Name: using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data
Uploaded: 2019-05-15T13:00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة منحة R01 GM125943، المنحة الجغرافية الوطنية CP-044R-17؛ منحة صندوق البحوث الآيسلندي ة 152336-051؛ وجامعة إلينوي في صناديق بدء التشغيل شيكاغو. كما نشكر المساهمين التالين: الدكتورة أماندا بولمان على مساعدتها في معايير اكتساب بروتين MALDI-TOF MS. الدكتور تيري مور والدكتور أتول جاين لبلورة ألفا-سيانو-4-هيدروكسيسيناميك حمض مصفوفة (CHCA).

<ol>
	<li>Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+TOF+MS+profiling+of+bacteria+at+the+strain+level:+A+review.">MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review.</a> Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).</li><li>Cain, T. C., Lubman, D. M., Weber, W. J., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+bacteria+using+protein+profiles+from+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Differentiation of bacteria using protein profiles from matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8 (12), 1026-1030 (1994).</li><li>Holland, R. D., Wilkes, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+intact+whole+bacteria+based+on+spectral+patterns+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+with+time-of-flight+mass+spectrometry.">Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 10 (10), 1227-1232 (1996).</li><li>Rahi, P., Prakash, O., Shouche, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass-spectrometry+(MALDI-TOF+MS)+based+microbial+identifications:+challenges+and+scopes+for+microbial+ecologists.">Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass-spectrometry (MALDI-TOF MS) based microbial identifications: challenges and scopes for microbial ecologists.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1359 (2016).</li><li>Silva, R., Lopes, N. P., Silva, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+MALDI+mass+spectrometry+in+natural+products+analysis.">Application of MALDI mass spectrometry in natural products analysis.</a> Planta Medica. 82, 671-689 (2016).</li><li>Clark, C. M., Costa, M. S., Sanchez, L. M., Murphy, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+MALDI-TOF+mass+spectrometry+protein+and+specialized+metabolite+analyses+to+rapidly+discriminate+bacterial+function.">Coupling MALDI-TOF mass spectrometry protein and specialized metabolite analyses to rapidly discriminate bacterial function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4981-4986 (2018).</li><li>Freiwald, A., Sauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+classification+and+identification+of+bacteria+by+mass+spectrometry.">Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 4 (5), 732-742 (2009).</li><li>Schulthess, B., Bloemberg, G. V., Zbinden, R., B&#246;ttger, E. C., Hombach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Bruker+MALDI+Biotyper+for+identification+of+Gram-positive+rods:+development+of+a+diagnostic+algorithm+for+the+clinical+laboratory.">Evaluation of the Bruker MALDI Biotyper for identification of Gram-positive rods: development of a diagnostic algorithm for the clinical laboratory.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1089-1097 (2014).</li><li>Schumann, P., Maier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+mass+spectrometry+applied+to+classification+and+identification+of+bacteria.">MALDI-TOF mass spectrometry applied to classification and identification of bacteria.</a> Methods in Microbiology. 41, 275-306 (2014).</li><li>Chambers, M. C., Maclean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics.">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534 (2008).</li><li>Martens, L., Chambers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mzML-a+community+standard+for+mass+spectrometry+data.">mzML-a community standard for mass spectrometry data.</a> Molecular &#38; Cellular Proteomics. 10 (1), (2011).</li></ol>

