Name: using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data
Uploaded: 2019-05-15T13:00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door het National Institute of General Medical Sciences Grant R01 GM125943, National Geographic Grant CP-044R-17; IJslandse onderzoeksfonds subsidie 152336-051; en University of Illinois bij Chicago Startup funds. Ook bedanken we de volgende bijdragers: Dr. Amanda Bulman voor hulp bij MALDI-TOF MS eiwit acquisitie parameters; Dr. Terry Moore en Dr. Atul Jain voor herkristalliszing alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid matrix (CHCA).

<ol>
	<li>Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+TOF+MS+profiling+of+bacteria+at+the+strain+level:+A+review.">MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review.</a> Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).</li><li>Cain, T. C., Lubman, D. M., Weber, W. J., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+bacteria+using+protein+profiles+from+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Differentiation of bacteria using protein profiles from matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8 (12), 1026-1030 (1994).</li><li>Holland, R. D., Wilkes, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+intact+whole+bacteria+based+on+spectral+patterns+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+with+time-of-flight+mass+spectrometry.">Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 10 (10), 1227-1232 (1996).</li><li>Rahi, P., Prakash, O., Shouche, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass-spectrometry+(MALDI-TOF+MS)+based+microbial+identifications:+challenges+and+scopes+for+microbial+ecologists.">Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass-spectrometry (MALDI-TOF MS) based microbial identifications: challenges and scopes for microbial ecologists.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1359 (2016).</li><li>Silva, R., Lopes, N. P., Silva, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+MALDI+mass+spectrometry+in+natural+products+analysis.">Application of MALDI mass spectrometry in natural products analysis.</a> Planta Medica. 82, 671-689 (2016).</li><li>Clark, C. M., Costa, M. S., Sanchez, L. M., Murphy, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+MALDI-TOF+mass+spectrometry+protein+and+specialized+metabolite+analyses+to+rapidly+discriminate+bacterial+function.">Coupling MALDI-TOF mass spectrometry protein and specialized metabolite analyses to rapidly discriminate bacterial function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4981-4986 (2018).</li><li>Freiwald, A., Sauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+classification+and+identification+of+bacteria+by+mass+spectrometry.">Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 4 (5), 732-742 (2009).</li><li>Schulthess, B., Bloemberg, G. V., Zbinden, R., B&#246;ttger, E. C., Hombach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Bruker+MALDI+Biotyper+for+identification+of+Gram-positive+rods:+development+of+a+diagnostic+algorithm+for+the+clinical+laboratory.">Evaluation of the Bruker MALDI Biotyper for identification of Gram-positive rods: development of a diagnostic algorithm for the clinical laboratory.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1089-1097 (2014).</li><li>Schumann, P., Maier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+mass+spectrometry+applied+to+classification+and+identification+of+bacteria.">MALDI-TOF mass spectrometry applied to classification and identification of bacteria.</a> Methods in Microbiology. 41, 275-306 (2014).</li><li>Chambers, M. C., Maclean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics.">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534 (2008).</li><li>Martens, L., Chambers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mzML-a+community+standard+for+mass+spectrometry+data.">mzML-a community standard for mass spectrometry data.</a> Molecular &#38; Cellular Proteomics. 10 (1), (2011).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De IDBac protocol Details bacteriële eiwitten en gespecialiseerde metaboliet data-acquisitie en analyse van maximaal 384 bacteriële isolaten in 4 h door een enkele onderzoeker. Met IDBac is het niet nodig om DNA uit bacteriële isolaten te halen of gespecialiseerde metaboliet extracten te genereren uit vloeibare fermentatie-Bouillon en ze te analyseren met behulp van chromatografische methoden. In plaats daarvan worden eiwit-en gespecialiseerde metaboliet gegevens verzameld door eenvoudigweg materiaal van bacteriële kolonies rechtstreeks op een doelplaat van MALDI te verspreiden. Dit vermindert aanzienlijk de tijd en kosten die gepaard gaan met alternatieve technieken zoals 16S rRNA gensequencing en LCMS9.
