Name: generation, amplification, and titration of recombinant respiratory syncytial viruses
Uploaded: 2019-04-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses at JoVE.com

Författarna vill tacka Dr Qin Yu från AstraZeneca R & D Boston, MA, USA, för att tillhandahålla den AZD4316 drogen. Författarna är tacksam till Cymages plattform för tillgång till ScanR Olympus mikroskopet, som stöddes av bidrag från regionen Ile-de-France (DIM en hälsa). Författarna erkänner stöd från INSERM och Versailles Saint-Quentin universitetet.

1. materiella beredning
<ol><li>Köpa cell media (minskad serum media, minsta nödvändiga media [MEM], 10 x MEM och Dulbecco ändrade örnens medium [DMEM]), transfection reagens och mikrokristallin cellulosa (se Tabell för material).</li>
	<li>Få följande vektorer för omvänd genetik: den genomiska vector(s) och uttryck vektorer kodning N proteinet och de polymeras komplexa proteinerna. Genomisk vektorer innehåller full cDNA genomet av RSV-GFP (p-RSV-GFP) och 1GFP-RSV-M2 (p-RSV-M2-1GFP) nedströ...

<ol>
	<li>Shi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+disease+burden+estimates+of+acute+lower+respiratory+infections+due+to+respiratory+syncytial+virus+in+young+children+in+2015:+a+systematic+review+and+modelling+study.">Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study.</a> The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).</li><li>Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+Syncytial+Virus+Infection+in+Elderly+and+High-Risk+Adults.">Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults.</a> The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).</li><li>DeVincenzo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+Oral+ALS-008176+in+a+Respiratory+Syncytial+Virus+Challenge+Study.">Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).</li><li>DeVincenzo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+GS-5806+Activity+in+a+Respiratory+Syncytial+Virus+Challenge+Study.">Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).</li><li>Afonso, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales:+update+2016.">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016.</a> Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).</li><li>Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+elongation+factor+of+respiratory+syncytial+virus,+a+nonsegmented+negative-strand+RNA+virus.">Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+bodies+are+a+site+of+ebolavirus+replication.">Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication.</a> Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).</li><li>Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+expression+redirects+vesicular+stomatitis+virus+RNA+synthesis+to+cytoplasmic+inclusions.">Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions.</a> PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958 (2010).</li><li>Lahaye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Characterization+of+Negri+Bodies+(NBs)+in+Rabies+Virus-Infected+Cells:+Evidence+that+NBs+Are+Sites+of+Viral+Transcription+and+Replication.">Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication.</a> Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).</li><li>Kolesnikova, L., M&#252;hlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+organization+of+recombinant+Marburg+virus+nucleoprotein:+comparison+with+Marburg+virus+inclusions.">Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions.</a> Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).</li><li>Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marburg+virus+inclusions:+A+virus-induced+microcompartment+and+interface+to+multivesicular+bodies+and+the+late+endosomal+compartment.">Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment.</a> European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).</li><li>Rincheval, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+cytoplasmic+inclusion+bodies+in+cells+infected+by+respiratory+syncytial+virus.">Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus.</a> Nature Communications. 8 (1), 563 (2017).</li><li>Santangelo, P. J., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+filamentous+viral+RNPs+prior+to+egress.">Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress.</a> Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).</li><li>Lifland, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Nucleoprotein+and+Inclusion+Bodies+Antagonize+the+Innate+Immune+Response+Mediated+by+MDA5+and+MAVS.">Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS.</a> Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).</li><li>Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+inclusions+of+respiratory+syncytial+virus-infected+cells:+formation+of+inclusion+bodies+in+transfected+cells+that+coexpress+the+nucleoprotein,+the+phosphoprotein,+and+the+22K+protein.">Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein.</a> Virology. 195 (1), 243-247 (1993).</li><li>Brown, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+an+association+between+heat+shock+protein+70+and+the+respiratory+syncytial+virus+polymerase+complex+within+lipid-raft+membranes+during+virus+infection.">Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection.