Name: using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data
Uploaded: 2019-05-15T13:00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institute of General Medical Sciences Grant R01 GM125943, National Geographic Grant CP-044R-17; Den islandske forsknings Fondstilskud 152336-051; og University of Illinois i Chicago Startup fonde. Også, vi takker følgende bidragydere: Dr. Amanda Bulman for at hjælpe med MALDI-TOF MS protein erhvervelse parametre; Dr. Terry Moore og Dr. Atul Jain for recrystallizing Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic Acid matrix (CHCA).

<ol>
	<li>Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+TOF+MS+profiling+of+bacteria+at+the+strain+level:+A+review.">MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review.</a> Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).</li><li>Cain, T. C., Lubman, D. M., Weber, W. J., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+bacteria+using+protein+profiles+from+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Differentiation of bacteria using protein profiles from matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8 (12), 1026-1030 (1994).</li><li>Holland, R. D., Wilkes, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+intact+whole+bacteria+based+on+spectral+patterns+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+with+time-of-flight+mass+spectrometry.">Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 10 (10), 1227-1232 (1996).</li><li>Rahi, P., Prakash, O., Shouche, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass-spectrometry+(MALDI-TOF+MS)+based+microbial+identifications:+challenges+and+scopes+for+microbial+ecologists.">Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass-spectrometry (MALDI-TOF MS) based microbial identifications: challenges and scopes for microbial ecologists.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1359 (2016).</li><li>Silva, R., Lopes, N. P., Silva, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+MALDI+mass+spectrometry+in+natural+products+analysis.">Application of MALDI mass spectrometry in natural products analysis.</a> Planta Medica. 82, 671-689 (2016).</li><li>Clark, C. M., Costa, M. S., Sanchez, L. M., Murphy, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+MALDI-TOF+mass+spectrometry+protein+and+specialized+metabolite+analyses+to+rapidly+discriminate+bacterial+function.">Coupling MALDI-TOF mass spectrometry protein and specialized metabolite analyses to rapidly discriminate bacterial function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4981-4986 (2018).</li><li>Freiwald, A., Sauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+classification+and+identification+of+bacteria+by+mass+spectrometry.">Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 4 (5), 732-742 (2009).</li><li>Schulthess, B., Bloemberg, G. V., Zbinden, R., B&#246;ttger, E. C., Hombach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Bruker+MALDI+Biotyper+for+identification+of+Gram-positive+rods:+development+of+a+diagnostic+algorithm+for+the+clinical+laboratory.">Evaluation of the Bruker MALDI Biotyper for identification of Gram-positive rods: development of a diagnostic algorithm for the clinical laboratory.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1089-1097 (2014).</li><li>Schumann, P., Maier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+mass+spectrometry+applied+to+classification+and+identification+of+bacteria.">MALDI-TOF mass spectrometry applied to classification and identification of bacteria.</a> Methods in Microbiology. 41, 275-306 (2014).</li><li>Chambers, M. C., Maclean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics.">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534 (2008).</li><li>Martens, L., Chambers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mzML-a+community+standard+for+mass+spectrometry+data.">mzML-a community standard for mass spectrometry data.</a> Molecular &#38; Cellular Proteomics. 10 (1), (2011).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

IDBac-protokollen beskriver bakterielle proteiner og specialiserede metabolit data erhvervelse og analyse af op til 384 bakterielle isolater i 4 timer af en enkelt forsker. Med IDBac er der ingen grund til at udtrække DNA fra bakterielle isolater eller generere specialiserede metabolit ekstrakter fra flydende fermenterings bouillon og analysere dem ved hjælp af kromatografiske metoder. I stedet indsamles proteiner og specialiserede metabolit data ved blot at sprede materiale fra bakterielle kolonier direkte på en MALDI-målplade. Dette reducerer i høj grad tid og omkostninger forbundet med alternative teknikker såsom 16S rRNA-gensekvensering og LCMS9.
Det er vigtigt at tilføje en matrix blank og kalibrerings pletter til MALDI pladen, og vi anbefaler at bruge et passende antal replikater for at sikre reproducerbarhed og statistisk tillid. Antallet af replikater vil være eksperiment afhængig. For eksempel, hvis en bruger har til hensigt at skelne tusinder af kolonier fra en samling af miljømæssige diversitet plader, kan færre replikater være nødvendige (vores laboratorium indsamler tre tekniske replikater pr koloni). Alternativt, hvis en bruger ønsker at oprette en brugerdefineret database af stammer fra specifikke bakterielle taxa til hurtigt at bestemme sub-arter klassifikationer af ukendte isolater, så flere replikater er passende (vores laboratorium indsamler otte biologiske replikater per stamme).