Het is belangrijk om een matrix leeg en kalibratie vlekken toevoegen aan de MALDI plaat, en we raden het gebruik van een passend aantal replicaten om te zorgen voor reproduceerbaarheid en statistisch vertrouwen. Het aantal replicaten is afhankelijk van het experiment. Als een gebruiker bijvoorbeeld duizenden kolonies wil onderscheiden van een verzameling milieudiversiteits platen, kunnen er minder replicaten nodig zijn (ons lab verzamelt drie technische replicaten per kolonie). Als alternatief, als een gebruiker wenst te maken van een aangepaste database van stammen van specifieke bacteriële taxa om snel te bepalen subspecies classificaties van onbekende isolaten, dan zijn meer replicaties geschikt (ons lab verzamelt acht biologische replicaten per stam).
IDBac is een hulpmiddel voor het snel differentiëren van hoog-gerelateerde bacteriële isolaten op basis van putatieve taxonomische informatie en gespecialiseerde metaboliet productie. Het kan een aanvulling zijn of dienen als een voorloper van orthogonale methoden zoals diepgaande genetische analyses, studies waarbij de productie en functie van de metaboliet betrokken is, of karakterisering van gespecialiseerde metaboliet structuur door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie en/of LC-MS/MS.
Gespecialiseerde metaboliet productie (IDBac MANs) is zeer gevoelig voor bacteriële groeiomstandigheden, vooral met behulp van verschillende media, dat is een mogelijke beperking van de methode. Echter deze eigenschappen kunnen worden uitgebuit door de gebruiker, als IDBac kan gemakkelijk genereren van MANs tonen de verschillen in gespecialiseerde metaboliet productie onder een verscheidenheid van groei voorwaarden. Het is belangrijk op te merken dat terwijl gespecialiseerde metaboliet vingerafdrukken kunnen variëren door groei conditie, we hebben eerder aangetoond dat eiwit vingerafdrukken relatief stabiel over deze variabelen blijven (Zie Clark et al.6). Bij het omgaan met milieudiversiteits platen raden we aan vóór de analyse bacteriële isolaten te zuiveren om mogelijke bijdragen van naburige bacteriële cross-talk te verminderen.
Ten slotte is het ontbreken van een doorzoekbare publieke database van eiwit-MS-vingerafdrukken een belangrijke tekortkoming in het gebruik van deze methode om onbekende milieu bacteriën te classificeren. We creëerden IDBAC met dit in gedachten, en opgenomen geautomatiseerde conversie van gegevens in een community-geaccepteerde open-source Format (mzml)10,11,12 en ontwierp de software om het zoeken, delen en creëren van aangepaste databases. We zijn in het proces van het creëren van een grote openbare database (> 10000 volledig gekarakteriseerde stammen), die de indeling van sommige isolaten naar het soort niveau mogelijk maakt, inclusief links naar de toetredings nummers van GenBank indien beschikbaar.
IDBac is open source en de code is beschikbaar voor iedereen om hun gegevensanalyse en visualisatie behoeften aan te passen. We raden gebruikers aan om een uitgebreide reeks literatuur (Sauer et al.7, Silva et al.5) te raadplegen om hun experimentele doelen te helpen ondersteunen en ontwerpen. We hosten een forum voor discussie op: https://groups.Google.com/forum/#!forum/idbac en een manier om problemen met de software te rapporteren op: https://github.com/chasemc/IDBacApp/issues.