</a> Virology. 338 (1), 69-80 (2005).</li><li>Radhakrishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+analysis+of+purified+respiratory+syncytial+virus+particles+reveals+an+important+role+for+heat+shock+protein+90+in+virus+particle+assembly.">Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).</li><li>Racaniello, V. R., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloned+poliovirus+complementary+DNA+is+infectious+in+mammalian+cells.">Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells.</a> Science. 214 (4523), 916-919 (1981).</li><li>Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+rabies+viruses+from+cloned+cDNA.">Infectious rabies viruses from cloned cDNA.</a> The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).</li><li>Collins, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+infectious+human+respiratory+syncytial+virus+from+cloned+cDNA+confirms+an+essential+role+for+the+transcription+elongation+factor+from+the+5'+proximal+open+reading+frame+of+the+M2+mRNA+in+gene+expression+and+provides+a+capability+for+vaccine.">Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).</li><li>Rameix-Welti, M. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+replication+of+respiratory+syncytial+virus+in+cells+and+in+living+mice.">Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice.</a> Nature Communications. 5, 5104 (2014).</li><li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+(BRSV)+from+cDNA:+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture,+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter.">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).</li><li>Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+activity+and+molecular+mechanism+of+an+orally+active+respiratory+syncytial+virus+fusion+inhibitor.">Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).</li><li>Derscheid, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+respiratory+syncytial+virus+memphis+37+grown+in+HEp-2+cells+causes+more+severe+disease+in+lambs+than+virus+grown+in+vero+cells.">Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells.</a> Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).</li><li>McKimm-Breschkin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+plaque+assay+for+respiratory+syncytial+virus+-+direct+visualization+of+plaques+without+immunostaining.">A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus - direct visualization of plaques without immunostaining.</a> Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virology Journal. 7, 1-7 (2006).</li><li>Novina, C. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNAi+revolution.">The RNAi revolution.</a> Nature. 430 (6996), 161-164 (2004).</li><li>Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+inosine+5'-monophosphate+dehydrogenase+and+the+design+of+novel+inhibitors.">The structure of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors.</a> Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).</li><li>Beaucourt, S., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribavirin:+A+drug+active+against+many+viruses+with+multiple+effects+on+virus+replication+and+propagation.+Molecular+basis+of+ribavirin+resistance.">Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance.</a> Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).</li><li>Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Ribavirin+on+Respiratory+Syncytial+Virus+in+vitro.">Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).</li><li>Sim&#245;es, E. A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past,+Present+and+Future+Approaches+to+the+Prevention+and+Treatment+of+Respiratory+Syncytial+Virus+Infection+in+Children.">Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children.</a> Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).</li><li>Alvarez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-mediated+silencing+of+the+respiratory+syncytial+virus+nucleocapsid+defines+a+potent+antiviral+strategy.">RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).</li><li>DeVincenzo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+double-blind,+placebo-comtrolled+study+of+an+RNAi-based+therapy+directed+against+respiratory+syncytial+virus.">A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+a+CRISPR/Cas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells.">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).</li><li>Nikolic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negri+bodies+are+viral+factories+with+properties+of+liquid+organelles.">Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles.</a> Nature Communications. 8 (1), 58 (2017).</li></ol>

Här presenterar vi en metod för räddning av rekombinant RSVs från fem plasmider och deras förstärkning. Förmågan att manipulera genomet hos virus har revolutionerat virologi forskning för att testa mutationer och uttrycka en extra gen eller en taggad virala protein. RSV har vi beskrivs och används som ett exempel i den här artikeln är ett virus som uttrycker en reporter gen, RSV-GFP (opublicerade) och uttrycker ett M2-1 protein smält till en god Jordbrukarsed tag12. RSV räddning är ...