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

بروتوكول IDBac تفاصيل البروتين البكتيري والمستقلب المتخصصة الحصول على البيانات وتحليل ما يصل إلى 384 عزلات بكتيرية في 4 ح من قبل باحث واحد. مع IDBac ليست هناك حاجة لاستخراج الحمض النووي من العزلات البكتيرية أو توليد مقتطفات المستقلب المتخصصة من مرق التخمير السائل وتحليلها باستخدام أساليب كروماتوغرافية. بدلا من ذلك، يتم جمع البروتين وبيانات المستقلب المتخصصة ببساطة عن طريق نشر المواد من المستعمرات البكتيرية مباشرة على لوحة الهدف MALDI. وهذا يقلل إلى حد كبير من الوقت والتكلفة المرتبطة بالتقنيات البديلة مثل تسلسل الجينات 16S rRNA وLCMS9.
من المهم إضافة مصفوفة فارغة وبقع معايرة إلى لوحة MALDI، ونحن نوصي باستخدام عدد مناسب من النسخ المتماثلة لضمان استنساخ والثقة الإحصائية. وسوف تكون أعداد النسخ المتماثلة تعتمد على التجربة. على سبيل المثال، إذا كان المستخدم ينوي التمييز بين آلاف المستعمرات ومجموعة من لوحات التنوع البيئي، فقد يكون من الضروري إجراء نسخ متماثل أقل (يقوم مختبرنا بجمع ثلاثة نسخ تقنية في كل مستعمرة). بدلا من ذلك، إذا كان المستخدم يرغب في إنشاء قاعدة بيانات مخصصة من سلالات من taxa البكتيرية محددة لتحديد بسرعة تصنيفات الأنواع الفرعية من عزلات غير معروفة، ثم أكثر تكرارات مناسبة (مختبرنا يجمع ثمانية نسخ بيولوجية لكل سلالة).
IDBac هو أداة للتثواب بسرعة عالية ذات الصلة العزلات البكتيرية على أساس المعلومات التصنيفية المفترضة وإنتاج المستقلب المتخصصة. يمكن أن تكمل أو تكون بمثابة مقدمة لطرق متعامدة مثل التحليلات الوراثية المتعمقة، والدراسات التي تنطوي على إنتاج المستقلب والوظيفة، أو توصيف بنية المستقلب المتخصصة عن طريق التحليل الطيفي للرنين المغناطيسي النووي و / أو LC-MS/MS.
إنتاج المستقلب المتخصصة (IDBac MANs) هو عرضة للغاية لظروف النمو البكتيري، وخاصة باستخدام وسائل الإعلام المختلفة، وهو الحد المحتمل للطريقة. ومع ذلك يمكن استغلال هذه الصفات من قبل المستخدم، كما IDBac يمكن أن تولد بسهولة MANs تبين الاختلافات في إنتاج المستقلب المتخصصة في ظل مجموعة متنوعة من ظروف النمو. من المهم أن نلاحظ أنه في حين أن بصمات المستقلب المتخصصة قد تختلف حسب حالة النمو، فقد أظهرنا في السابق أن بصمات البروتين لا تزال مستقرة نسبيا عبر هذه المتغيرات (انظر Clark et al.6). عند التعامل مع لوحات التنوع البيئي، نوصي بتنقية العزلات البكتيرية قبل التحليل من أجل تقليل المساهمات المحتملة من الحديث البكتيري المجاور.
وأخيرا، فإن عدم وجود قاعدة بيانات عامة يمكن البحث فيها من بصمات البروتين MS هو قصور كبير في استخدام هذه الطريقة لتصنيف البكتيريا البيئية غير معروف. أنشأنا IDBac مع هذا في الاعتبار، وشملت التحويل الآلي للبيانات إلى شكل مفتوح المصدر مقبول من قبل المجتمع (mzML)10،11،12 وتصميم البرنامج للسماح بالبحث، وتقاسم، وإنشاء قواعد بيانات مخصصة. ونحن بصدد إنشاء قاعدة بيانات عامة كبيرة (>000 10 سلالات تتميز بالكامل)، مما سيسمح بتصنيف بعض العزلات إلى مستوى الأنواع، بما في ذلك وصلات بأرقام الانضمام إلى GenBank عند توافرها.
IDBac هو مفتوح المصدر والتعليمات البرمجية متاحة لأي شخص لتخصيص تحليل البيانات واحتياجات التصور. نوصي المستخدمين باستشارة مجموعة واسعة من المؤلفات (ساور وآخرون7وسيلفا وآخرون5)للمساعدة في دعم وتصميم أهدافهم التجريبية. نستضيف منتدى للمناقشة في: https://groups.google.com/forum/#!forum/idbac ووسيلة للإبلاغ عن القضايا مع البرنامج في: https://github.com/chasemc/IDBacApp/issues.

