Name: generation, amplification, and titration of recombinant respiratory syncytial viruses
Uploaded: 2019-04-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses at JoVE.com

Los autores agradecen el Dr. Qin Yu de AstraZeneca R & D Boston, MA, Estados Unidos, para proporcionar la droga AZD4316. Los autores agradecemos a la plataforma de Cymages acceso al microscopio ScanR Olympus, que fue apoyado por subvenciones de la región Ile-de-France (DIM una salud). Los autores reconocen apoyo del INSERM y la Universidad de Versailles Saint-Quentin.

1. material preparación
<ol><li>Compra de medios de comunicación de la célula (suero reducido soporte, mínimo esencial [MEM], 10 x MEM y Dulbecco de modificado medio de águila [DMEM]), reactivo de transfección y celulosa microcristalina (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Obtener los siguientes vectores de genética reversa: vector(s) genómica y los vectores de expresión que codifican la proteína N y las proteínas del complejo polimerasa. Los vectores de la genómicos contienen el cDNA co...

<ol>
	<li>Shi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+disease+burden+estimates+of+acute+lower+respiratory+infections+due+to+respiratory+syncytial+virus+in+young+children+in+2015:+a+systematic+review+and+modelling+study.">Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study.</a> The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).</li><li>Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+Syncytial+Virus+Infection+in+Elderly+and+High-Risk+Adults.">Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults.</a> The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).</li><li>DeVincenzo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+Oral+ALS-008176+in+a+Respiratory+Syncytial+Virus+Challenge+Study.">Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).</li><li>DeVincenzo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+GS-5806+Activity+in+a+Respiratory+Syncytial+Virus+Challenge+Study.">Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).</li><li>Afonso, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales:+update+2016.">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016.</a> Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).</li><li>Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+elongation+factor+of+respiratory+syncytial+virus,+a+nonsegmented+negative-strand+RNA+virus.">Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+bodies+are+a+site+of+ebolavirus+replication.">Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication.</a> Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).</li><li>Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+expression+redirects+vesicular+stomatitis+virus+RNA+synthesis+to+cytoplasmic+inclusions.">Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions.</a> PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958 (2010).</li><li>Lahaye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Characterization+of+Negri+Bodies+(NBs)+in+Rabies+Virus-Infected+Cells:+Evidence+that+NBs+Are+Sites+of+Viral+Transcription+and+Replication.">Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication.</a> Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).</li><li>Kolesnikova, L., M&#252;hlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+organization+of+recombinant+Marburg+virus+nucleoprotein:+comparison+with+Marburg+virus+inclusions.">Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions.</a> Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).</li><li>Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marburg+virus+inclusions:+A+virus-induced+microcompartment+and+interface+to+multivesicular+bodies+and+the+late+endosomal+compartment.">Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment.</a> European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).</li><li>Rincheval, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+cytoplasmic+inclusion+bodies+in+cells+infected+by+respiratory+syncytial+virus.">Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus.</a> Nature Communications. 8 (1), 563 (2017).</li><li>Santangelo, P. J., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+filamentous+viral+RNPs+prior+to+egress.">Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).</li><li>Lifland, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Nucleoprotein+and+Inclusion+Bodies+Antagonize+the+Innate+Immune+Response+Mediated+by+MDA5+and+MAVS.">Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS.</a> Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).</li><li>Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+inclusions+of+respiratory+syncytial+virus-infected+cells:+formation+of+inclusion+bodies+in+transfected+cells+that+coexpress+the+nucleoprotein,+the+phosphoprotein,+and+the+22K+protein.">Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein.</a> Virology. 195 (1), 243-247 (1993).</li><li>Brown, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+association+between+heat+shock+protein+70+and+the+respiratory+syncytial+virus+polymerase+complex+within+lipid-raft+membranes+during+virus+infection.">Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection.</a> Virology. 338 (1), 69-80 (2005).</li><li>Radhakrishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+analysis+of+purified+respiratory+syncytial+virus+particles+reveals+an+important+role+for+heat+shock+protein+90+in+virus+particle+assembly.">Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).</li><li>Racaniello, V. R., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloned+poliovirus+complementary+DNA+is+infectious+in+mammalian+cells.">Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells.</a> Science. 214 (4523), 916-919 (1981).</li><li>Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+rabies+viruses+from+cloned+cDNA.">Infectious rabies viruses from cloned cDNA.</a> The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).</li><li>Collins, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+infectious+human+respiratory+syncytial+virus+from+cloned+cDNA+confirms+an+essential+role+for+the+transcription+elongation+factor+from+the+5'+proximal+open+reading+frame+of+the+M2+mRNA+in+gene+expression+and+provides+a+capability+for+vaccine.">Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).</li><li>Rameix-Welti, M. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+replication+of+respiratory+syncytial+virus+in+cells+and+in+living+mice.">Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice.</a> Nature Communications. 5, 5104 (2014).</li><li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+(BRSV)+from+cDNA:+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture,+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter.">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).</li><li>Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+activity+and+molecular+mechanism+of+an+orally+active+respiratory+syncytial+virus+fusion+inhibitor.">Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).</li><li>Derscheid, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+respiratory+syncytial+virus+memphis+37+grown+in+HEp-2+cells+causes+more+severe+disease+in+lambs+than+virus+grown+in+vero+cells.">Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells.</a> Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).</li><li>McKimm-Breschkin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+plaque+assay+for+respiratory+syncytial+virus+-+direct+visualization+of+plaques+without+immunostaining.">A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus - direct visualization of plaques without immunostaining.</a> Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virology Journal. 7, 1-7 (2006).</li><li>Novina, C. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNAi+revolution.">The RNAi revolution.</a> Nature. 430 (6996), 161-164 (2004).</li><li>Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+inosine+5'-monophosphate+dehydrogenase+and+the+design+of+novel+inhibitors.">The structure of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors.</a> Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).</li><li>Beaucourt, S., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribavirin:+A+drug+active+against+many+viruses+with+multiple+effects+on+virus+replication+and+propagation.+Molecular+basis+of+ribavirin+resistance.">Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance.</a> Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).</li><li>Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Ribavirin+on+Respiratory+Syncytial+Virus+in+vitro.">Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).</li><li>Sim&#245;es, E. A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past,+Present+and+Future+Approaches+to+the+Prevention+and+Treatment+of+Respiratory+Syncytial+Virus+Infection+in+Children.">Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children.</a> Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).</li><li>Alvarez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-mediated+silencing+of+the+respiratory+syncytial+virus+nucleocapsid+defines+a+potent+antiviral+strategy.">RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).</li><li>DeVincenzo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+double-blind,+placebo-comtrolled+study+of+an+RNAi-based+therapy+directed+against+respiratory+syncytial+virus.">A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+a+CRISPR/Cas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells.">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).</li><li>Nikolic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negri+bodies+are+viral+factories+with+properties+of+liquid+organelles.">Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles.</a> Nature Communications. 8 (1), 58 (2017).</li></ol>

Aquí presentamos un método de rescate de recombinante RSVs de cinco plásmidos y su amplificación. La habilidad de manipular el genoma de los virus ha revolucionado la investigación de virología para probar mutaciones y expresar un gen adicional o una etiquetado proteína viral. El RSV hemos descrito y utilizado como ejemplo en este artículo es un virus que expresa un gen reportero, RSV-GFP (inédito) y expresa una proteína M2-1 fusionada a GFP etiqueta12. Rescate de RSV es difícil y requi...

