Name: generation, amplification, and titration of recombinant respiratory syncytial viruses
Uploaded: 2019-04-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses at JoVE.com

Авторы благодарят д-р Юй Цинь от компании АстраЗенека R & D Бостон, MA, США, за предоставление AZD4316 наркотиков. Авторы благодарны Cymages платформу для доступа к Микроскоп ScanR Olympus, которое было поддержано гранты от региона Иль (DIM один здоровья). Авторы признают поддержки от INSERM и Университет Версаль Сен-Кантен.

1. Подготовка
<ol><li>Приобрести мобильные средства массовой информации (сокращение сыворотке СМИ, минимум основных СМИ [мкм], 10 x MEM и Дульбекко модифицированная орла средних [DMEM]), transfection реагента и микрокристаллическая целлюлоза (см. Таблицу материалы).</li>
	<li>Получить следующую в?...

<ol>
	<li>Shi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+disease+burden+estimates+of+acute+lower+respiratory+infections+due+to+respiratory+syncytial+virus+in+young+children+in+2015:+a+systematic+review+and+modelling+study.">Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study.</a> The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).</li><li>Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+Syncytial+Virus+Infection+in+Elderly+and+High-Risk+Adults.">Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults.</a> The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).</li><li>DeVincenzo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+Oral+ALS-008176+in+a+Respiratory+Syncytial+Virus+Challenge+Study.">Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).</li><li>DeVincenzo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+GS-5806+Activity+in+a+Respiratory+Syncytial+Virus+Challenge+Study.">Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).</li><li>Afonso, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales:+update+2016.">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016.</a> Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).</li><li>Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+elongation+factor+of+respiratory+syncytial+virus,+a+nonsegmented+negative-strand+RNA+virus.">Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+bodies+are+a+site+of+ebolavirus+replication.">Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication.</a> Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).</li><li>Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+expression+redirects+vesicular+stomatitis+virus+RNA+synthesis+to+cytoplasmic+inclusions.">Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions.</a> PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958 (2010).</li><li>Lahaye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Characterization+of+Negri+Bodies+(NBs)+in+Rabies+Virus-Infected+Cells:+Evidence+that+NBs+Are+Sites+of+Viral+Transcription+and+Replication.">Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication.</a> Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).</li><li>Kolesnikova, L., M&#252;hlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+organization+of+recombinant+Marburg+virus+nucleoprotein:+comparison+with+Marburg+virus+inclusions.">Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions.</a> Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).</li><li>Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marburg+virus+inclusions:+A+virus-induced+microcompartment+and+interface+to+multivesicular+bodies+and+the+late+endosomal+compartment.">Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment.</a> European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).</li><li>Rincheval, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+cytoplasmic+inclusion+bodies+in+cells+infected+by+respiratory+syncytial+virus.">Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus.</a> Nature Communications. 8 (1), 563 (2017).</li><li>Santangelo, P. J., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+filamentous+viral+RNPs+prior+to+egress.">Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).</li><li>Lifland, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Nucleoprotein+and+Inclusion+Bodies+Antagonize+the+Innate+Immune+Response+Mediated+by+MDA5+and+MAVS.">Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS.</a> Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).</li><li>Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+inclusions+of+respiratory+syncytial+virus-infected+cells:+formation+of+inclusion+bodies+in+transfected+cells+that+coexpress+the+nucleoprotein,+the+phosphoprotein,+and+the+22K+protein.">Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein.</a> Virology. 195 (1), 243-247 (1993).</li><li>Brown, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+association+between+heat+shock+protein+70+and+the+respiratory+syncytial+virus+polymerase+complex+within+lipid-raft+membranes+during+virus+infection.">Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection.</a> Virology. 338 (1), 69-80 (2005).</li><li>Radhakrishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+analysis+of+purified+respiratory+syncytial+virus+particles+reveals+an+important+role+for+heat+shock+protein+90+in+virus+particle+assembly.">Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).</li><li>Racaniello, V. R., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloned+poliovirus+complementary+DNA+is+infectious+in+mammalian+cells.">Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells.</a> Science. 214 (4523), 916-919 (1981).</li><li>Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+rabies+viruses+from+cloned+cDNA.">Infectious rabies viruses from cloned cDNA.</a> The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).</li><li>Collins, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+infectious+human+respiratory+syncytial+virus+from+cloned+cDNA+confirms+an+essential+role+for+the+transcription+elongation+factor+from+the+5'+proximal+open+reading+frame+of+the+M2+mRNA+in+gene+expression+and+provides+a+capability+for+vaccine.">Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).</li><li>Rameix-Welti, M. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+replication+of+respiratory+syncytial+virus+in+cells+and+in+living+mice.">Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice.</a> Nature Communications. 5, 5104 (2014).</li><li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+(BRSV)+from+cDNA:+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture,+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter.">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).</li><li>Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+activity+and+molecular+mechanism+of+an+orally+active+respiratory+syncytial+virus+fusion+inhibitor.">Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).</li><li>Derscheid, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+respiratory+syncytial+virus+memphis+37+grown+in+HEp-2+cells+causes+more+severe+disease+in+lambs+than+virus+grown+in+vero+cells.">Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells.</a> Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).</li><li>McKimm-Breschkin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+plaque+assay+for+respiratory+syncytial+virus+-+direct+visualization+of+plaques+without+immunostaining.">A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus - direct visualization of plaques without immunostaining.</a> Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virology Journal. 7, 1-7 (2006).</li><li>Novina, C. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNAi+revolution.">The RNAi revolution.</a> Nature. 430 (6996), 161-164 (2004).</li><li>Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+inosine+5'-monophosphate+dehydrogenase+and+the+design+of+novel+inhibitors.">The structure of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors.</a> Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).</li><li>Beaucourt, S., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribavirin:+A+drug+active+against+many+viruses+with+multiple+effects+on+virus+replication+and+propagation.+Molecular+basis+of+ribavirin+resistance.">Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance.</a> Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).</li><li>Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Ribavirin+on+Respiratory+Syncytial+Virus+in+vitro.">Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).</li><li>Sim&#245;es, E. A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past,+Present+and+Future+Approaches+to+the+Prevention+and+Treatment+of+Respiratory+Syncytial+Virus+Infection+in+Children.">Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children.</a> Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).</li><li>Alvarez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-mediated+silencing+of+the+respiratory+syncytial+virus+nucleocapsid+defines+a+potent+antiviral+strategy.">RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).</li><li>DeVincenzo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+double-blind,+placebo-comtrolled+study+of+an+RNAi-based+therapy+directed+against+respiratory+syncytial+virus.">A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+a+CRISPR/Cas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells.">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).</li><li>Nikolic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negri+bodies+are+viral+factories+with+properties+of+liquid+organelles.">Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles.</a> Nature Communications. 8 (1), 58 (2017).</li></ol>