ومن العوائق الرئيسية أمام الباحثين الذين يدرسون الوظيفة البكتيرية القدرة على تقييم الهوية التصنيفية للكائنات الدقيقة وقدرتها على إنتاج الأيض المتخصص بسرعة وفي وقت واحد. وقد حال ذلك دون إحراز تقدم كبير في فهم العلاقة بين الفيلوجيني البكتيري وإنتاج المستقلب المتخصص في غالبية البكتيريا المعزولة عن البيئة. على الرغم من أن الأساليب المستندة إلىمرض التصلب العصبي المتعدد التي تستخدم بصمات البروتين لتجميع وتحديد البكتيريا هي وصف جيد 1،2،3،4، وقد أجريت هذه الدراسات عموما على مجموعات صغيرة من العزلات، بطريقة خاصة بالأنواع. والأهم من ذلك أن المعلومات المتعلقة بإنتاج المستقلب المتخصص، وهو محرك رئيسي للوظيفة الميكروبية في البيئة، ظلت غير مدمجة في هذه الدراسات. وقد قدم سيلفا وآخرون5 مؤخراً تاريخاً شاملاً يفصّل الاستخدام الناقص لـ MALDI-TOF MS لتحليل الأيض المتخصص ونقص البرمجيات اللازمة للتخفيف من الاختناقات الحالية في مجال المعلوماتية الأحيائية. من أجل معالجة أوجه القصور هذه، أنشأنا IDBac، خط أنابيب المعلوماتية الحيوية التي تدمج كل من وسائط الخطية والعاكسة من MALDI-TOF MS6. وهذا يسمح للمستخدمين لتصور بسرعة وتمييز العزلات البكتيرية على أساس كل من البروتين والمتخصصة metabolite MS بصمات الأصابع، على التوالي.
IDBac هو فعال من حيث التكلفة، والإنتاجية العالية، ومصممة للمستخدم العادي. وهي متاحة بحرية (chasemc.github.io/IDBac)، وتتطلب فقط الوصول إلى مطياف كتلة MALDI-TOF (سيكون وضع الانعكاس مطلوبا لتحليل المستقلب المتخصص). يعتمد إعداد العينات على طريقة "النقل المباشر الموسع" البسيطة7 و8 ويتم جمع البيانات مع عمليات الاستحواذ الخطية والانعكاسية المتتالية على بقعة واحدة من أهداف MALDI. مع IDBac، فمن الممكن تحليل إنتاج فيلوجيني المفترضة والمستقلب المتخصصة من مئات المستعمرات في أقل من أربع ساعات، بما في ذلك إعداد العينة، والحصول على البيانات، والتصور البيانات. وهذا يمثل ميزة كبيرة من الوقت والتكلفة على الأساليب التقليدية لتحديد البكتيريا (مثل تسلسل الجينات)، وتحليل الناتج الأيضي (قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة [LCMS] والأساليب الكروماتوغرافية المماثلة).
باستخدام البيانات التي تم الحصول عليها في تحليل الوضع الخطي، يستخدم IDBac التجميع الهرمي لتمثيل الصلة بين أطياف البروتين. وبما أن الأطياف تمثل في الغالب بروتينات ريبوسومال المأينة، فإنها توفر تمثيلاً للتنوع الجيني الفيوجيني الموجود في عينة. وبالإضافة إلى ذلك، يتضمن IDBac بيانات وضع reflectron لعرض بصمات الأصابع المستقلب المتخصصة كشبكات جمعية المستقلب (MANs). MANs هي شبكات ثنائية تسمح بالتصور السهل لإنتاج المستقلب المشترك والفريد بين العزلات البكتيرية. منصة IDBac يسمح للباحثين لتحليل كل من البروتين وبيانات المستقلب المتخصصة جنبا إلى جنب ولكن أيضا بشكل فردي إذا تم الحصول على نوع واحد فقط من البيانات. الأهم من ذلك، IDBac يعالج البيانات الخام من أدوات بروكر وشيامن، فضلا عن TXT، علامة التبويب، csv، mzXML، وmzML. يؤدي ذلك إلى إزالة الحاجة إلى التحويل اليدوي وتنسيق مجموعات البيانات، ويقلل بشكل كبير من خطر خطأ المستخدم أو سوء التعامل مع بيانات MS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>60-002-65</td>
			<td>LC-MS Ultra CHROMASOLV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex Speed LEF MALDI-TOF instrument</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics Bacterial test standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0884024</td>
			<td>Bruker Daltonics 8604530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Peptide Calibration standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9846988</td>
			<td>Bruker Daltonics 8206195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>99.5+%, Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target Plate</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-500</td>
			<td>Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any is ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC293810010</td>
			<td>99.5%, for biochemistry, ACROS Organics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>28166-41-8</td>
			<td>(C2020-25G) &#8805;98% (TLC), powder</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data