IDBac er et værktøj til hurtigt at differentiere meget-relaterede bakterielle isolater baseret på formodede taksonomiske oplysninger og specialiseret metabolit produktion. Det kan supplere eller tjene som en forløber for ortogonale metoder såsom dybtgående genetiske analyser, undersøgelser, der involverer metabolit produktion og funktion, eller karakterisering af specialiserede metabolit struktur ved nuklear magnetisk resonansspektroskopi og/eller LC-MS/MS.
Specialiseret metabolit produktion (IDBac MANs) er meget modtagelig for bakterielle vækstbetingelser, især ved hjælp af forskellige medier, som er en potentiel begrænsning af metoden. Men disse træk kan udnyttes af brugeren, som IDBac kan let generere MANs viser forskellene i specialiserede metabolit produktion under en række vækstbetingelser. Det er vigtigt at bemærke, at mens specialiserede metabolit fingeraftryk kan variere efter vækst tilstand, har vi tidligere vist, at protein fingeraftryk forbliver relativt stabile på tværs af disse variabler (Se Clark et al.6). Når vi beskæftiger os med miljø mangfoldigheds plader, anbefaler vi at rense bakterie isolater før analyse for at reducere mulige bidrag fra nærliggende bakteriel Cross-Talk.
Endelig, manglen på en søgbar offentlig database af protein MS fingeraftryk er en stor mangel i brugen af denne metode til at klassificere ukendte miljømæssige bakterier. Vi skabte idbac med dette i tankerne, og omfattede automatiseret konvertering af data til et Fællesskabs godkendt open source-format (mzml)10,11,12 og designede softwaren til at tillade søgning, deling og oprettelse af brugerdefinerede databaser. Vi er i færd med at skabe en stor offentlig database (> 10000 fuldt karakteriserede stammer), som vil gøre det muligt at klassificere nogle isolater til artsniveau, herunder links til Genbanks tiltrædelses numre, når de foreligger.
IDBac er open source og koden er tilgængelig for alle til at tilpasse deres dataanalyse og visualisering behov. Vi anbefaler, at brugerne konsulterer en omfattende litteratur (Sauer et al.7, Silva et al.5) for at hjælpe med at støtte og designe deres eksperimentelle mål. Vi er vært for et diskussionsforum på: https://groups.Google.com/Forum/#!forum/idbac og et middel til at rapportere problemer med softwaren på: https://github.com/chasemc/IDBacApp/Issues.

En stor barriere for forskere, der studerer bakteriel funktion er evnen til hurtigt og samtidig vurdere den taksonomiske identitet af en mikroorganisme og dens evne til at producere specialiserede metabolitter. Dette har forhindret betydelige fremskridt i forståelsen af forholdet mellem bakteriel fylogeny og specialiseret metabolit produktion i de fleste af bakterier isoleret fra miljøet. Selv om MS-baserede metoder, der bruger protein fingeraftryk til at gruppere og identificere bakterier er godt beskrevet1,2,3,4, disse undersøgelser er generelt blevet udført på små grupper af isolater, på en artsspecifik måde. Det er vigtigt, at oplysningerne om den specialiserede metabolit produktion, som er en vigtig drivkraft for mikrobiel funktion i miljøet, ikke er indarbejdet i disse undersøgelser. Silva et al.5 har for nylig givet en omfattende historie, der beskriver underudnyttelsen af MALDI-TOF MS til at analysere specialiserede metabolitter og manglen på software til at lindre aktuelle Bioinformatik flaskehalse. For at afhjælpe disse mangler, skabte vi IDBac, en Bioinformatik rørledning, der integrerer både lineære og reflectron tilstande af MALDI-TOF MS6. Dette giver brugerne mulighed for hurtigt at visualisere og differentiere bakterielle isolater baseret på både protein og specialiserede metabolit MS fingeraftryk, hhv.