RSV humano es la principal causa de hospitalización por infección respiratoria aguda en niños en todo el mundo1. Además, RSV se asocia con una sustancial morbilidad en adultos comparables a la gripe, con la mayor parte de la hospitalización y la carga de mortalidad en los ancianos2. No hay vacunas o antivirales específicos disponibles sin embargo contra el VRS, pero promete nuevos fármacos están en desarrollo3,4. La complejidad y la pesadez de las técnicas de cuantificación de la multiplicación de RSV impiden la búsqueda de antivirales o vacunas a pesar de esfuerzos considerables. La cuantificación de la multiplicación de RSV in vitro se basa generalmente en métodos laboriosos, lentos y costosos, que consisten sobre todo en el análisis del efecto citopático por microscopia, immunostaining, reducción de placa ensayos cuantitativos (qRT) de la transcriptasa reversa-reacción en cadena de polimerasa (PCR) y enzima-ligado del inmunosorbente pruebas de ensayo. Virus con genomas modificados y la expresión de genes reporteros, tales como codificación de la GFP, son más convenientes para tales proyecciones. Junto a la utilización de lectores de placa automatizada, virus recombinantes portadores de gen reportero pueden hacer estos ensayos más conveniente para los propósitos de estandarización y alto rendimiento.
RSV es un virus ARN de sentido negativo envuelto, que pertenece al género Orthopneumovirus de Pneumoviridae familiar, orden Mononegavirales5. El genoma del RSV es un ARN monocatenario, de sentido negativo de unos 15 kb, que contiene una región noncoding en el extremos 3' y 5' llamado líder y Trailer y 10 unidades transcripcionales que codifican 11 proteínas. Los genes se ordenan como sigue: 3'-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (codificación de las proteínas de 1 M2 y M2-2) y L-5'. El ARN genómico firmemente empaquetado por la nucleoproteína N. usando el genoma de ARN genómico como plantilla, viral RNA polimerasa dependiente de ARN (RdRp) se asegurará de transcripción y replicación del ARN viral. RdRp viral se compone de la proteína grande L que lleva la actividad de polimerasa nucleótidos por sí, su cofactor obligatorio la fosfoproteína P y la proteína M2-1 que funciona como una transcripción viral factor6. En las células infectadas, RSV induce la formación de inclusiones citoplasmáticas llamadas cuerpos de inclusión (IBs). Inclusiones citoplásmicas morfológicamente similares se han observado varios Mononegavirales7,8,9,10. Recientes estudios sobre el virus de la rabia, virus de la estomatitis vesicular (VSV), virus de Ebola y RSV demostrada que la síntesis de RNA viral ocurre en IBs, que pueden considerarse así como fábricas virales8,9,11, 12. las fábricas de virus concentrado el ARN y las proteínas virales necesarias para la síntesis de RNA viral y también contienen proteínas celulares13,14,15,16, 17. IBs exhiben un subcompartment funcional llamado gránulos asociada a IB (IBAGs), que se concentran los recién sintetizado naciente mRNA viral junto con la proteína M2-1. El RNA genómico y la L, P y N no son detectados en IBAGs. IBAGs son pequeñas estructuras esféricas dinámicas dentro de IBs que exhiben las propiedades de organelos líquido12. A pesar del papel central del SCI en la multiplicación viral, muy poco se sabe acerca de la naturaleza, estructura, formación y funcionamiento de estas fábricas virales.
La expresión del genoma de un virus de la polio de un cDNA permitieron la producción de la primera copia viral infecciosa en 198118. Para negativo virus de ARN monocatenario, no fue hasta 1994 que la producción de un primer virus de la rabia después de la transfección de plásmidos en células19 ocurrió. El primer plásmido sistema basado en inversa genético para RSV fue publicado en 199520. Genética reversa ha conducido a importantes avances en el campo de la virología. La posibilidad de introducir modificaciones específicas en el genoma viral ha proporcionado penetraciones críticas en la replicación y patogenia del virus del RNA. Esta tecnología también ha facilitado el desarrollo de vacunas por lo que permite la atenuación específica a través de una serie específica de modificaciones. Modificaciones del genoma que permite una cuantificación rápida de la multiplicación viral grandemente mejoraron del antiviral proyección y estudio de su modo de acción.
Aunque descrito previamente, obtención de transgénicos RSVs sigue siendo delicado. Aquí detallamos un protocolo para crear dos tipos de HRSV recombinante, respectivamente expresan GFP RSV o RSV-M2-1-GFP. En este protocolo, describimos las condiciones de la transfección a rescatar los nuevos virus recombinantes, así como su amplificación para obtener poblaciones virales con alto título, apto para experimentaciones reproducibles. La construcción de vectores de la genética reversa propiamente se describe aquí. Describir métodos de cosecha óptima y la congelación de las poblaciones virales. El método más preciso para cuantificar partículas infecciosas virales sigue siendo el ensayo de placa. Las células son infectadas con diluciones seriadas de la suspensión analizada y se incubaron con un recubrimiento que impide la difusión de partículas virales libres en el sobrenadante. En esas condiciones, el virus infectará sólo celdas contiguas formando una "placa" para cada partícula infecciosa inicial. En el análisis convencional de la titulación de RSV, placas son reveladas por inmunotinción y contadas bajo observación microscópica. Este método es costoso y desperdiciador de tiempo. Aquí describimos un protocolo muy simple para un ensayo de placa de RSV mediante recubrimiento de celulosa microcristalina que permite la formación de placas visibles al ojo desnudo. Mostramos cómo se puede utilizar RSV-GFP a medida RSV replicación y, por tanto, para cuantificar el impacto de antivirales. Combinación de genética reversa y en tecnología de imagen, demostramos cómo RSV-M2-1-GFP permite a los científicos visualizar M2-1 en células vivas y seguir la dinámica de estructuras virales intracelulares, como IBs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm &#181; dish for live cell imaging</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel RC-591</td>
			<td>FMC BioPolymer</td>
			<td>Avicel RC-591</td>
			<td>Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSRT7/5</td>
			<td></td>
			<td>not commercially available</td>
			<td>See ref 22. Buchholz et al, 1999</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT90132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for observations</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73 Olympus microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for videomicroscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>ScanR Olympus microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEp-2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (10X), no glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11430030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41090-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 ReagentPlus, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td>not commercially available</td>
			<td>see ref 21. Rameix-Welti et al, 2014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>See Saw Rocker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA GAPDH</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus siRNA 
			D-001810-10-05</td>
			<td>SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA IMPDH2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human 
			L-004330-00-0005</td>
			<td>SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. 
			Individual references and sequences 
			J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; 
			J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; 
			J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; 
			J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA RSV N</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus custom siRNA</td>
			<td>UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiRNA NT</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiRNA transfection reagent</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03</td>
			<td>Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate 7.5% solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Tecan infinite M200PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, amplification, and titration of recombinant respiratory syncytial viruses