من أجل تصور العلاقة بين الفيلوجيني البكتيري وإنتاج المستقلب المتخصص للمستعمرات البكتيرية التي تنمو على أجار المغذيات، قمنا بتطوير IDBac - وهو امتصاص ليزر بمساعدة مصفوفة منخفضة التكلفة وعالية الإنتاجية بمساعدة المصفوفة/التأين خط أنابيب المعلوماتية الحيوية (MALDI-TOF MS) في وقت الطيران. تم تصميم برنامج IDBac لغير الخبراء، وهو متاح بحرية، وقادر على تحليل عدد قليل إلى الآلاف من المستعمرات البكتيرية. هنا، نقدم إجراءات لإعداد المستعمرات البكتيرية لتحليل MALDI-TOF MS، وتشغيل أداة MS، ومعالجة البيانات والتصور في IDBac. على وجه الخصوص، نحن نوجه المستخدمين كيفية تجميع البكتيريا في dendrograms على أساس بصمات البروتين MS وإنشاء شبكات جمعية المستقلب بشكل تفاعلي (MANs) من بيانات المستقلب المتخصصة.

قمنا بتحليل ست سلالات من Micromonospora chokoriensis وسلالات اثنين من عصية subtilis, التي كانت تتميز سابقا6, باستخدام البيانات المتاحة في DOI: 10.5281/zenodo.2574096. باتباع الإرشادات في علامة التبويب البدء بالبيانات الأولية، اخترنا الخيار انقر هنا لتحويل ملفات Bruker واتبعنا التعليمات التي يوفرها IDBac لكل مجموعة بيانات (الشكل 14).
بعد الانتهاء من التحويل الآلي والمعالجة المسبقة/خطوات الذروة، شرعنا في إنشاء تجربة IDBac مشتركة جديدة عن طريق نقل عينات من التجربتين إلى تجربة واحدة تحتوي على كل من عصية و عينات ميكرومونوسوبورا (الشكل 15). وشمل التحليل الناتج مقارنة أطياف البروتين باستخدام قطع المرايا، كما هو موضح في الشكل 16،الذي كان مفيداً في تقييم نوعية الأطياف وتعديل إعدادات انتقاء الذروة. يعرض الشكل 17 لقطة شاشة لنتائج تجميع البروتين مع تحديد الإعدادات الافتراضية. تم تلوين مخطط الأسنان عن طريق ضبط العتبة على المؤامرة (يظهر كخط منقط). وتجدر الإشارة إلى الفصل الواضح بين الأجناس، حيث يعزل كل من M. chokoriensis وB. subtilis التجميع بشكل منفصل.
الشكل 18والشكل 19والشكل 20 يسلط الضوء على القدرة على توليد الشبكات الانشؤية للمناطق التي يختارها المستخدم عن طريق النقر والسحب عبر مخطط الدندروغرام البروتيني. مع هذا كنا قادرين على إنشاء بسرعة MANs لمقارنة سلالات Subtilis B. فقط (الشكل 18)، فقط سلالات M. chokoriensis (الشكل 19) ، وجميع السلالات في وقت واحد (الشكل 20). وتتمثل الوظيفة الرئيسية لهذه الشبكات في تزويد الباحثين بنظرة عامة واسعة على درجة التداخل المتخصص بين البكتيريا. مع هذه البيانات في متناول اليد، والباحثين لديهم الآن القدرة على اتخاذ قرارات مستنيرة من كمية صغيرة فقط من المواد كشط من مستعمرة بكتيرية.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2.jpg"> الشكل 14: معالجة الأطياف. تم تحويل تحميل Bruker autoFlex الأطياف ومعالجتها باستخدام IDBac. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2.jpg"> الشكل 15: تجربة IDBac المشتركة. ونظرا ً لأن الأطياف الميكرومونوسبورة وعصية جمعت على لوحات مستهدفة مختلفة من MALDI، فقد تم دمج التجربتين في وقت لاحق في تجربة واحدة - "Bacillus_Micromonsopora". وقد تم ذلك ضمن علامة التبويب "العمل مع التجارب السابقة"، باتباع الاتجاهات ضمن القائمة "نقل العينات من التجارب السابقة إلى تجارب جديدة/أخرى". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 16" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2.jpg"> الشكل 16: المقارنة. تمت مقارنة Micromonspora وعصية الأطياف باستخدام المؤامرات مرآة داخل صفحة "تحليل بيانات البروتين". في نهاية المطاف، تم اختيار إعدادات الذروة الافتراضية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 17" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2.jpg"> الشكل 17: التجميع الهرمي. التجميع الهرمي، باستخدام الإعدادات الافتراضية، مجمعة بشكل صحيح عصية وعزل Micromonospora. تم تلوين مخطط الأسنان من خلال "قطع" مخطط الأسنان على ارتفاع تعسفي (عرض كخط متقطع) و 100 bootstraps تستخدم لإظهار الثقة في المتفرعة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 18" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2.jpg"> الشكل 18: أظهر الإنسان الذي تم إنشاؤه عن طريق اختيار سلالات عصية sp. من مخطط الأسنان البروتيني إنتاجًا تفاضليًا من الأيضالمتخصص. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 19" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2.jpg"> الشكل 19: أظهر الإنسان الذي تم إنشاؤه عن طريق اختيار سلالات Micromonospora sp. الست من مخطط الأسنان البروتيني إنتاجًا تفاضليًا من الأيض المتخصص. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 20" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2.jpg"> الشكل 20: MAN of Bacillus sp. and Micromonospora sp. s. السلالات التي تظهر إنتاج تفاضلي من الأيض المتخصصة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data at JoVE.com