Здесь мы представляем метод спасения рекомбинантного RSVs из пяти плазмид и их усиление. Возможность манипулировать геном вируса революционизировало вирусологии исследования для тестирования мутации и выразить дополнительных гена или тегами вирусного белка. RSV мы описал и используетс...

RSV человека является основной причиной госпитализации для острой инфекции дыхательных путей в младенцев во всем мире1. Кроме того RSV ассоциируется с существенной заболеваемости в сопоставимых с гриппом, с большинством госпитализации и бременем смертности в пожилых2взрослых. Не существует вакцины или конкретных противовирусные препараты доступны еще против RSV, но перспективных новых препаратов находятся в развития3,4. Сложности и тяжести методы количественной оценки RSV умножения затрудняют поиск противовирусные препараты и вакцины, несмотря на значительные усилия, прилагаемые. Количественная оценка RSV умножения в пробирке обычно основана на трудоемкий, длительным и дорогостоящим методы, которые состоят главным образом в анализе цитопатического эффекта микроскопии, иммуноокрашивания, сокращение зубного налета анализов, количественные обратной транскриптазы (qRT)-полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуноферментного анализа тестов. Вирусы с модифицированных геномов и выражая репортер генов, например кодирования для GFP, являются более подходящими для таких фильмов. В сочетании с использованием автоматизированных пластины читателей, Репортер ген нося рекомбинантных вирусы могут сделать эти анализы больше подходит для целей стандартизации и высок объём.
RSV является запечатанным, палочкоядерных отрицательный смысл РНК вирус, который принадлежит к роду Orthopneumovirus из Mononegaviralesсемьи, порядок Pneumoviridae ,5. Геном RSV является одной strand, отрицательные чувство РНК около 15 КБ, который содержит некодирующей региона на 3 и 5' конечностей, назвал лидера и трейлер и 10 transcriptional единиц кодирования 11 белков. Гены упорядочиваются следующим: 3'-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, м2 (кодировка для белков м2-1 и м2-2) и L-5'. Геномной РНК плотно упакованы, Нуклеопротеиды N. Using encapsidated геномной РНК как шаблон, вирусной РНК зависимой РНК-полимеразы (RdRp) обеспечит транскрипцию и репликацию вирусной РНК. Вирусных RdRp состоит из большой белка L, который осуществляет действие полимеразы нуклеотида таковой, ее обязательной кофактор фосфоропротеид P и м2-1 белок, который функционирует как вирусный транскрипции фактор6. В инфицированных клетках RSV индуцирует образование цитоплазматических включений, называется включением органов (IBs). Морфологически похожие цитоплазматических включений было отмечено несколько Mononegavirales7,8,9,10. Недавние исследования на вирус бешенства, вирус везикулярного стоматита (ВСВ), вирус Эбола и RSV, показал, что синтез вирусной РНК происходит в IBs, которые таким образом могут рассматриваться как вирусные фабрики8,9,11, 12. вирус фабрики сконцентрировать РНК и вирусные белки, необходимые для синтеза вирусной РНК и также содержат клеточных белков13,14,,1516, 17. IBs выставлять функциональный subcompartment, называется IB-связанные гранулы (IBAGs), которые концентрируют вновь синтезированный зарождающейся вирусный мРНК вместе с белком м2-1. Геномной РНК и L, P и N не обнаруживаются в IBAGs. IBAGs являются небольшие динамические сферических структуры внутри IBs, которые демонстрируют свойства жидкого органеллы12. Несмотря на центральную роль IBs в Вирусный умножения очень мало известно о природе, внутренняя структура, формирования и функционирования этих вирусные фабрики.
Выражение геном полиовируса из cDNA включено производство первых инфекционные вирусные клон в 1981 году18. Для отрицательных в одноцепочечной РНК-вирусов было не до 1994 года производство первого вируса бешенства, после трансфекции плазмид в клетки19 имели место. Первый на основе плазмида обратный генетической системы для RSV был опубликован в 1995 году20. Обратный генетики привели к крупным достижениям в области вирусологии. Возможность внесения конкретных изменений в вирусного генома предоставил критических идеи на репликации и патогенеза РНК-вирусов. Эта технология также значительно облегчило разработку вакцин, позволяя конкретных затухания через целевые серии модификаций. Изменения генома, позволяя быстрое количественного определения вирусных умножения значительно улучшена антивирусной проверки и изучения режима их действий.