IDBac er omkostningseffektiv, høj gennemløb, og designet til lægbrugeren. Den er frit tilgængelig (chasemc.github.io/IDBac) og kræver kun adgang til et MALDI-TOF-massespektrometer (reflekectron-tilstand kræves til analyse af specialiserede metabolit). Prøveforberedelse er baseret på den enkle metode med "udvidet direkte overførsel"7,8 , og der indsamles data med fortløbende lineære og reflectron-opkøb på et enkelt MALDI-målpunkt. Med IDBac er det muligt at analysere den formodede fylogeny og specialiserede metabolit produktion af hundredvis af kolonier på under fire timer, herunder prøveforberedelse, dataindsamling, og datavisualisering. Dette giver en betydelig tids-og omkostningsfordel i forhold til traditionelle metoder til at identificere bakterier (såsom gensekvensering) og analyse af metabolisk udgang (væskekromatografi-massespektrometri [LCMS] og lignende kromatografiske metoder).
Ved hjælp af data, som er indhentet i lineær tilstandsanalyse, anvender IDBac hierarkisk klyngedannelse til at repræsentere protein Spectra-relatens. Da spektrene for det meste repræsenterer ioniserede ribosomale proteiner, giver de en repræsentation af den fylogenetiske mangfoldighed, der findes i en prøve. Desuden inkorporerer IDBac reflekectron-tilstandsdata for at vise specialiserede metabolits fingeraftryk som metabolit Associations Networks (MANs). MANs er tosidede netværk, der giver mulighed for nem visualisering af delt og unik metabolit produktion mellem bakterielle isolater. Den IDBac platform giver forskerne mulighed for at analysere både protein og specialiserede metabolit data i tandem, men også individuelt, hvis der kun én data-type er erhvervet. Vigtigere, IDBac processer rå data fra Bruker og Xiamen instrumenter, samt txt, tab, CSV, mzXML, og mzML. Dette eliminerer behovet for manuel konvertering og formatering af datasæt og reducerer i væsentlig grad risikoen for bruger fejl eller forkert håndtering af MS-data.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>60-002-65</td>
			<td>LC-MS Ultra CHROMASOLV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex Speed LEF MALDI-TOF instrument</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics Bacterial test standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0884024</td>
			<td>Bruker Daltonics 8604530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Peptide Calibration standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9846988</td>
			<td>Bruker Daltonics 8206195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>99.5+%, Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target Plate</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-500</td>
			<td>Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any is ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC293810010</td>
			<td>99.5%, for biochemistry, ACROS Organics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>28166-41-8</td>
			<td>(C2020-25G) &#8805;98% (TLC), powder</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data

For at visualisere forholdet mellem bakterielle fylogeny og specialiserede metabolit produktion af bakterielle kolonier vokser på næringsstof agar, vi udviklet IDBac — en lavpris og høj gennemløb matrix-assisteret Laser Desorption/ionisering Time-of-Flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) Bioinformatik pipeline. IDBac software er designet til ikke-eksperter, er frit tilgængelige, og i stand til at analysere et par til tusindvis af bakterielle kolonier. Her præsenterer vi procedurer for fremstilling af bakterielle kolonier for MALDI-TOF MS analyse, MS instrument operation, og databehandling og visualisering i IDBac. Vi instruerer især brugerne i at klynge bakterier ind i dendrogrammer baseret på protein MS fingeraftryk og interaktivt oprette metabolit Associations netværk (MANs) fra specialiserede metabolit data.

Vi analyserede seks stammer af Micromonospora chokoriensis og to stammer af Bacillus subtilis, som tidligere var karakteriseret6, ved hjælp af data til rådighed på Doi: 10.5281/zenodo. 2574096. Følgende anvisninger i Start med RAW data fanen, vi valgte indstillingen Klik her for at konvertere Bruker filer og fulgte idbac-leverede instruktioner for hvert datasæt (Figur 14).
Efter den automatiserede konvertering og forbehandling/peak-Peaking trin blev afsluttet, vi fortsatte med at skabe et nyt kombineret IDBac eksperiment ved at overføre prøver fra de to eksperimenter i et enkelt eksperiment, der indeholder både Bacillus og Prøver af micromonosopora (Figur 15). Den resulterende analyse indebar sammenligning af protein spektre ved hjælp af spejl parceller, som billedet i Figur 16, som var nyttigt til at evaluere spektrkvalitet og justere peak-picking indstillinger. Figur 17 viser et skærmbillede af resultaterne af protein klyngedannelse med valgte standardindstillinger. Dendrogram var farvet ved at justere tærsklen på plottet (vises som en punkteret linje). Af note er den klare adskillelse mellem SLOM, med både M. chokoriensis og B. subtilis isolerer klyngedannelse separat.