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

IDBac هو خط أنابيب المعلوماتية الحيوية القائمة على الطيف الكتلي المفتوح المصدر الذي يدمج البيانات من كل من البروتين السليم وأطياف المستقلب المتخصصة، التي تم جمعها على مواد الخلايا كشط من المستعمرات البكتيرية. يسمح خط الأنابيب للباحثين بتنظيم المئات إلى الآلاف من المستعمرات البكتيرية بسرعة في مجموعات تصنيفية مفترضة، وتمييزها بشكل أكبر على أساس إنتاج المستقلب المتخصص.

استخدام خط أنابيب MALDI TOF-MS IDBac المفتوح المصدر لتحليل البروتين الميكروبي وبيانات المستقلب المتخصصة

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

IDBac الأزواج كتلة بيانات المواصفات من البروتين والمناطق المستقلب المتخصصة من عزل البكتيريا غير معروف للتمييز بسرعة بين العزل على أساس كل من هويتهم ووظيفتهم البيئية المحتملة. برنامج مصدر مكتبنا يوسع فائدة القائمة MALDI TOF استراتيجيات تحديد الميكروبات القائمة. ويشمل هذا التمديد تحليل الأيض المتخصصة كوسيلة إضافية للتمييز بين المستعمرات ذات الأنماط الظاهرية المماثلة.وهناك تحد كبير في تميز الكائنات الدقيقة غير معروف هو التمييز بين عزل وثيق الصلة. IDBac يوفر للباحثين وسيلة سهلة وسريعة لتوصيف العزلات من خلال البروتين والجزيئات الصغيرة التنميط. IDBac يوفر مقارنة بصرية من إنتاج المستقلب المتخصصة داخل عينة بكتيرية ويمكن أن توفر نظرة ثاقبة في مجموعة واسعة من المواضيع البحثية من الدراسات البيئية لاكتشاف الرصاص المخدرات.هناك العديد من الطرق التي يمكن حفظ بيانات MALDI بين الأجهزة وفيما بينها. إذا واجهتك مشكلة في الحصول على ملفات للعمل مع IDBac، أرسل مشكلة إلى GitHub من IDBac. باستخدام مسواك معقمة، نقل جزء صغير من مستعمرة بكتيرية إلى المكان المناسب على لوحة MALDI نظيفة.انتشار مستعمرة البكتيريا بالتساوي على الفور حتى البقعة يبدو مسطحا قدر الإمكان. تراكب واحد ميكرولتر من 70٪ من حمض التحسس الطيفي الشامل على العينة و البقع التحكم مصفوفة والسماح للحامض للهواء الجافة في غطاء الدخان الكيميائية. بعد ذلك، إضافة ميكرولتر واحد من حل مصفوفة MALDI أعدت سابقا لعينة ومصفوفة وسائل الإعلام البقع التحكم والسماح للهواء الجاف تماما.بعد إعداد مطياف كتلة MALDI TOF ، احصل على الطيف. حفظ أطياف البروتين في مجلد واحد وأطياف المستقلبات المتخصصة في مجلد منفصل الثاني. لبدء هذا الإجراء، قم بتنزيل برنامج IDBac.انقر نقراً مزدوجاً فوق install_idbac التي تم تنزيلها لبدء برنامج التثبيت. انقر بعد ذلك على اختصار IDBac لسطح المكتب لإطلاق IDBac الذي سيفتح في علامة التبويب مقدمة بشكل افتراضي. انقر على علامة التبويب "البدء بالبيانات الخام" واختر من قائمة إنشاء تجربة IDBac نوع البيانات التي سيتم استخدامها مع IDBac.عند إعداد تحويل ومعالجة ملفات البيانات، أدخل اسمًا وصفيًا للتجربة حيث تمت المطالبة به وانقر على مجلد البيانات الأولية وحدد المجلد المناسب. ثم انقر على بيانات العملية. بعد تحويل الملفات ومعالجتها باستخدام IDBac، انتقل إلى صفحة العمل مع التجارب السابقة وحدد تجربة للعمل معها.إضافة معلومات حول العينات باستخدام القائمة انقر هنا لتعديل التجربة المحددة. إدخال المعلومات في جدول البيانات المُزخرَب تلقائيًا ثم اضغط على حفظ. عندما تكون جاهزة لبدء التحليل، تأكد من تحديد التجربة التي سيتم العمل عليها.