Хотя ранее описанных, получение генетически модифицированных RSVs остается нестабильным. Здесь мы подробно протокол для создания двух типов рекомбинантных HRSV, соответственно, выражая RSV-GFP или RSV-м2-1-GFP. В этом протоколе мы описываем трансфекции условия, необходимые для спасения рекомбинантных новых вирусов, а также их усиления для получения вирусных запасов с высокий титр, подходит для воспроизводимых экспериментах. Строительство векторов обратной генетики per se не описано здесь. Мы описывают методы для оптимального сбора урожая и замораживание вирусных запасов. Наиболее точным методом для количественного определения вирусных инфекционных частиц остается assay металлической пластинкы. Клетки инфицированные серийных разведений анализируемого подвески и инкубировали с накладкой, который запрещает распространение свободных вирусных частиц в надосадке. В таких условиях вирус будет только заразить смежных ячеек, образуя «налет» для каждой первоначальной инфекционные частицы. В обычных assay титрования RSV бляшками выявлены, иммуноокрашивания и учитываются в микроскопические наблюдения. Этот метод является дорогостоящим и трудоемким. Здесь мы описали очень простой протокол для assay металлической пластинкы RSV, используя микрокристаллическая оверлея, который позволяет образованию бляшек, видимых невооруженным глазом. Мы покажем, как RSV-GFP может использоваться мера RSV репликации и, таким образом, для количественной оценки воздействия противовирусных препаратов. Сочетание обратной генетики и живой технологии визуализации, мы демонстрируем, как RSV-м2-1-GFP позволяет ученым визуализировать м2-1 в живых клеток и следовать за динамику внутриклеточная вирусная структур, таких как IBs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm &#181; dish for live cell imaging</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel RC-591</td>
			<td>FMC BioPolymer</td>
			<td>Avicel RC-591</td>
			<td>Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSRT7/5</td>
			<td></td>
			<td>not commercially available</td>
			<td>See ref 22. Buchholz et al, 1999</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT90132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for observations</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73 Olympus microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for videomicroscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>ScanR Olympus microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEp-2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (10X), no glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11430030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41090-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 ReagentPlus, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td>not commercially available</td>
			<td>see ref 21. Rameix-Welti et al, 2014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>See Saw Rocker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA GAPDH</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus siRNA 
			D-001810-10-05</td>
			<td>SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA IMPDH2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human 
			L-004330-00-0005</td>
			<td>SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. 
			Individual references and sequences 
			J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; 
			J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; 
			J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; 
			J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA RSV N</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus custom siRNA</td>
			<td>UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiRNA NT</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiRNA transfection reagent</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03</td>
			<td>Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate 7.5% solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Tecan infinite M200PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, amplification, and titration of recombinant respiratory syncytial viruses