Een belangrijke barrière voor onderzoekers die bacteriële functie bestuderen, is de mogelijkheid om de taxonomische identiteit van een micro-organisme snel en gelijktijdig te beoordelen en zijn capaciteit om gespecialiseerde metabolieten te produceren. Dit heeft aanzienlijke vooruitgang in het begrijpen van de relatie tussen bacteriële fylogenie en gespecialiseerde metaboliet productie in de meeste bacteriën geïsoleerd uit de omgeving voorkomen. Hoewel MS-gebaseerde methoden die eiwit-vingerafdrukken gebruiken om bacteriën te groeperen en te identificeren, goed worden beschreven1,2,3,4, zijn deze studies over het algemeen uitgevoerd op kleine groepen isolaten, op soortspecifieke wijze. Belangrijk is dat informatie over gespecialiseerde metaboliet productie, een belangrijke driver van microbiële functie in het milieu, in deze studies is gebleven. Silva et al.5 heeft onlangs een uitgebreide geschiedenis gegeven waarin het ondergebruik van MALDI-TOF MS gedetailleerd wordt uitgelegd om gespecialiseerde metabolieten en het tekort aan software te analyseren om de huidige knelpunten in de bioinformatica te verlichten. Om deze tekortkomingen aan te pakken, creëerden we IDBac, een bioinformatica-pijpleiding die zowel lineaire als reflectieve modi van MALDI-TOF MS6integreert. Dit stelt gebruikers in staat om snel te visualiseren en differentiëren bacteriële isolaten op basis van zowel eiwit en gespecialiseerde metaboliet MS vingerafdrukken, respectievelijk.
IDBac is kosteneffectief, hoge doorvoer en ontworpen voor de leken gebruiker. Het is vrij beschikbaar (chasemc.github.io/IDBac), en vereist alleen toegang tot een MALDI-TOF massaspectrometer (reflectron-modus zal nodig zijn voor gespecialiseerde metaboliet analyse). Monstervoorbereiding berust op de eenvoudige "Extended direct Transfer" methode7,8 en gegevens worden verzameld met opeenvolgende lineaire en reflectron overnames op een enkele MALDI-target plek. Met IDBAC is het mogelijk om de vermoedelijke fylogenie en gespecialiseerde metaboliet productie van honderden kolonies in minder dan vier uur te analyseren, inclusief monstervoorbereiding, gegevensverzameling en gegevensvisualisatie. Dit biedt een aanzienlijk tijd-en kostenvoordeel ten opzichte van traditionele methoden voor het identificeren van bacteriën (zoals gensequencing) en het analyseren van metabole output (vloeistofchromatografie-massaspectrometrie [LCMS] en soortgelijke chromatografische methoden).
Met behulp van gegevens verkregen in lineaire modus analyse, maakt IDBAC gebruik van hiërarchische clustering om de verwantschap van eiwit Spectra weer te geven. Omdat de spectra meestal geïoniseerde ribosomale eiwitten vertegenwoordigen, bieden ze een representatie van de fylogenetische diversiteit in een monster. Daarnaast bevat IDBac reflectron-modus gegevens om gespecialiseerde metaboliet-vingerafdrukken als metaboliet Association Networks (MANs) weer te geven. MANs zijn bipartiete netwerken die het mogelijk maken voor een eenvoudige visualisatie van de gedeelde en unieke metaboliet productie tussen bacteriële isolaten. Het IDBac-platform stelt onderzoekers in staat om zowel eiwitten als gespecialiseerde metaboliet gegevens in tandem te analyseren, maar ook afzonderlijk als slechts één gegevenstype wordt verworven. Belangrijk is dat IDBac onbewerkte gegevens verwerkt van Bruker-en Xiamen-instrumenten, evenals txt, tab, CSV, mzXML en mzML. Dit elimineert de noodzaak voorhand matige conversie en opmaak van gegevenssets, en vermindert aanzienlijk het risico van gebruikers fouten of verkeerd gebruik van MS-gegevens.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>60-002-65</td>
			<td>LC-MS Ultra CHROMASOLV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex Speed LEF MALDI-TOF instrument</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics Bacterial test standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0884024</td>
			<td>Bruker Daltonics 8604530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Peptide Calibration standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9846988</td>
			<td>Bruker Daltonics 8206195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>99.5+%, Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target Plate</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-500</td>
			<td>Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any is ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC293810010</td>
			<td>99.5%, for biochemistry, ACROS Organics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>28166-41-8</td>
			<td>(C2020-25G) &#8805;98% (TLC), powder</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data

Om de relatie te visualiseren tussen bacteriële fylogenie en gespecialiseerde metaboliet productie van bacteriële kolonies die groeien op nutriënt agar, ontwikkelden we IDBac-een low-cost en high-throughput matrix-geassisteerde Laser desorptie/ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) bioinformatica pijpleiding. IDBac software is ontworpen voor niet-experts, is vrij beschikbaar, en in staat om een paar te analyseren om duizenden bacteriële kolonies. Hier presenteren we procedures voor de bereiding van bacteriële kolonies voor MALDI-TOF MS-analyse, MS-instrument bediening en gegevensverwerking en visualisatie in IDBac. In het bijzonder, we instrueren gebruikers hoe te cluster bacteriën in dendrogrammen op basis van eiwit MS vingerafdrukken en interactief maken metaboliet Association Networks (MANs) van gespecialiseerde metaboliet gegevens.