Mänskliga RSV är den främsta orsaken till sjukhusvård för akut luftvägsinfektion i spädbarn i världen1. Dessutom, är RSV associerade med en betydande sjukdomsbördan hos vuxna jämförbara med influensa, med de flesta sjukhusvård och dödlighet börda i äldre2. Det finns inga vacciner eller specifika antivirala läkemedel tillgängliga ännu mot RSV, men lovande nya läkemedel är i utveckling3,4. Komplexiteten och tyngden av teknikerna av kvantifiering av RSV multiplikation hindra sökandet efter antivirala läkemedel eller vacciner trots nuvarande betydande ansträngningar. Kvantifiering av RSV multiplikation in vitro-bygger i allmänhet på mödosamma, tidskrävande och dyra metoder, som består mestadels i analysen av de cytopatisk effekten av mikroskopi, immunfärgning, plack minskning analyser, kvantitativa omvänt transkriptas (qRT)-polymeras-kedjereaktion (PCR) och glykoproteinenzymkopplad immunadsorberande analys tester. Virus med modifierade arvsmassan och uttrycka reporter gener, såsom de som kodar för GFP, är mer lämpade för sådana föreställningar. Kopplat till användningen av automatiserade plattan läsare, kan reporter gen-carrying rekombinanta virus göra dessa analyser mer lämpade för standardisering och hög genomströmning.
RSV är ett höljebärande, nonsegmented negativ-sense RNA-virus som tillhör släktet Orthopneumovirus av Pneumoviridae familj, ordning Mononegavirales5. RSV genomet är en singel-strand, negativ-känsla RNA ca 15 KB, som innehåller en icke-kodande regionen på 3' och 5' extremiteter kallas ledare och Trailer och 10 transkriptionell enheter kodning 11 proteiner. Generna är ordnade enligt följande: 3'-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (kodning för M2-1 och M2-2 proteiner) och L-5'. Genomisk RNA är ordentligt förpackad av nucleoprotein N. med encapsidated genomisk RNA som mall, viral RNA-beroende RNA-polymeras (RdRp) kommer att säkerställa transkription och replikering av viral RNA. Viral RdRp består av stora protein L som bär nukleotid polymeras aktiviteten i sig, dess obligatoriska kofaktor i phosphoprotein P och M2-1 protein som fungerar som en viral transkription faktorn6. I infekterade celler inducerar RSV bildandet av cytoplasmisk inneslutningar kallas integration organ (IBs). Morfologiskt liknande cytoplasmiska inneslutningar har observerats för flera Mononegavirales7,8,9,10. Nyligen genomförda undersökningar om rabies, vesikulär stomatit virus (VSV), ebolaviruset, och RSV visade att viral RNA-syntes förekommer i IBs, som kan således betraktas som viral fabriker8,9,11, 12. virus fabrikerna koncentrera den RNA och virala proteiner krävs för viral RNA-syntes och även innehålla cellproteiner13,14,15,16, 17. IBs uppvisar en funktionell subcompartment kallas IB-associerade granulat (IBAGs), som koncentrerar sig på nya synthetized begynnande virala mRNA tillsammans med proteinet M2-1. Genomisk RNA och L, P och N identifieras inte i IBAGs. IBAGs är små dynamiska sfäriska strukturer inuti IBs som uppvisar egenskaper för flytande organeller12. Trots den centrala rollen som IBs i viral multiplikation, är mycket lite känt om naturen, intern struktur, bildandet och driften av dessa virala fabriker.
Uttrycket av genomet hos ett poliovirus från en cDNA aktiverat produktion av den första smittsamma virus klonen i 198118. För enkelsträngat negativa RNA-virus var det inte förrän 1994 att produktionen av ett första rabiesvirus efter transfection av plasmider i celler19 ägde rum. Den första plasmid-baserade omvänd genetiska systemet för RSV publicerades 199520. Omvänd genetik har lett till stora framsteg inom virologi. Möjligheten att införa särskilda ändringar i det virala genomet har gett viktiga insikter i replikering och patogenesen av RNA-virus. Denna teknik har också underlättat utvecklingen av vacciner genom att låta specifika dämpning genom riktade rad ändringar. Genomet ändringar möjliggör en snabb kvantifiering av viral multiplikation kraftigt förbättrat antivirala screening och studie av deras verkningssätt.