La utilización de virus recombinantes se ha vuelto crucial en virología básica o aplicada. Genética inversa ha demostrado para ser una tecnología muy potente, tanto para descifrar los mecanismos de replicación viral y a estudiar antivirales o proporcionar la plataforma de desarrollo de vacunas. La construcción y manipulación de un sistema de genético reverso para un negativo-strand RNA virus como un virus sincitial respiratorio (VSR), sin embargo, sigue siendo delicadas y requiere conocimientos técnicos especiales. El genoma del RSV es un ARN monocatenario, de sentido negativo de aproximadamente 15 kb que sirve como plantilla para la replicación del RNA viral y transcripción. Nuestro sistema de genética reversa utiliza una copia del cDNA del genoma humano de largo cepa de RSV (HRSV). Este cDNA, así como de los cDNAs que codifican las proteínas virales de la polimerasa compleja (L, P, N y M2-1), se colocan en vectores de expresión individual bajo secuencias de control de polimerasa de T7. La transfección de estos elementos en células BSR-T7/5, que estable expresan T7 polimerasa, permite la replicación citoplasmática y transcripción de la RSV recombinante, dando lugar a viriones modificados genéticamente. Una RSV nueva, que está presente en la superficie celular y en el sobrenadante de cultivo de BSRT7/5, se reunió para infectar las células humanas de HEp-2 para la amplificación viral. Dos o tres rondas de amplificación son necesarios para obtener las poblaciones virales que contiene 1 x 106 a 1 x 107 unidades formadoras de placa (PFU) / mL. Métodos para la óptima recolección, congelación y valoración de las poblaciones virales se describen aquí en detalle. Ilustramos el protocolo que se presenta aquí mediante la creación de dos virus recombinantes que expresan respectivamente gratis proteína verde fluorescente (GFP) (RSV-GFP) o M2-1 viral fusionada a GFP (RSV-M2-1-GFP). Mostramos cómo utilizar RSV-GFP para cuantificar replicación RSV y la RSV-M2-1-GFP para visualizar estructuras virales, así como la dinámica de la proteína viral en células vivas, mediante técnicas de microscopia video.