We analyseerden zes stammen van Micromonospora chokoriensis en twee stammen van Bacillus subtilis, die eerder werden gekenmerkt6, met behulp van gegevens beschikbaar op Doi: 10.5281/zenodo. 2574096. Volgende aanwijzingen in het tabblad beginnen met onbewerkte gegevens hebben we de optie Klik hier om Bruker files te converteren en volgde de IDBAC-verstrekte instructies voor elke gegevensset (afbeelding 14).
Nadat de geautomatiseerde conversie en voor verwerking/piek-pieken stappen zijn voltooid, we zijn overgegaan tot het maken van een nieuwe gecombineerde IDBac experiment door het overbrengen van monsters van de twee experimenten in een enkel experiment met zowel Bacillus en Micromonosopora monsters (Figuur 15). De resulterende analyse betrof het vergelijken van eiwit spectra met behulp van spiegel plots, zoals afgebeeld in Figuur 16, wat nuttig was voor het evalueren van de spectra kwaliteit en het aanpassen van de piek-picking instellingen. Afbeelding 17 geeft een screenshot van de resultaten van de eiwit clustering met de standaardinstellingen geselecteerd. Het dendrogram werd gekleurd door het aanpassen van de drempelwaarde op het perceel (verschijnt als een gestippelde lijn). Van nota is de duidelijke scheiding tussen geslachten, met zowel M. chokoriensis als B. subtilis isolaten clustering afzonderlijk.
Afbeelding 18, Figuur 19en figuur 20 accentueren de mogelijkheid om Mans van door de gebruiker geselecteerde regio's te genereren door te klikken en te slepen over het eiwit dendrogram. Hiermee konden we snel MANs maken om alleen de B. subtilis stammen (Figuur 18) te vergelijken, alleen de M. chokoriensis stammen (Figuur 19), en alle stammen tegelijkertijd (figuur 20). De primaire functie van deze netwerken is om onderzoekers te voorzien van een breed overzicht van de mate van gespecialiseerde metaboliet overlapping tussen bacteriën. Met deze gegevens in de hand, onderzoekers hebben nu de capaciteit om geïnformeerde beslissingen te nemen van slechts een kleine hoeveelheid materiaal geschuurd uit een bacteriële kolonie.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2.jpg"> Afbeelding 14: Spectra processing. Gedownloade Bruker autoFlex Spectra werden geconverteerd en verwerkt met behulp van IDBac. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2.jpg"> Figuur 15: gecombineerd IDBac-experiment. Omdat de Micromonospora en Bacillus Spectra werden verzameld op verschillende MALDI doelplaten, werden de twee experimenten vervolgens samengevoegd tot een enkel experiment-"Bacillus_Micromonsopora". Dit werd gedaan binnen de "werken met eerdere experimenten" tab, volg de aanwijzingen in het menu "Transfer samples van eerdere experimenten naar nieuwe/andere experimenten". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 16" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2.jpg"> Afbeelding 16: vergelijking. Micromonspora en Bacillus Spectra werden vergeleken met behulp van de spiegel plots binnen de "eiwit Data Analysis" pagina. Uiteindelijk zijn de standaard piek instellingen gekozen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 17" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2.jpg"> Afbeelding 17: hiërarchische clustering. Hiërarchische Clustering, met behulp van standaardinstellingen, correct gegroepeerde Bacillus en Micromonospora isolaten. Het dendrogram werd gekleurd door het "snijden" van het dendrogram op een willekeurige hoogte (weergegeven als een onderbroken lijn) en 100 Boots riemen gebruikt om vertrouwen te tonen in vertakkingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 18" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2.jpg"> Figuur 18: man gemaakt door het selecteren van de Bacillus SP. stammen uit het eiwit dendrogram toonde differentiële