Även om tidigare beskrivits, fortfarande att erhålla genetiskt modifierade RSVs känslig. Här, detalj vi ett protokoll för att skapa två typer av rekombinant HRSV, respektive uttrycker RSV-GFP eller RSV-M2-1-GFP. I detta protokoll beskriver vi de transfection villkor behövs för att rädda de nya rekombinanta virus, liksom deras förstärkning få viral bestånd med hög titer, lämpade för reproducerbara experimenterande. Byggandet av omvänd genetik vektorer beskrivs i sig inte här. Vi beskriva metoder för optimal skörd och frysning av viral bestånd. Den mest exakta metoden att kvantifiera infektiösa viruspartiklar förblir plack assay. Celler infekterade med seriespädningar av analyserade upphängning och inkuberas med ett överlägg som förbjuder diffusionen av fria viruspartiklar i supernatanten. Under sådana förhållanden kommer viruset endast infektera sammanhängande celler bildar ett ”plack” för varje inledande infektiös partikel. I konventionella RSV titrering analysen, är plack avslöjade genom immunfärgning och räknade under mikroskopisk observation. Denna metod är dyra och tidskrävande. Här har vi beskrivit ett mycket enkelt protokoll för en RSV plack analys använder mikrokristallin cellulosa overlay som gör att bildandet av plack som är synliga för blotta ögat. Vi visar hur RSV-GFP kan användas till åtgärd RSV replikering och, således, att kvantifiera effekterna av antivirala läkemedel. Kombinera omvänd genetik och levande bildteknik, visar vi hur RSV-M2-1-GFP tillåter forskare att visualisera M2-1 i levande celler och följa dynamiken i intracellulära viral strukturer, såsom IBs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm &#181; dish for live cell imaging</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avicel RC-591</td>
			<td>FMC BioPolymer</td>
			<td>Avicel RC-591</td>
			<td>Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSRT7/5</td>
			<td></td>
			<td>not commercially available</td>
			<td>See ref 22. Buchholz et al, 1999</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT90132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for observations</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73 Olympus microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for videomicroscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>ScanR Olympus microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEp-2</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (10X), no glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11430030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41090-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 ReagentPlus, &#8805;99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51985-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td>not commercially available</td>
			<td>see ref 21. Rameix-Welti et al, 2014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>See Saw Rocker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA GAPDH</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus siRNA 
			D-001810-10-05</td>
			<td>SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA IMPDH2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human 
			L-004330-00-0005</td>
			<td>SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. 
			Individual references and sequences 
			J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; 
			J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; 
			J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; 
			J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si RNA RSV N</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus custom siRNA</td>
			<td>UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiRNA NT</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiRNA transfection reagent</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03</td>
			<td>Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate 7.5% solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25080094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrofluorometer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Tecan infinite M200PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, amplification, and titration of recombinant respiratory syncytial viruses