ثم حدد تحليل بيانات البروتين. في صفحة تحليل بيانات البروتين، اختر إعدادات الذروة وتقييم أطياف البروتين للعينات عبر قطع الأرض المرآتية المعروضة. ضبط النسبة المئوية للنسخ المتماثلة التي يجب أن تكون الذروة موجودة فيها حتى يتم تضمينها للتحليل.باستخدام قطع الأرض المرآة والتوجيه البصرية، وضبط إشارة لقطع الضوضاء التي تحتفظ القمم الأكثر حقيقية وأقل الضوضاء مشيرا إلى أن أكثر يكرر في ارتفاع قيمة وجود الذروة النسبة المئوية سوف تسمح باختيار إشارة أقل لقطع الضوضاء. بعد ذلك، حدد الكتلة السفلية والعليا لشحن القطعات التي تملي نطاق القيم الكتلية داخل كل طيف لاستخدامها في مزيد من التحليل من قبل IDBac. ضمن صفحة تحليل بيانات البروتين، حدد علامة التبويب Dendrogram للسماح بتجميع العينات في مخطط دندروغرامي وفقًا لمقاييس المسافة المختارة للمستخدم وخوارزميات التجميع.انقر فوق عينات تحديد في القائمة واتبع الإرشادات لتحديد العينات لتضمينها في التحليل. سيتم عرض العينات التي تحتوي على أطياف البروتين فقط داخل مربع العينات المتاحة. استخدم القيم الافتراضية لـ خوارزميات المسافة و التكتل وحدد الشدات كمدخل.لعرض قيم التمهيد على المخطط المُتدن، أدخل رقماً بين اثنين و1000 تحت bootstraps. لبدء تخصيص dendrogram، افتح القائمة ضبط dendrogram. لتلوين خطوط dendrogram، حدد انقر فوق لتعديل الخطوط وحدد الخيارات المطلوبة.لرسم معلومات من جدول البيانات الموجود بجوار الـ dendrogram، حدد الزر تضمين معلومات حول العينات. سيؤدي ذلك إلى فتح لوحة حيث سيتم ملء فئة ذاتياً استناداً إلى القيم التي تم إدخالها. لإدراج عينات من تجربة أخرى، حدد زر القائمة إدراج عينات من تجربة أخرى واتبع التوجيهات في اللوحة التي تم فتحها حديثًا.انتقل إلى صفحة تحليل بيانات الجزيئات الصغيرة لتمكين مرئيات البيانات من خلال تحليل المكونات المبدئية وشبكات الارتباط الأيضي التي تستخدم الشبكات الثنائية لعرض ارتباط كتلة الجزيئات الصغيرة لشحن القيم مع العينات. انقر واسحب على dendrogram لتسليط الضوء على عينات مختارة من الفائدة التي سيتم تحليلها. إذا لم يتم تسليط الضوء على أي عينات أو لم يتم إنشاء تشعب البروتين، شبكة رابطة المستقلب إما مجموعة فرعية عشوائية أو جميع العينات سوف تظهر على التوالي.لطرح مصفوفة وسائط فارغة في شبكة اقتران المستقلب، فتح القائمة حدد عينة لطرح واختيار العينة المناسبة لاستخدامها كفراغ. فتح القائمة إظهار / إخفاء إعدادات MAN لتحديد القيم المطلوبة لنسبة مئوية من وجود الذروة وتكرار، إشارة إلى الضوضاء وقطع الكتلة العليا والسفلى. استخدام جزيء صغير مرآة المؤامرات لتوجيه اختيار هذه الإعدادات.للحصول على نتائج التقارير، انسخ النص ضمن الاقتراحات للإبلاغ عن فقرة تحليل MAN لتوفير الإعدادات المعرفة من قبل المستخدم المستخدمة لإنشاء شبكة اقتران التمثيل الغذائي المنشأة. تم تحليل ست سلالات من تشوكوريينسيس Micromonospora واثنين من بقع من عصية subtilis باستخدام البيانات في برنامج IDBac. اتباع الاتجاهات في بداية مع علامة التبويب البيانات الخام، تم اختيار الخيار انقر هنا لتحويل ملفات بروكر وIDBac تم اتباع التعليمات المقدمة لكل مجموعة بيانات.