP sob um microscópio de fluorescência invertida na ampliação de 20X. Observe que isso ocorre geralmente quando 50% a 80% da camada celular HEp-2 é destacada devido ao efeito citopático RSV que ocorre entre 48 e 72 horas após a infecção. Em seguida, raspe todas as células usando um raspador de células.Colete as células e o supernatante juntos e transfira-as para um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Adicione 1/10 do volume da solução de conservação 10X RSV. Vórtice os tubos vigorosamente por cinco segundos e centrífuga por cinco minutos a 200 vezes g para esclarecer a suspensão.Transfira o supernatante para um tubo de 50 mililitros. Vórtice brevemente e alíquota a suspensão em tubos criogênicos rotulados com etiquetas resistentes ao álcool. Mergulhe o tubo em álcool pré-resfriado, menos 80 graus Celsius por pelo menos uma hora e armazene-os a menos 80 graus Celsius.Para realizar um ensaio de titulação de placa, primeiro faça 2X meio essencial mínimo diluindo o MD MEM comercial 10X com água estéril e adicionando L-glutamina, 1.000 unidades por penicilina mililitro, e um miligrama por estreptomicina mililitro. Agite a diluição vigorosamente e armazene-a a quatro graus Celsius, depois adicione 900 microliters do MEM livre de FCS a seis tubos. Descongele as alíquotas do vírus e o vórtice vigorosamente por cinco segundos.Para fazer diluições seriais, adicione primeiro 100 microliters do vírus a 900 microliters do meio no primeiro tubo. Coloque a tampa no tubo e misture seu conteúdo por vórtice por alguns segundos, depois adicione 100 microliters da primeira diluição a 900 microliters do meio no segundo tubo. Coloque a tampa no tubo e o vórtice.Repita este procedimento até o sexto tubo. Escreva o nome do vírus e as diluições completas nas placas HEp-2 12-well. Adicione uma marca para combinar com a placa e sua tampa, pois elas podem ser separadas durante a coloração.Retire o meio das placas e distribua 400 microliters de uma diluição por poço. Incubar as placas a 37 graus Celsius por duas horas para adsorção de vírus. Durante a adsorção do vírus, prepare a sobreposição de celulose microcristalina ajustando primeiro o pH do MEM 2X para cerca de 7,2 com uma solução de bicarbonato de sódio estéril em 7,5% seguindo o indicador de cor.Para obter 100 mililitros da sobreposição, adicione 10 mililitros de 2X MEM, 10 mililitros de 2,4% de suspensão de celulose monocristalino e 80 mililitros do MEM complementados com 2% de FCS e misture vigorosamente. No final da incubação de duas horas, adicione dois a três mililitros da sobreposição a cada poço das placas de 12 poços sem remover o inóculo. Incubar a placa a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por seis dias.Para colorir as células com solução violeta cristalina, primeiro agite suavemente as placas para tirar a sobreposição de celulose microcristalina. Remova os supernacantes e lave as células duas vezes com 1X PBS, em seguida, adicione um a dois mililitros da solução violeta cristalina e espere de 10 a 15 minutos. Remova a solução, que pode ser reutilizada para posterior coloração da placa.Finalmente calcule os tituladores do vírus como uma fração do número de placas visíveis nos poços das placas secas e do volume do inóculo e da diluição. Realizando um ensaio de placa sobre o controle negativo, transfectados apenas com a expressão plasmídeos de N, P, L e M2-1 não revelou nenhuma placa na diluição mais baixa. Esperava-se que os títulos obtidos das células transfeinadas fossem acima de 100 PFU por mililitro se o resgate fosse eficiente.Os títulos aumentaram ao longo das passagens para atingir um milhão a 10 milhões de PFU por mililitro na passagem um ou dois. Graças a esses vírus fluorescentes, a inibição da expressão RSV pelo siRNA visando a proteína N e a proteína celular IMPDH pode ser facilmente observada e medida. Em contraste, um forte sinal de GFP em células de controle transfeinadas com siRNA não direcionado ou células transfectadas com siRNA contra a proteína celular GAPDH foi observado e medido.Da mesma forma, esses vírus permitiram a fácil observação da inibição da multiplicação de RSV por um composto antiviral. O rastreamento da proteína fluorescente M2-1 em células infectadas por HEp-2 mostrou os IBs e grânulos associados ao IB como estruturas muito dinâmicas. Os IBs foram observados como estruturas móveis e esféricas capazes de fundir e formar maiores inclusões esféricas.Os grânulos associados ao IB foram submetidos a ciclos contínuos de desmontagem de montagem com a formação de pequenos grânulos associados ao IB que cresceram, fundiram-se em grandes grânulos associados ao IB e desapareceram. O protocolo de titulação de placa de RSV usando sobreposição de celulose microcristalina pode ser facilmente adaptado a outras células e/ou outros vírus. Exigirá ajuste da concentração da celulose microcristalino.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Geração de recombinante do vírus Influenza de DNA plasmidial

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolamento de variantes de vírus de RNA Fidelity e Caracterização de frequência de mutação de vírus

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Produção e titulação de adeno-associados recombinantes Vetores Virais

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Proteína amplificação cíclica misfolding de príons

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Estabelecer uma cultura líquida, coberta de vias respiratórias humanas epiteliais Polarized Calu-3 células para estudar a resposta Cell Host para patógenos respiratórios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Geração de Arenavirus recombinante de Desenvolvimento de Vacinas no FDA-approved células Vero

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Uma<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar respostas imunes de sangue periférico humano células mononucleares para Vírus Respiratório Sincicial Humano Infecção

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Triagem de alta capacidade para amplo espectro químico Inibidores de Vírus RNA

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

A administração intranasal de recombinantes Vacinas contra Influenza em quimérico rato Modelos para estudar a imunidade mucosal

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...