Användning av rekombinanta virus har blivit avgörande i grundforskning eller tillämpad virologi. Omvänd genetik har visat sig vara en extremt kraftfull teknik, både att dechiffrera virusreplikation mekanismer och att studera antivirala medel eller ge utvecklingsplattformen för vacciner. Konstruktion och manipulation av en omvänd genetiska system för en negativ-strand RNA virus såsom en respiratory syncytial virus (RSV), men fortfarande är känsliga och kräver särskilda know-how. RSV genomet är en singel-strand, negativ-känsla RNA av ca 15 kb som fungerar som en mall för både viral RNA replikation och transkription. Vår omvänd genetik system använder en cDNA kopia av RSV lång stam humangenomet (HRSV). Detta cDNA, as well as cDNAs kodning virala proteiner av polymerasen komplexa (L, P, N och M2-1), placeras i enskilda uttryck vektorer under T7 polymeras kontroll sekvenser. Transfection av dessa element i BSR-T7/5 celler, som stabilt express T7-polymeras, tillåter den cytoplasmiska replikation och transkription av rekombinant RSV, ger upphov till genetiskt modifierade virioner. En ny RSV, som finns på cellens yta och i kultur supernatanten BSRT7/5, samlas för att infektera mänskliga HEp-2 celler för viral förstärkning. Två eller tre omgångar av förstärkning behövs för att få viral spad innehållande 1 x 106 till 1 x 107 plaque-forming enheter (PFU) / mL. Metoder för optimal skörd, frysning, och titrering av viral bestånd beskrivs här i detalj. Vi illustrera protokollet presenteras här genom att skapa två rekombinanta virus respektive uttrycker gratis grönt fluorescerande protein (GFP) (RSV-GFP) eller viral M2-1 smält till GFP (RSV-M2-1-GFP). Vi visar hur du använder RSV-GFP för att kvantifiera RSV replikering och den RSV-M2-1-GFP att visualisera viral strukturer, samt virala protein dynamics i levande celler, med hjälp av video mikroskopi tekniker.