productie van gespecialiseerde metabolieten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 19" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2.jpg"> Figuur 19: man gemaakt door het selecteren van de zes Micromonospora SP. stammen uit het eiwit dendrogram toonde differentiële productie van gespecialiseerde metabolieten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 20" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2.jpg"> Figuur 20: man van Bacillus SP. en Micromonospora SP. stammen die een differentiële productie van gespecialiseerde metabolieten vertonen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data at JoVE.com

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

IDBac is een open-source massaspectrometrie gebaseerde bioinformatica pijpleiding die gegevens van zowel intact eiwit en gespecialiseerde metaboliet spectra, verzameld op celmateriaal geschuurd uit bacteriële kolonies integreert. De pijpleiding stelt onderzoekers in staat om snel honderden tot duizenden bacteriële kolonies in putatieve taxonomische groepen te organiseren en ze verder te differentiëren op basis van gespecialiseerde metaboliet productie.

Met behulp van de open-source MALDI TOF-MS IDBac pijpleiding voor analyse van microbiële eiwitten en gespecialiseerde metaboliet gegevens

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

IDBac koppelt massaspects gegevens uit eiwit- en gespecialiseerde metabolietgebieden van onbekende bacteriële isolaten om snel onderscheid te maken tussen isolaten op basis van zowel hun identiteit als hun potentiële milieufunctie. Onze office source software breidt het nut van bestaande MALDI TOF gebaseerde microbiële identificatie strategieën. Deze uitbreiding omvat analyse van gespecialiseerde stofwisseling als een extra manier om onderscheid te maken tussen kolonies met vergelijkbare fenotypes.Een grote uitdaging bij het karakteriseren van onbekende micro-organismen is het onderscheiden van nauw verwante isolaten. IDBac biedt onderzoekers een eenvoudige en snelle manier om isolaten te karakteriseren door middel van eiwit en kleine molecuulprofilering. IDBac biedt een visuele vergelijking van gespecialiseerde metabolietproductie binnen een bacterieel monster en kan inzicht geven in een breed scala aan onderzoeksonderwerpen, van ecologische studies tot het ontdekken van medicijnlood.Er zijn vele manieren waarop MALDI-gegevens kunnen worden opgeslagen tussen en tussen instrumenten. Als u problemen hebt om bestanden met IDBac te laten werken, dient u een probleem in bij GITHub van IDBac. Met behulp van een steriele tandenstoker, breng een klein deel van een bacteriële kolonie naar de juiste plek op een schone MALDI plaat.Spreid de bacteriële kolonie gelijkmatig over de plek, zodat de plek lijkt zo plat mogelijk. Overlay een microliter van 70% massaspectrometrie kwaliteit mierenzuur op het monster en matrix controle plekken en laat het zuur te drogen in een chemische rookkap. Voeg vervolgens een microliter van eerder voorbereide MALDI matrix oplossing toe aan de monster- en matrixmediacontroleplekken en laat het volledig drogen aan de lucht toe.Na het opzetten van de MALDI TOF massaspectrometer, verwerven van de spectra. Sla de eiwitspectra op in één map en de gespecialiseerde metabolietspectra in een tweede aparte map. Download de IDBac-software om deze procedure te starten.Dubbelklik op de gedownloade install_idbac om het installatieprogramma te starten. Klik vervolgens op de idbac-bureaubladsnelkoppeling om IDBac te starten, die standaard wordt geopend op het tabblad introductie. Klik op het tabblad Starten met gegevens bewerken en kies uit het experimentmenu Een IDBac maken het type gegevens dat met IDBac moet worden gebruikt.Bij het instellen