Figur 18, figur 19, og figur 20 fremhæve evnen til at generere Mans af bruger-udvalgte regioner ved at klikke og trække på tværs af protein dendrogram. Med dette var vi i stand til hurtigt at oprette MANs til kun at sammenligne B. subtilis stammer (figur 18), kun M. chokoriensis stammer (figur 19), og alle de stammer samtidigt (figur 20). Disse nets primære funktion er at give forskerne et bredt overblik over graden af specialiseret metabolits overlap mellem bakterier. Med disse data i hånden, har forskerne nu kapacitet til at træffe informerede beslutninger fra kun en lille mængde materiale skrabet fra en bakteriel koloni.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2.jpg"> Figur 14: Spectra Processing. Downloadede Bruker autoFlex Spectra blev konverteret og behandlet ved hjælp af IDBac. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2.jpg"> Figur 15: kombineret IDBac-eksperiment. Da Micromonospora og Bacillus Spectra blev indsamlet på forskellige MALDI-målplader, blev de to eksperimenter efterfølgende kombineret i et enkelt eksperiment-"Bacillus_Micromonsopora". Dette blev gjort inden for "arbejde med tidligere eksperimenter" fanen, efterretninger i menuen "Overfør prøver fra tidligere eksperimenter til nye/andre eksperimenter". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 16" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2.jpg"> Figur 16: sammenligning. Micromonspora og Bacillus Spectra blev sammenlignet ved hjælp af spejlet parceller inden for "protein data analysis" side. I sidste ende, standard peak indstillinger blev valgt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 17" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2.jpg"> Figur 17: hierarkisk klyngedannelse. Hierarkisk klyngedannelse, ved hjælp af standardindstillinger, korrekt grupperet Bacillus og Micromonospora isolater. Dendrogram var farvet af "skæring" dendrogram i en vilkårlig højde (vises som en stiplet-linje) og 100 på bruges til at vise tillid i forgreningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 18" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2.jpg"> Figur 18: mand skabt ved at vælge Bacillus Sp. stammer fra protein dendrogram viste differentiel produktion af specialiserede metabolitter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 19" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2.jpg"> Figur 19: mand skabt ved at vælge de seks Micromonospora Sp. stammer fra protein dendrogram viste differentiel produktion af specialiserede metabolitter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 20" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2.jpg"> Figur 20: mand af Bacillus Sp. og Micromonospora Sp. stammer, der viser en differentieret produktion af specialiserede metabolitter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data at JoVE.com

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

IDBac er en open-source massespektrometrisk-baseret Bioinformatik pipeline, der integrerer data fra både intakt protein og specialiseret metabolit Spectra, indsamlet på cellemateriale skrabet fra bakterielle kolonier. Rørledningen giver forskerne mulighed for hurtigt at organisere hundreder til tusinder af bakterielle kolonier i formodede taksonomiske grupper, og yderligere differentiere dem baseret på specialiserede metabolit produktion.