I detta arbete beskrev vi ett detaljerat protokoll för att producera rekombinant RSV virus uttrycker en fluorescerande protein (figur 2). PRSV-GFP introducerades den GFP-genen mellan P och M generna, som beskrivs för Cherry-genen i tidigare publicerade arbete21. I den pRSV-M2-1-GFP, M2 genen var lämnas orörd och en extra gen som kodar för M2-1-GFP sattes in mellan SH och G gener12. Det första steget, motsv...

Watch this Scientific Journal Video about Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses at JoVE.com

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

Vi beskriver en metod för att skapa och förstärka genetiskt modifierade respiratory syncytial virus (RSVs) och en optimerad plack analys för RSVs. Vi illustrerar detta protokoll genom att skapa två rekombinanta virus som respektive möjliggör kvantifiering av RSV replikering och live analys av RSV inkludering organ och organ i inkludering-associerade granulat dynamics.

Generation, amplifiering och titrering av rekombinant respiratoriska Syncytial virus

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Användning av rekombinanta virus är en kraftfull teknologi både för att dechiffrera virusreplikationsmekanismerna och för att tillhandahålla utvecklingsplattformar för vacciner. Likaså är generering av viralt lager av god kvalitet avgörande för varje viral studie från den mest grundläggande forskningen till de tillämpade studierna. Räddning av rekombinanta virus, optimal skörd, frysning, och titrering av RSV-bestånd är kritiska metoder för alla virologiska studier.De kan betraktas som traditionella men förblir känsliga och kräver särskild expertis. Dagen före transfektion, avbryta BSR-T7/5 celler i komplett medium på 0,5 miljoner celler per milliliter koncentration. Fördela två milliliter av cellupphängningen per brunn i en sex-brunnsplatta.Inkubera plattan vid 37 grader Celsius i 5%koldioxid tills de når 80-90% konfluency nästa dag. För att rädda varje virus, först blanda tinade omvänd genetik vektorer i ett rör, sedan vidare till transfection, efter transfection reagens tillverkarens protokoll. Nästa lägga 250 mikroliter av den reducerade serum medium till de blandade vektorer.I ett annat rör, späd 10 mikroliter av detta transfektionsreagens i 250 mikroliter av det reducerade serummediet. Virvel försiktigt båda rören och vänta i fem minuter. Blanda innehållet i båda rören och vänta i 20 minuter vid rumstemperatur.Under tiden skölj BSR-T7/5 celler med en milliliter av den reducerade serum medium och distribuera 1,5 milliliter av minsta väsentliga medier antibiotika gratis kompletteras med 10%fetala kalv serum per brunn. Inkubera vid 37 grader Celsius vid behov i 5%koldioxidmiljö. Efter 20-minuters inkubation, tillsätt 500 mikroliter av transfection mix i varje brunn.Inkubera cellerna vid 37 grader Celsius i 5%koldioxid miljö i tre dagar. För att övervaka räddningseffektiviteten, observera vid GFP fluorescens under ett inverterat fluorescensmikroskop vid 20X förstoring en gång per dag. På den tredje dagen av transfektion, skrapa celler i varje brunn av transfected BSR-T7/5 sex-väl plattan.Överför celler och supernatant av varje brunn i en steril två-milliliter microcentrifugrör. För att frigöra det räddade viruset från cellmembranen, virvel varje rör kraftigt i minst 30 sekunder. För den första förstärkningen av de räddade virusen, ta först bort odlingsmediet från HEp-2-plattan som är seedade dagen innan, tillsätt sedan snabbt 500 mikroliter per brunn av den färska passage-zero viral suspension.Placera HEp-2-plattan på 37 grader Celsius på en gungbräda rocker för mjuk agitation i två timmar. För att producera den första passagen av de räddade virusen, kassera 500 mikroliter av inokulat och tillsätt två milliliter MEM med 2%FCS. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius i 5%koldioxid i tre dagar.För att övervaka infektionen under en inverterad fluorescens mikroskop vid 20X förstoring, observera GFP fluorescens av HEp-2 celler infekterade med passage-noll suspensionen en gång per dag. Under ett ljusfält mikroskop, observera utseendet på små syncytia och cell lossnar, som återspeglar RSV cytopatisk effekt. För att förstärka de räddade virusen, späd först ut den virala suspensionen av FCS-fri MEM för att få en tre-milliliter suspension vid 50, 000 PFU per milliliter, sedan ta bort mediet från HEp-2 kolven.Tillsätt snabbt den tre milliliter viral suspension och inkubera kolven på 37 grader Celsius på en gungbräda rocker för mjuk agitation i två timmar. Nästa ta bort och kasta inokulat och tillsätt 15 milliliter MEM med 2%FCS. Inkubera vid 37 grader Celsius i 5%koldioxid i två till fyra dagar.För att uppskatta rätt tid att skörda virusen, kontrollera cellmorfologi och GFP fluorescens under en inverterad fluorescens mikroskop vid 20X förstoring. Observera att detta är oftast när 50%till 80%av HEp-2 celllagret lösgörs på grund av RSV cytopatisk effekt som uppstår mellan 48 och 72 timmar efter infektion. Nästa skrapa alla celler med hjälp av en cell skrapa.Samla både cellerna och supernatanten tillsammans och för över dem till ett centrifugrör på 50 milliliter. Lägg till 1/10 av volymen för 10X RSV-bevarandelösningen. Vortexa rören kraftigt i fem sekunder och centrifug i fem minuter vid 200 gånger g för att klargöra suspensionen.