Применение рекомбинантного вирусов приобрел решающее значение в основных или прикладной вирусологии. Было доказано обратного генетика быть чрезвычайно мощная технология, как расшифровать механизмы вирусной репликации и для изучения противовирусные препараты или предоставить платформу для разработки вакцин для. Строительство и манипуляции обратный генетической системы для отрицательные strand РНК вируса таких респираторно-синцитиальный вирус (RSV), однако, остается нестабильным и требует специального ноу-хау. Геном RSV является одной strand, отрицательные чувство РНК около 15 КБ, который служит в качестве шаблона для вирусной РНК репликации и транскрипции. Наша система обратной генетики использует cDNA копию генома человека RSV длинные штамм (HRSV). Этот cDNA, а также cDNAs кодирования вирусные белки комплекс полимеразы (L, P, N и м2-1), помещаются в отдельные выражения векторов под T7 полимеразы управляющие последовательности. Трансфекция этих элементов в ЧКР-T7/5 клеток, которые стабильно Экспресс T7 полимеразы, позволяет цитоплазматических репликации и транскрипции рекомбинантных RSV, рождая генетически модифицированных вирионов. Новый RSV, которая присутствует на поверхности клеток и в надосадке культуры BSRT7/5, собирается для того, чтобы заразить клетки человека HEp-2 для амплификации вирусной. Два или три круга усиления необходимы для получения вирусных запасов, содержащих 1 x 10-6 до 1 x 107 металлическ формируя единиц (ОРП) / мл. Здесь подробно описаны методы для оптимального сбора урожая, замораживания и титрование вирусных запасов. Мы иллюстрируем протокола, представленные здесь, создав две рекомбинантных вирусов, соответственно выражая бесплатно Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) (RSV-GFP) или вирусный м2-1 сливается с GFP (RSV-м2-1-ГФП). Мы покажем, как использовать RSV-GFP квантифицировать RSV репликации и RSV-м2-1-GFP визуализировать вирусный структур, а также динамика вирусных белков в живой клетке, с использованием методов видео микроскопии.

В этой работе мы описали подробный протокол производить рекомбинантные RSV вирусов, выражая флуоресцентный белок (рис. 2). В pRSV-GFP гена GFP была введена между P и M генов, как описано для вишни гена в ранее опубликованной работе21. В pRSV м2-1-GFP м2 ген б...

Watch this Scientific Journal Video about Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses at JoVE.com

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Мы описываем метод для генерации и усиления генетически модифицированные синцитиальный респираторных вирусов (RSVs) и оптимизированной налета assay RSVs. Проиллюстрируем этот Протокол путем создания двух рекомбинантных вирусов, которые соответственно дать количественную оценку данной RSV репликации и жить анализ RSV включения органов и органов включение связанных гранулы динамики.

Поколение, усилители и титрование рекомбинантных респираторных вирусов-синцитиальный