van de conversie en verwerking van gegevensbestanden voert u een beschrijvende naam in voor het experiment waar daarom wordt gevraagd en klikt u op de map met ruwe gegevens en selecteert u de juiste map. Klik vervolgens op Procesgegevens. Nadat u de bestanden hebt geconverteerd en verwerkt met IDBac, gaat u naar het werk met de pagina Eerdere experimenten en selecteert u een experiment waarmee u wilt werken.Voeg informatie over voorbeelden toe met behulp van het menu klik hier om het geselecteerde experiment te wijzigen. Voer informatie in de automatisch ingevulde spreadsheet en druk op Opslaan. Wanneer u klaar bent om met de analyse te beginnen, moet u ervoor zorgen dat het experiment waarmee u moet werken, is geselecteerd.Selecteer vervolgens eiwitgegevensanalyse. Kies op de pagina met eiwitgegevensanalyse de piekpieken en evalueer de eiwitspectra van monsters via de weergegeven spiegelpercelen. Pas het percentage replica's aan waarin een piek aanwezig moet zijn om deze te kunnen opnemen voor analyse.Met behulp van de spiegel percelen als visuele begeleiding, het signaal aan te passen aan ruis cutoff dat de meest echte pieken behoudt en de minste ruis op te wijzen dat meer repliceert in een hoger percentage piek aanwezigheidswaarde zal de selectie van een lager signaal naar ruis cutoff mogelijk te maken. Geef hierna de onderste en bovenste massa op om cutoffs in rekening te brengen die het bereik van massawaarden binnen elk spectrum dicteren dat moet worden gebruikt in verdere analyse door IDBac. Selecteer op de pagina eiwitgegevensanalyse het tabblad Dendrogram om monsters in een dendrogram te groeperen op basis van door de gebruiker geselecteerde afstandsmaten en clusteringalgoritmen.Klik op voorbeelden selecteren in het menu en volg de instructies om voorbeelden te selecteren die in de analyse moeten worden opgenomen. Alleen monsters die eiwitspectra bevatten, worden weergegeven in de beschikbare monsters. Gebruik de standaardwaarden voor de algoritmen voor afstand en clustering en selecteer intensiteiten als invoer.Als u bootstrapwaarden op het dendrogram wilt weergeven, voert u een getal in tussen twee en 1.000 onder bootstraps. Open het dendrogram-menu om te beginnen met het aanpassen van het dendrogram. Als u de lijnen van het dendrogram wilt kleuren, klikt u op Om lijnen te wijzigen en de gewenste opties te selecteren.Als u informatie uit de spreadsheet naast het dendrogram wilt plotten, selecteert u de knop met informatie over voorbeelden. Hiermee wordt een paneel geopend waarin een categorie zichzelf invult op basis van de ingevoerde waarden. Als u voorbeelden uit een ander experiment wilt invoegen, selecteert u de voorbeelden van de menuknop invoegen van een ander experiment en volgt u de aanwijzingen in het onlangs geopende deelvenster.Ga naar de kleine molecuul data-analyse pagina om data visualisatie mogelijk te maken door middel van principe componenten analyse en metabole associatie netwerken die tweeledige netwerken gebruiken om de correlatie van kleine molecuul massa weer te geven om waarden op te laden met monsters. Klik en sleep op het dendrogram om bepaalde voorbeelden van interesses te markeren die moeten worden geanalyseerd. Als er geen monsters worden gemarkeerd of er geen eiwitdendrogram is gemaakt, verschijnt er respectievelijk een metabolietassociatienetwerk van een willekeurige subset of alle monsters.Als u een matrixmedia leeg wilt aftrekken in het metabolietkoppelingsnetwerk, opent u het menu een voorbeeld selecteren dat u wilt aftrekken en kiest u het juiste voorbeeld dat u als leeg wilt gebruiken. Open de menu-instellingen voor MAN-instellingen voor het weergeven/verbergen van de gewenste waarden voor een percentage piekaanwezigheid en repliceren, signaal