Överför supernatanten till ett 50-milliliterrör. Vortex kort och alikvot suspensionen i kryogena rör märkta med alkoholresistenta taggar. Sänk röret i färdigkyld, minus 80 grader-Celsius alkohol i minst en timme och förvara dem på minus 80 grader Celsius.För att utföra en plakett titrering analys, först göra 2X minsta väsentliga medium genom att späda kommersiella 10X MEM med sterilt vatten och lägga L-glutamin, 1, 000 enheter per milliliter penicillin, och ett milligram per milliliter streptomycin. Skaka utspädningen kraftigt och förvara den i fyra grader Celsius och tillsätt sedan 900 mikroliter av FCS-fria MEM till sex rör. Tina viruset alikvoter och virvel dem kraftigt i fem sekunder.För att göra serieutspädningar, först lägga 100 mikroliter av viruset till 900 mikroliter av mediet i det första röret. Sätt locket på röret och blanda dess innehåll genom att vortexa i några sekunder, tillsätt sedan 100 mikroliter av den första utspädningen till 900 mikroliter av mediet i det andra röret. Sätt locket på röret och virveln.Upprepa denna procedur tills det sjätte röret. Skriv virusnamnet och de fullständiga spädningarna på HEp-2 12-brunnsplattorna. Lägg till ett märke för att matcha plattan och dess omslag eftersom de kan vara separerade under färgningen.Ta bort mediet från plattorna och fördela 400 mikroliter med en spädning per brunn. Inkubera plattorna vid 37 grader Celsius i två timmar för virus adsorption. Under viruset adsorption, förbereda mikrokristallin cellulosa överlägg genom att först justera pH i 2X MEM till runt 7,2 med en steril natriumbikarbonat lösning på 7,5%efter färgindikatorn.För att få 100 milliliter av överlagringen, tillsätt 10 milliliter 2X MEM, 10 milliliter 2,4%monokristallina cellulosa suspension, och 80 milliliter av MEM kompletteras med 2%FCS och blanda kraftigt. I slutet av den två timmar långa inkubationen, tillsätt två till tre milliliter av överlagringen till varje brunn av 12-brunnsplattorna utan att ta bort inokulatet. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius i 5%koldioxid i sex dagar.För att färga cellerna med kristallviolett lösning, skaka först försiktigt plattorna för att ta av mikrokristallin cellulosaöverlägg. Ta bort supernatanterna och tvätta cellerna två gånger med 1X PBS, tillsätt sedan en till två milliliter av kristallviolettlösningen och vänta 10 till 15 minuter. Ta bort lösningen, som kan återanvändas för efterföljande plåt-färgning.Slutligen beräkna viruset titers som en bråkdel av antalet synliga plack i brunnarna i de torra plattorna och inokulat volym och utspädning. Utför en plakett analys på den negativa kontrollen, transfected med endast uttrycket plasmider av N, P, L och M2-1 visade ingen plakett på den lägsta utspädning. Titersna som erhölls från de transfected cellerna förväntades för att vara över 100 PFU per milliliter, om räddningsaktionen var effektiv.Titersna ökade över passagerna för att nå en miljon till 10 miljoner PFU per milliliter vid passage ett eller två. Tack vare dessa fluorescerande virus kan hämning av RSV-uttryck genom att siRNA rikta in sig på proteinet N och det cellulära proteinet IMPDH lätt observeras och mätas. Däremot observerades och mättes en stark GFP-signal på kontrollceller som transfekterats med icke-inriktning på siRNA eller celler som transfekterades med siRNA mot cellproteinet GAPDH.Jämväl dessa virus möjliggjorde enkel observation av hämningen av RSV multiplikation av en antiviral läkemedelsförening. Spåra fluorescerande proteinet M2-1 i HEp-2-infekterade celler visade IBs och IB-associerade granulat som mycket dynamiska strukturer. IBs observerades som mobila och sfäriska strukturer kunna säkring och att bilda större sfäriska inneslutningar.IB-associerade granulat genomgick kontinuerlig montering-demontering cykler med bildandet av små IB-associerade granulat som växte, smält till stora IB-associerade granulat, och sedan försvann. Protokollet av plack titrering av RSV med hjälp av mikrokristallin cellulosa överlagring kan lätt anpassas till andra celler och/eller andra virus. Det kommer att kräva justering av koncentrationen av mikrokristallin cellulosa.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Generering av Rekombinant influensavirus från Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolering av Fidelity Varianter av RNA-virus och karakterisering av virus mutationsfrekvensen

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Produktion och Titering av rekombinanta Adeno-associerad virala vektorer

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Protein felveckning Cyklisk amplifiering av prioner

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Att upprätta en flytande täckt kultur av polariserad Human luftvägsepitelceller Calu-3 celler för att studera svar värdcellen för luftvägspatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Generering av Rekombinant arenavirus för Vaccine utveckling i FDA-godkända Vero celler

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput screening för brett spektrum kemiska inhibitorer av RNA-virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administration av rekombinant influensavacciner i chimär musmodeller för att studera slemhinneimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...