Brug af open source-MALDI TOF-MS IDBac-rørledningen til analyse af mikrobiel protein og specialiserede metabolit data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

IDBac par masse spec data fra protein og specialiserede metabolit regioner af ukendte bakterielle isolater til hurtigt at diskriminere mellem isolater baseret på både deres identitet og deres potentielle miljømæssige funktion. Vores kontor kilde software udvider nytten af eksisterende MALDI TOF baseret mikrobielle identifikation strategier. Denne udvidelse omfatter analyse af specialiseret stofskifte som en yderligere måde at skelne mellem kolonier med lignende fænotyper.En stor udfordring i at karakterisere ukendte mikroorganismer er at skelne nært beslægtede isolater. IDBac giver forskerne en nem og hurtig måde at karakterisere isolater gennem protein og små molekyle profilering. IDBac giver en visuel sammenligning af specialiseret metabolit produktion inden for en bakteriel prøve og kan give indsigt i en bred vifte af forskningsemner fra økologiske undersøgelser til narkotika bly opdagelse.Der er mange måder, hvorpå MALDI-data kan gemmes mellem og mellem instrumenter. Hvis du har problemer med at få filer til at fungere med IDBac, skal du sende et problem til IDBac's GitHub. Ved hjælp af en steril tandstikker, overføre en lille del af en bakteriekoloni til det relevante sted på en ren MALDI plade.Spred bakteriekolonien jævnt over stedet, så stedet fremstår så fladt som muligt. Overlejrer en mikroliter af 70% massespektrometrikvalitet myresyre på prøven og matrix kontrol pletter og lad syren til lufttørre i en kemisk røg hætte. Dernæst tilsættes en mikroliter af tidligere tilberedt MALDI matrixløsning til prøve- og matrixmediekontrolpunkterne og lad det lufttørre helt.Efter opsætning af MALDI TOF massespektrometeret, erhverve spektre. Gem proteinspektre i en mappe og den specialiserede metabolitspektre i en anden separat mappe. Hvis du vil starte denne procedure, skal du hente IDBac-softwaren.Dobbeltklik på den hentede install_idbac for at starte installationsprogrammet. Dobbeltklik derefter på iDBac-skrivebordsgenvejen for at starte IDBac, som som standard åbnes under introduktionsfanen. Klik på fanen Start med rå data, og vælg fra menuen Opret et IDBac-eksperiment den type data, der skal bruges sammen med IDBac.Når du konfigurerer konvertering og behandling af datafiler, skal du indtaste et beskrivende navn til eksperimentet, hvor du bliver bedt om det, og klikke på rådatamappen og vælge den relevante mappe. Klik derefter på Procesdata. Når du har konverteret filerne og behandlet dem med IDBac, skal du navigere til siden arbejde med tidligere eksperimenter og vælge et eksperiment, du vil arbejde med.Tilføj oplysninger om eksempler ved hjælp af menuen klik her for at ændre det valgte eksperiment. Indtast oplysninger i det autobefolkede regneark, og tryk på Gem. Når du er klar til at starte analysen, skal du sikre dig, at det eksperiment, du skal arbejde med, er valgt.Vælg derefter proteindataanalyse. På proteindataanalysesiden skal du vælge de toppede indstillinger og evaluere proteinspektre af prøver via de viste spejlområder. Juster den procentdel af replikater, hvori der skal være en top, for at den kan medtages til analyse.Brug spejlet plots som visuel vejledning, justere signalet til støj cutoff, der bevarer de mest ægte toppe og mindst støj at mærke, at flere replikater i en højere procentdel peak tilstedeværelse værdi vil give mulighed for valg af et lavere signal til støj cutoff. Derefter angives den nedre og øvre masse for at oplade afskæringer, der dikterer masseværdierne inden for hvert spektrum, der skal anvendes i yderligere analyse af IDBac. På siden med analyse af proteindata skal du vælge fanen Dendrogram for at give mulighed for at gruppere prøver i et dendrogram i henhold til bruger valgte afstandsforanstaltninger og klyngealgoritmer.Klik på udvalgte eksempler i menuen, og følg vejledningen for at vælge eksempler, der skal medtages i analysen. Kun prøver, der indeholder proteinspektre, vil blive vist i den tilgængelige prøveboks. Brug standardværdierne for fjern- og klyngealgoritmer, og vælg intensiteter som input.Hvis du vil have vist bootstrap-værdierne på dendrogram, skal du indtaste et tal mellem to og 1.000 under bootstraps. For at begynde at tilpasse dendrogram, skal du åbne justere dendrogram menuen. Hvis du vil farvelægge dendrograms linjer, skal du markere Klik for at ændre linjer og vælge de ønskede indstillinger.Hvis du vil afbilde oplysninger fra regnearket ved siden af dendrogram, skal du vælge knappen indarbejde info om prøver. Dette åbner et panel, hvor en kategori udfyldes selv baseret på de angivne værdier. Hvis du vil indsætte eksempler fra et andet eksperiment, skal du vælge menuknappen indsætte