En este trabajo, describe un protocolo detallado para producir virus RSV recombinantes que expresan una proteína fluorescente (figura 2). PRSV-GFP, el gene GFP se introdujo entre los genes P y M, como se describe para el gene de cerezo en el trabajo anteriormente publicado21. En el pRSV-M2-1-GFP, el gen M2 fue tocado y un gen adicional que codifica M2-1-GFP fue insertado entre SH y G genes12. El primer paso, co...

Watch this Scientific Journal Video about Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses at JoVE.com

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Se describe un método para generar y amplificar genéticamente modificados virus sincitiales respiratorios (RSVs) y un ensayo de placa optimizada para RSVs. Ilustramos este protocolo mediante la creación de dos virus recombinantes que respectivamente permiten cuantificación de replicación RSV y análisis de cuerpos de inclusión de RSV y gránulos asociada a cuerpos de inclusión dinámica en vivo.

Generación, amplificación y titulación de virus sincitiales respiratorios recombinantes

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

El uso de virus recombinantes es una tecnología poderosa tanto para descifrar los mecanismos de replicación viral como para proporcionar plataformas de desarrollo para las vacunas. Del mismo modo, la generación de stock viral de buena calidad es crucial para cada estudio viral desde la investigación más fundamental hasta los estudios aplicados. El rescate de virus recombinantes, la cosecha óptima, la congelación y la valoración de las poblaciones de RSV son métodos críticos para todos los estudios virológicos.Pueden considerarse tradicionales, pero siguen siendo delicadas y requieren conocimientos especializados específicos. El día antes de la transfección, suspenda las células BSR-T7/5 en un medio completo a 0,5 millones de células por mililitro de concentración. Distribuir dos mililitros de la suspensión celular por pozo en una placa de seis pozos.Incubar la placa a 37 grados celsius en 5% dióxido de carbono hasta que alcancen 80-90% de confluencia al día siguiente. Para rescatar cada virus, primero mezcle vectores genéticos inversos descongelados en un tubo y, a continuación, proceda a la transfección, siguiendo el protocolo del fabricante del reactivo de transfección. A continuación, añada 250 microlitros del medio sérico reducido a los vectores mixtos.En otro tubo, diluir 10 microlitros de este reactivo de transfección en 250 microlitros del medio sérico reducido. Vórtice suavemente ambos tubos y espere cinco minutos. Mezclar el contenido de ambos tubos y esperar 20 minutos a temperatura ambiente.Mientras tanto, enjuague las células BSR-T7/5 con un mililitro del medio sérico reducido y distribuya 1,5 mililitros de antibióticos medios esenciales mínimos libres complementados con 10% de suero de ternera fetal por pozo. Si es necesario, incubar a 37 grados centígrados en un 5% de ambiente de dióxido de carbono. Después de la incubación de 20 minutos, agregue 500 microlitros de la mezcla de transfección en cada poción.Incubar las células a 37 grados centígrados en un entorno de dióxido de carbono del 5% durante tres días. Para monitorear la eficiencia de rescate, observe la fluorescencia GFP bajo un microscopio de fluorescencia invertido a un aumento de 20 veces una vez al día. En el tercer día de transfección, células de arañazos en cada pocópta de la placa transfectada BSR-T7/5 de seis pocillos.Transfiera las células y el sobrenadante de cada pozo en un tubo estéril de microcentrífuga de dos mililitros. Para liberar el virus rescatado de las membranas celulares, vórtice cada tubo vigorosamente durante al menos 30 segundos. Para la primera amplificación de los virus rescatados, primero retire el medio de cultivo de la placa HEp-2 sembrada el día anterior, luego agregue rápidamente 500 microlitros por pozo de la nueva suspensión