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Использование рекомбинантных вирусов является мощной технологией как для расшифровки механизмов репликации вируса, так и для обеспечения платформ разработки вакцин. Аналогичным образом, генерация высококачественных вирусных запасов имеет решающее значение для каждого вирусного исследования от самых фундаментальных исследований до прикладных исследований. Спасение рекомбинантных вирусов, оптимальный сбор урожая, замораживание и титрование запасов РСВ являются важнейшими методами для всех вирусологических исследований.Их можно считать традиционными, но они остаются деликатными и требуют специальных знаний. За день до трансфекции приостанавливайте клетки BSR-T7/5 в полной среде при концентрации 0,5 миллиона клеток на миллилитр. Распределить два миллилитров клеточной подвески на колодец в шести-хорошо пластины.Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа, пока они не достигнут 80-90% слияния на следующий день. Чтобы спасти каждый вирус, сначала смесь разморозила обратные векторы генетики в трубке, а затем перейти к трансфекции, следуя протоколу производителя трансфекции реагентов. Далее добавьте 250 микролитров уменьшенной среды сыворотки к смешанным переносчикам.В другой трубке разбавляют 10 микролитров этого трансфектного реагента в 250 микролитров пониженной среды сыворотки. Аккуратно вихрем обе трубки и ждать пять минут. Смешайте содержимое обеих трубок и подождите 20 минут при комнатной температуре.Между тем, промыть клетки BSR-T7/5 с одним миллилитром уменьшенной среды сыворотки и распространять 1,5 миллилитра минимальных необходимых антибиотиков сми бесплатно дополняется 10%фетальной сыворотки теленка на колодец. При необходимости инкубировать при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислом газе окружающей среды. После 20-минутной инкубации добавьте в каждую колодец 500 микролитров трансфекции.Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в 5%углекислого газа окружающей среды в течение трех дней. Чтобы контролировать эффективность спасения, наблюдайте при флуоресценции GFP под перевернутым флуоресцентным микроскопом при 20X увеличении один раз в день. На третий день трансфекции, царапинные клетки в каждом колодеце трансфицированных BSR-T7/5 шести-хорошо пластины.Передача клеток и супернатант каждого хорошо в стерильные двухми миллилитров микроцентрифуг трубки. Чтобы освободить спасенный вирус от клеточных мембран, вихрь каждой трубки энергично, по крайней мере 30 секунд. Для первого усиления спасенных вирусов сначала удалите культурную среду из пластины HEp-2, посеянной накануне, а затем быстро добавьте 500 микролитров на колодец свежей вирусной подвески.Поместите пластину HEp-2 при 37 градусах по Цельсию на качели рокер для мягкого возбуждения в течение двух часов. Чтобы произвести первый проход спасенных вирусов, отбросьте 500 микролитров инокулума и добавьте два миллилитров MEM с 2%FCS. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа в течение трех дней.Чтобы контролировать инфекцию под перевернутым флуоресцентным микроскопом при увеличении 20X, наблюдайте флуоресценцию GFP клеток HEp-2, инфицированных нулевой подвеской один раз в день. Под ярким микроскопом наблюдайте появление небольшой синцитии и клеточного отслоения, что отражает цитопатический эффект RSV. Чтобы усилить спасенные вирусы, сначала разбавить вирусную подвеску МЧС без FCS, чтобы получить трехми миллилитровую подвеску на 50 000 ПФУ на миллилитр, а затем удалить носитель из колбы HEp-2.Быстро добавьте трехми миллилитровую вирусную суспензию и инкубировать колбу при 37 градусах по Цельсию на качели рокер для мягкого возбуждения в течение двух часов. Затем удалите и отбросьте инокулум и добавьте 15 миллилитров MEM с 2%FCS. Инкубация при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа в течение двух-четырех дней.Чтобы оценить правильное время для сбора вирусов, проверьте морфологию клеток и флуоресценцию GFP под перевернутым флуоресцентным микроскопом при увеличении 20X. Обратите внимание, что это, как правило, когда от 50%до 80% слоя клеток HEp-2 отделяется из-за RSV цитопатический эффект, который происходит между 48 и 72 часов после инфекции. Затем соскребать все клетки с помощью сотового скребка.Соберите клетки и супернатант вместе и перенесите их в 50-миллилитровую центрифугу. Добавьте 1/10 объема решения по сохранению 10X RSV. Vortex трубки энергично в течение пяти секунд и центрифуги в течение пяти минут при 200 раз г, чтобы прояснить подвеску.Перенесите супернатант в 50-миллилитровую трубку. Vortex кратко и aliquot подвеска в криогенных трубок помечены спиртосоустойчивых тегов. Погрузите трубку в предварительно охлажденный, минус 80 градусов по Цельсию алкоголя, по крайней мере один час и хранить их при температуре минус 80 градусов по Цельсию.