prøver fra et andet eksperiment og følge anvisningerne i det nyåbnede panel.Fortsæt til den lille molekyle dataanalyse side for at muliggøre data visualisering af princippet komponenter analyse og metaboliske forening netværk, der bruger topartsnetværk til at vise korrelationen af små molekyle masse til at oplade værdier med prøver. Klik og træk på dendrogram at fremhæve udvalgte prøver af interesse, der skal analyseres. Hvis der ikke fremhæves nogen prøver, eller der ikke er oprettet proteindedrogram, vises et metabolitforeningsnetværk af enten et tilfældigt undersæt eller alle prøver.Hvis du vil trække et blindt matrixmedie i metabolittilknytningsnetværket, skal du åbne menuen og vælge et eksempel for at trække og vælge det relevante eksempel, der skal bruges som en tom. Åbn menushow/skjul MAN-indstillingerne for at vælge de ønskede værdier for en procentdel af spidsbelastning og replikere, signal til støj og øvre og nedre masseafskæringer. Brug de små molekyle spejl plots til at guide udvælgelsen af disse indstillinger.For rapportering af resultater skal du kopiere teksten i afsnittet med forslag til rapportering af MAN-analyse for at angive de brugerdefinerede indstillinger, der bruges til at generere oprettet metabolisk tilknytningsnetværk. Seks stammer af Micromonospora chokoriensis og to pletter af Bacillus subtilis blev analyseret ved hjælp af data i IDBac software. Følgende anvisninger i starten med rå data fanen, mulighed klik her for at konvertere Bruker filer blev valgt, og IDBac forudsat instruktioner blev fulgt for hvert datasæt.Til den automatiserede konvertering og pre-processing peak peaking trin, en kombineret IDBac eksperiment blev skabt ved at overføre Bacillus og Micromonospora prøver fra de to eksperimenter i et enkelt eksperiment. Den resulterende analyse omfattede sammenligning af proteinspektre ved hjælp af spejlområder, som var nyttige til vurdering af spektrekvalitet og justering af spidsbelastningsindstillinger. Et skærmbillede af resultaterne af proteinklynger med valgte standardindstillinger vises her.Dendrogram var farvet ved at justere tærsklen på plottet. Det skal bemærkes, at den klare adskillelse mellem slægter med både M.chokoriensis og B.subtilis isolerer klyngedannelse separat. Ved at klikke og trække hen over protein dendrogram, var det muligt hurtigt at skabe metaboliske forening netværk til at sammenligne kun B.subtilis stammer, kun M.chokoriensis stammer, og alle stammerne samtidigt.Den primære funktion af disse netværk er at give forskerne et bredt overblik over graden af specialiserede metabolit overlapning mellem bakterier. Når du arbejder med nye data, skal du bruge IDBac's spejl plots for at sikre, at dine data giver mening og spektre er af høj kvalitet. Kritisk evaluere dit eksperimentelle design og resultater på hvert trin.IDBac giver forskerne mulighed for at bygge små og forskelligartede biblioteker af mikroorganismer til yderligere undersøgelse. Dette reducerer i høj grad omkostningerne forbundet med traditionelt store og overflødige mikrobielle biblioteker. Da IDBac giver dig mulighed for at visualisere specialiseret metabolitoverlap inden for meget lignende fylogenetiske grupper, kan det bruges til at generere forskningsspørgsmål og hypoteser, der forbinder to typisk afbrudte felter.Myresyre er ætsende og bør håndteres i en kemisk røghætte. Nogle miljøisoler kan udgøre potentielle sundhedsfarer, og alle stammer bør behandles som biosikkerhedsniveau to.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Fremgangsmåde til at identificere småmolekylære inhibitorer af protein-protein-vekselvirkning mellem HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Vurdering af levedygtigheden af en syntetisk bakteriel konsortium på In Vitro Gut Host-mikrobe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: et-trins affinitet rensning for den parallelle analyse af Protein-Protein og Protein-metabolit komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlæsning og DNA reparation analyse ved hjælp af Single Nucleotide udvidelse og MALDI-TOF-massespektrometri analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantificering af Protein Homo-oligomerisering ved hjælp af kommercielle instrumentering og gratis, Open Source lysstyrke analyse Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En prøveforberedelsespipeline til mikrokrystaller på VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Præcis og præcis enkeltmolekyle FRET-målinger ved hjælp af Open Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Shotgun Proteomics prøvebehandling automatiseret af en open source lab robot

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Enkeltpartikel-kryo-EM-dataindsamling med scenehældning ved hjælp af Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...