naar ruis en bovenste en lagere massasnedes. Gebruik de kleine molecule spiegel plots om de selectie van deze instellingen te begeleiden.Voor rapportageresultaten kopieert u de tekst in de suggesties voor het rapporteren van man-analyseparagraaf om de door de gebruiker gedefinieerde instellingen te bieden die worden gebruikt om een gemaakt metabolisch associatienetwerk te genereren. Zes stammen van Micromonospora chokoriensis en twee vlekken van Bacillus subtilis werden geanalyseerd met behulp van gegevens in de IDBac software. Na aanwijzingen in het begin met raw data tab, de optie klik hier om Bruker bestanden te converteren werd geselecteerd en de IDBac verstrekte instructies werden gevolgd voor elke data set.Om de geautomatiseerde conversie en pre-processing piekpieken stappen, een gecombineerde IDBac experiment werd gemaakt door de overdracht van Bacillus en Micromonospora monsters uit de twee experimenten in een enkel experiment. De resulterende analyse omvatte het vergelijken van eiwitspectra met behulp van spiegelpercelen die nuttig was voor de evaluatie van spectra kwaliteit en het aanpassen van piekpieken instellingen. Hier wordt een screenshot weergegeven van de eiwitclusteringsresultaten met standaardinstellingen geselecteerd.Het dendrogram werd gekleurd door de drempel op het perceel aan te passen. Van nota is de duidelijke scheiding tussen geslachten met zowel M.chokoriensis als B.subtilis isoleert afzonderlijk. Door te klikken en te slepen over het eiwit dendrogram, was het mogelijk om snel metabole associatie netwerken om alleen de B.subtilis stammen te vergelijken, alleen de M.chokoriensis stammen, en alle stammen tegelijk.De primaire functie van deze netwerken is om onderzoekers een breed overzicht te geven van de mate van gespecialiseerde metaboliet overlap tussen bacteriën. Wanneer u met nieuwe gegevens werkt, gebruikt u de spiegelplots van IDBac om ervoor te zorgen dat uw gegevens zinvol zijn en spectra van hoge kwaliteit zijn. Evalueer uw experimentele ontwerp en resultaten bij elke stap kritisch.IDBac stelt onderzoekers in staat om kleine en diverse bibliotheken van micro-organismen te bouwen voor verder onderzoek. Dit vermindert de kosten in verband met traditioneel grote en overbodige microbiële bibliotheken sterk. Omdat IDBac u toestaat om gespecialiseerde metaboliet overlap binnen zeer gelijkaardige fylogenetische groepen te visualiseren, kan het worden gebruikt om onderzoeksvragen en hypothesen te produceren die twee typisch losgekoppelde gebieden verbinden.Mierenzuur is bijtend en moet worden behandeld in een chemische rookkap. Sommige milieu-isolaten kunnen potentiële gezondheidsrisico's opleveren en alle stammen moeten worden behandeld als bioveiligheidsniveau twee.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van het eiwit-eiwit interactie tussen HCN1 en TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Beoordelen van de levensvatbaarheid van een synthetische bacteriële Consortium op de In Vitro -Interface van het Gut-Host-microbe

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Proeflezen en DNA Repair Assay met behulp van één Nucleotide uitbreiding en MALDI-TOF massa spectrometrie analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Een monstervoorbereidingspijplijn voor microkristallen op de VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Nauwkeurige en nauwkeurige FRET-metingen met één molecuul uitvoeren met behulp van de Open-Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Shotgun Proteomics Sample Processing geautomatiseerd door een open-source labrobot

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Single-Particle Cryo-EM Data Collection met Stage Tilt met Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...