Для выполнения анализа титаций бляшек, сначала сделайте 2X минимально необходимую среду, разбавляя коммерческий 10X MEM стерильной водой и добавляя L-глутамин, 1000 единиц на миллилитр пенициллина и один миллиграмм на миллилитр стрептомицин. Встряхните разбавления энергично и хранить его при четырех градусах по Цельсию, а затем добавить 900 микролитров FCS-бесплатно MEM до шести трубок. Оттепель вирус aliquots и вихрь их энергично в течение пяти секунд.Чтобы сделать серийные разбавления, сначала добавьте 100 микролитров вируса в 900 микролитров среды в первой трубке. Положите крышку на трубку и смешайте ее содержимое вихрем в течение нескольких секунд, затем добавьте 100 микролитров первого разбавления до 900 микролитров среды во второй трубке. Положите крышку на трубку и вихрь.Повторите эту процедуру до шестой трубки. Напишите название вируса и полное разбавления на пластинах HEp-2 12-хорошо. Добавьте отметку, чтобы соответствовать пластине и ее крышке, потому что они могут быть разделены во время окрашивания.Снимите среду с пластин и распределим 400 микролитров одного разбавления на колодец. Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов для вирусов adorption. Во время распространения вируса подготовьтесь к наложению микрокристаллической целлюлозы, сначала регулируя рН 2X MEM примерно до 7,2 с стерильным раствором бикарбоната натрия на уровне 7,5%после цветового индикатора.Чтобы получить 100 миллилитров наложения, добавьте 10 миллилитров 2X MEM, 10 миллилитров 2,4%монокристаллической целлюлозной суспензии и 80 миллилитров MEM, дополненных 2%FCS и энергично смешивайте. В конце двухчасовой инкубации добавьте два-три миллилитров наложения к каждому колодец из 12-хорошо пластин, не снимая инокулы. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа в течение шести дней.Чтобы испачкать клетки кристально фиолетовым раствором, сначала аккуратно встряхните пластины, чтобы снять микрокристаллическое накладное покрытие целлюлозы. Удалить supernatants и мыть клетки дважды с 1X PBS, а затем добавить от одного до двух миллилитров кристально фиолетовый раствор и ждать от 10 до 15 минут. Удалите раствор, который можно повторно использовать для последующего окрашивания пластин.Окончательно вычисляйте титеры вируса как часть числа видимых бляшек в колодцах сухих плит и объема inoculum и разбавления. Выполняя анализ бляшки на отрицательном контроле, трансфицированный только экспрессионными плазмидами N, P, L и M2-1, не выявил налета при самом низком разбавлении. Титеры, полученные из трансфицированных клеток, должны были быть выше 100 ПФУ на миллилитр, если спасение было эффективным.Титеры увеличились над проходами, чтобы достичь одного миллиона до 10 миллионов ПФУ на миллилитр при прохождении одного или двух. Благодаря этим флуоресцентным вирусам можно легко наблюдать и измерять ингибирование экспрессии РСВ с помощью siRNA, нацеленной на белок N и клеточный белок IMPDH. В отличие от этого, был замечен и измерен сильный сигнал GFP о контрольных клетках, трансфицированных нецелевых siRNA или клетками, трансфицированными с siRNA против клеточного белка GAPDH.Аналогичным образом эти вирусы позволили легко наблюдения ингибирования РСВ умножения на противовирусные соединения наркотиков. Отслеживание флуоресцентного белка M2-1 в HEp-2-инфицированных клетках показало, что IBs и связанные с IB гранулы являются очень динамическими структурами. IBs были замечены как мобильные и сферические структуры, способные сплавляться и формировать большие сферические включения.Связанные с IB гранулы прошли непрерывные циклы сборки-разборки с образованием небольших связанных с IB гранул, которые росли, слились в большие гранулы, связанные с IB, а затем исчезли. Протокол титрование Бляшек РСВ с использованием микрокристаллической целлюлозы может быть легко адаптирован к другим клеткам и/или другим вирусам. Это потребует корректировки концентрации микрокристаллической целлюлозы.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Генерация рекомбинантного вируса гриппа от ДНК плазмиды

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Выделение вариантов Fidelity РНК-содержащих вирусов и характеристика вирусов Частота мутаций

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Производство и Titering рекомбинантных адено-ассоциированные вирусные векторы

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Белки неправильного сворачивания Циклические Усиление Прионы

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Создание жидкого покрытые культуры поляризованный человека эпителия дыхательных путей Calu-3 ячейки по изучению клетки-хозяина в ответ на возбудителей инфекций дыхательных путей<em&gt; В пробирке</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Генерация рекомбинантного ареновирус для разработки вакцины в FDA-Approved клетках Веро

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Высокопроизводительный скрининг для широкого спектра химических ингибиторов РНК-содержащих вирусов

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Интраназального введения рекомбинантного гриппа вакцин в химерных мышей Модели для изучения слизистых оболочек

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...