viral de paso cero.Coloque la placa HEp-2 a 37 grados Celsius en un balancín de sierra para una agitación suave durante dos horas. Para producir el primer paso de los virus rescatados, deseche 500 microlitros del inóculo y añada dos mililitros de MEM con 2%FCS. Incubar la placa a 37 grados centígrados en un 5% de dióxido de carbono durante tres días.Para controlar la infección bajo un microscopio de fluorescencia invertido a un aumento de 20X, observe la fluorescencia GFP de las células HEp-2 infectadas con la suspensión de paso cero una vez al día. Bajo un microscopio de campo brillante, observe la aparición de una pequeña sinictia y desprendimiento celular, que refleja el efecto citopático del VHS. Para amplificar los virus rescatados, primero diluya la suspensión viral del MEM libre de FCS para obtener una suspensión de tres mililitros a 50.000 PFU por mililitro, luego retire el medio del matraz HEp-2.Agregue rápidamente la suspensión viral de tres mililitros e incubar el matraz a 37 grados Centígrados en un balancín de sierra para una agitación suave durante dos horas. A continuación, retire y deseche el inóculo y añada 15 mililitros de MEM con 2%FCS. Incubar a 37 grados centígrados en 5% dióxido de carbono durante dos a cuatro días.Para estimar el momento adecuado para cosechar los virus, compruebe la morfología celular y la fluorescencia de la GFP bajo un microscopio de fluorescencia invertido a un aumento de 20 veces. Tenga en cuenta que esto es generalmente cuando 50%a 80% de la capa celular HEp-2 se separa debido al efecto citopático del VHS que ocurre entre 48 y 72 horas después de la infección. A continuación, raspe todas las células usando un rascador de celdas.Recoger las células y el sobrenadante juntos y transferirlos a un tubo centrífugo de 50 mililitros. Añadir 1/10 del volumen de la solución de conservación 10X RSV. Vórtice los tubos vigorosamente durante cinco segundos y centrifugar durante cinco minutos a 200 veces g para aclarar la suspensión.Transfiera el sobrenadante a un tubo de 50 mililitros. Vortex brevemente y aliquot la suspensión en tubos criogénicos etiquetados con etiquetas resistentes al alcohol. Sumerja el tubo en alcohol preenfriado, menos 80 grados centígrados durante al menos una hora y guárdelo a menos 80 grados centígrados.Para realizar un ensayo de valoración de placa, primero haga 2X medio esencial mínimo diluyendo comercial 10X MEM con agua estéril y añadiendo L-glutamina, 1.000 unidades por penicilina mililitro, y un miligramo por estreptomicina mililitro. Agitar la dilución vigorosamente y almacenarla en cuatro grados Celsius, luego añadir 900 microlitros del MEM libre de FCS a seis tubos. Descongelar las alícuotas del virus y vórtice vigorosamente durante cinco segundos.Para hacer diluciones en serie, primero agregue 100 microlitros del virus a 900 microlitros del medio en el primer tubo. Coloque la tapa en el tubo y mezcle su contenido por vórtice durante unos segundos, luego agregue 100 microlitros de la primera dilución a 900 microlitros del medio en el segundo tubo. Coloque la tapa en el tubo y el vórtice.Repita este procedimiento hasta el sexto tubo. Escriba el nombre del virus y las diluciones completas en las placas HEp-2 de 12 pocillos. Agregue una marca para que coincida con la placa y su cubierta, ya que pueden separarse durante la tinción.Retire el medio de las placas y distribuya 400 microlitros de una dilución por pozo. Incubar las placas a 37 grados centígrados durante dos horas para la adsorción del virus. Durante la adsorción del virus, preparar la superposición de celulosa microcristalina ajustando primero el pH del MEM 2X a alrededor de 7.2 con una solución estéril de bicarbonato de sodio en 7.5%después del indicador de color.Para obtener 100 mililitros de la superposición, añadir 10 mililitros de 2X MEM, 10 mililitros de 2.4%suspensión de celulosa monocristalina, y 80 