إلى التحويل الآلي والخطوات الذروة قبل المعالجة ، تم إنشاء تجربة IDBac مجتمعة عن طريق نقل عينات عصية وMicromonospora من التجربةتين إلى تجربة واحدة. وشمل التحليل الناتج مقارنة أطياف البروتين باستخدام قطع الأرض المرآة التي كانت مفيدة لتقييم جودة الأطياف وضبط إعدادات الذروة. تظهر هنا لقطة شاشة لنتائج تجميع البروتين مع الإعدادات الافتراضية المحددة.تم تلوين dendrogram عن طريق ضبط العتبة على المؤامرة. من الجدير بالذكر هو الفصل الواضح بين جينيرا مع كل من M.chokoriensis وB.subtilis يعزل التجمع بشكل منفصل. بالنقر والسحب عبر تشعب البروتين ، كان من الممكن إنشاء شبكات جمعية التمثيل الغذائي بسرعة لمقارنة سلالات B.subtilis فقط ، فقط سلالات M.chokoriensis ، وجميع السلالات في وقت واحد.وتتمثل الوظيفة الأساسية لهذه الشبكات في تزويد الباحثين بنظرة عامة واسعة عن درجة التداخل بين البكتيريا من المستقلبات المتخصصة. عند العمل مع البيانات الجديدة، استخدم مخططات مرآة IDBac لضمان أن بياناتك منطقية والأطياف ذات جودة عالية. تقييم نقدي للتصميم التجريبي الخاص بك والنتائج في كل خطوة.IDBac يسمح للباحثين لبناء مكتبات صغيرة ومتنوعة من الكائنات الحية الدقيقة لمزيد من التحقيق. وهذا يقلل كثيرا من التكاليف المرتبطة بالمكتبات الميكروبية الكبيرة والمكررة تقليديا. لأن IDBac يسمح لك تصور تداخل المستقلبات المتخصصة داخل مجموعات متشابهة للغاية في الإيميلوجينيك، ويمكن استخدامه لتوليد أسئلة البحث والفرضيات التي تربط حقلين عادة قطع.حمض فورميك هو الكاوية وينبغي التعامل معها في غطاء الدخان الكيميائية. وقد تشكل بعض العزلات البيئية مخاطر صحية محتملة، وينبغي معاملة جميع السلالات على أنها مستوى السلامة الأحيائية الثاني.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

طريقة لتحديد الصغيرة جزيء مثبطات التفاعل البروتين البروتين بين HCN1 وTRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

تقييم جدوى اتحاد البكتيرية الاصطناعية على واجهة المضيف-ميكروب القناة الهضمية في المختبر

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 في 1: انجذاب تطهير لتحليل مواز للبروتين-بروتين والبروتين-المستقلب المجمعات من خطوة واحدة

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

تصحيح التجارب المطبعية ومقايسة إصلاح الحمض النووي باستخدام ملحق النوكليوتيدات واحدة واستخدام TOF تحليل الطيف الكتلي

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

خالية من المعايرة في المختبر الكمي للبروتين هومو-أوليجوميريزيشن باستخدام الأجهزة التجارية والحرة والمفتوحة المصدر برمجيات التحليل السطوع

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

خط أنابيب إعداد عينة للبلورات الدقيقة في خط شعاع VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

إجراء قياسات دقيقة ودقيقة أحادية الجزيء FRET باستخدام smfBox مفتوح المصدر

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

معالجة عينات البروتينات البندقية آلية بواسطة روبوت مختبر مفتوح المصدر

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

جمع بيانات Cryo-EM أحادية الجسيمات مع إمالة المرحلة باستخدام Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...