mililitros del MEM complementados con 2%FCS y mezclar vigorosamente. Al final de la incubación de dos horas, añadir dos a tres mililitros de la superposición a cada pocillo de las placas de 12 pocillos sin quitar el inóculo. Incubar la placa a 37 grados centígrados en un 5% de dióxido de carbono durante seis días.Para manchar las células con solución violeta cristalina, primero agita suavemente las placas para quitar la superposición de celulosa microcristalina. Retire los sobrenadantes y lave las células dos veces con 1X PBS, luego agregue uno a dos mililitros de la solución violeta cristalina y espere de 10 a 15 minutos. Retire la solución, que se puede reutilizar para la posterior tinción de placas.Finalmente calcular los títulos del virus como una fracción del número de placas visibles en los pocillos de las placas secas y el volumen del inóculo y la dilución. Realizar un ensayo de placa en el control negativo, trans infectado con sólo los plásmidos de expresión de N, P, L y M2-1 no reveló ninguna placa en la dilución más baja. Se esperaba que los títulos obtenidos de las células trans infectadas estuvieran por encima de 100 PFU por mililitro si el rescate era eficiente.Los títulos aumentaron sobre los pasajes para llegar a un millón a 10 millones de PFU por mililitro en el pasaje uno o dos. Gracias a estos virus fluorescentes, la inhibición de la expresión del RSV por siRNA dirigida a la proteína N y la proteína celular IMPDH se puede observar y medir fácilmente. Por el contrario, se observó y midió una señal GFP fuerte en las células de control trans infectadas con siRNA no focaliz reducida o células transfectadas con siRNA contra la proteína celular GAPDH.Del mismo modo, estos virus permitieron una fácil observación de la inhibición de la multiplicación del VHS por un compuesto antiviral. El seguimiento de la proteína fluorescente M2-1 en células infectadas por HEp-2 mostró IBs y gránulos asociados al IB como estructuras muy dinámicas. Los IB se observaron como estructuras móviles y esféricas capaces de fusionarse y formar inclusiones esféricas más grandes.Los gránulos asociados al IB se sometieron a ciclos continuos de desmontaje del ensamblaje con la formación de pequeños gránulos asociados al IB que crecieron, se fusionaron en grandes gránulos asociados al IB y luego desaparecieron. El protocolo de valoración de la placa del RSV mediante superposición de celulosa microcristalina puede adaptarse fácilmente a otras células y/u otros virus. Será necesario ajustar la concentración de la celulosa microcristalina.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Generación de recombinantes del virus de influenza a partir del ADN plásmido

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Investigación

Inmunología e Infección

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

El aislamiento de las variantes de los virus de ARN de fidelidad y caracterización de la frecuencia de mutación de virus

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Producción y Titulación de recombinantes adeno-asociado vectores virales

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Mal plegamiento de proteínas priones de amplificación cíclica

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

El establecimiento de un cultivo líquido cubierto de las vías respiratorias humanas epiteliales polarizadas Calu-3 células para estudiar la respuesta del huésped celular a patógenos respiratorios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Generación de Arenavirus recombinante para el Desarrollo de Vacunas de la FDA aprobados células Vero

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Screening de alto rendimiento para los de amplio espectro químico Inhibidores de Virus ARN

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el Estudio de la mucosa Inmunidad

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...