Name: using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data
Uploaded: 2019-05-15T13:00:00
Duration: 9 min 29 s
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Ce travail a été soutenu par national Institute of General Medical Sciences Grant R01 GM125943, National Geographic Grant CP-044R-17; Subvention du Fonds islandais de recherche 152336-051; et l'Université de l'Illinois à Chicago fonds de démarrage. De plus, nous remercions les contributeurs suivants : Dr Amanda Bulman pour son aide aux paramètres d'acquisition de protéines MALDI-TOF MS; Dr Terry Moore et Dr Atul Jain pour recrystallizing alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid matrix (CHCA).

<ol>
	<li>Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+TOF+MS+profiling+of+bacteria+at+the+strain+level:+A+review.">MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review.</a> Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).</li><li>Cain, T. C., Lubman, D. M., Weber, W. J., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+bacteria+using+protein+profiles+from+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Differentiation of bacteria using protein profiles from matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8 (12), 1026-1030 (1994).</li><li>Holland, R. D., Wilkes, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+intact+whole+bacteria+based+on+spectral+patterns+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+with+time-of-flight+mass+spectrometry.">Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 10 (10), 1227-1232 (1996).</li><li>Rahi, P., Prakash, O., Shouche, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass-spectrometry+(MALDI-TOF+MS)+based+microbial+identifications:+challenges+and+scopes+for+microbial+ecologists.">Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass-spectrometry (MALDI-TOF MS) based microbial identifications: challenges and scopes for microbial ecologists.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1359 (2016).</li><li>Silva, R., Lopes, N. P., Silva, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+MALDI+mass+spectrometry+in+natural+products+analysis.">Application of MALDI mass spectrometry in natural products analysis.</a> Planta Medica. 82, 671-689 (2016).</li><li>Clark, C. M., Costa, M. S., Sanchez, L. M., Murphy, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+MALDI-TOF+mass+spectrometry+protein+and+specialized+metabolite+analyses+to+rapidly+discriminate+bacterial+function.">Coupling MALDI-TOF mass spectrometry protein and specialized metabolite analyses to rapidly discriminate bacterial function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4981-4986 (2018).</li><li>Freiwald, A., Sauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+classification+and+identification+of+bacteria+by+mass+spectrometry.">Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 4 (5), 732-742 (2009).</li><li>Schulthess, B., Bloemberg, G. V., Zbinden, R., B&#246;ttger, E. 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C., Maclean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics.">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534 (2008).</li><li>Martens, L., Chambers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mzML-a+community+standard+for+mass+spectrometry+data.">mzML-a community standard for mass spectrometry data.</a> Molecular &#38; Cellular Proteomics. 10 (1), (2011).</li></ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Le protocole IDBac détaille l'acquisition et l'analyse de données de métabolites spécialisés de jusqu'à 384 isolats bactériens en 4 h par un seul chercheur. Avec IDBac il n'est pas nécessaire d'extraire l'ADN des isolats bactériens ou de générer des extraits spécialisés de métabolites à partir de bouillons de fermentation liquide et de les analyser à l'aide de méthodes chromatographiques. Au lieu de cela, les données de protéine et de métabolite spécialisés sont rassemblées en répandant simplement le matériel des colonies bactériennes directement sur une plaque cible de MALDI. Cela réduit considérablement le temps et le coût associés à des techniques alternatives telles que le séquençage du gène 16S rRNA et LCMS9.
Il est important d'ajouter une matrice vierge et des taches d'étalonnage à la plaque MALDI, et nous recommandons d'utiliser un nombre approprié de répliques pour assurer la reproductibilité et la confiance statistique. Le nombre de répliques dépendra de l'expérience. Par exemple, si un utilisateur a l'intention de différencier des milliers de colonies d'une collection de plaques de diversité environnementale, moins de répliques peuvent être nécessaires (notre laboratoire recueille trois répliques techniques par colonie). Alternativement, si un utilisateur souhaite créer une base de données personnalisée de souches de taxons bactériens spécifiques pour déterminer rapidement les classifications sous-espèces d'isolats inconnus, alors d'autres répliques sont appropriées (notre laboratoire recueille huit répliques biologiques par souche).
IDBac est un outil permettant de différencier rapidement les isolats bactériens hautement liés à partir d'informations taxonomiques présumées et de la production spécialisée de métabolites. Il peut compléter ou servir de précurseur à des méthodes orthogonales telles que des analyses génétiques approfondies, des études impliquant la production et la fonction des métabolites, ou la caractérisation de la structure spécialisée des métabolites par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire et/ou LC-MS/MS.
La production spécialisée de métabolites (IDBac MANs) est très sensible aux conditions de croissance bactérienne, en particulier en utilisant différents médias, ce qui est une limitation potentielle de la méthode. Toutefois, ces traits peuvent être exploités par l'utilisateur, car IDBac peut facilement générer des NMA montrant les différences dans la production spécialisée de métabolites dans une variété de conditions de croissance. Il est important de noter que même si les empreintes digitales spécialisées des métabolites peuvent varier selon l'état de croissance, nous avons déjà montré que les empreintes digitales protéiques demeurent relativement stables entre ces variables (voir Clark et coll.6). Lorsqu'il s'agit de plaques de diversité environnementale, nous recommandons de purifier les isolats bactériens avant l'analyse afin de réduire les contributions possibles des cross-talk bactériens voisins.
Enfin, l'absence d'une base de données publique consultable sur les empreintes digitales protéiques de la SP est une lacune majeure dans l'utilisation de cette méthode pour classer les bactéries environnementales inconnues. Nous avons créé IDBac dans cet esprit, et inclus la conversion automatisée des données dans un format open-source accepté par la communauté (mzML)10,11,12 et conçu le logiciel pour permettre la recherche, le partage et la création de bases de données personnalisées. Nous sommes en train de créer une grande base de données publique (10 000 souches entièrement caractérisées), qui permettra la classification de certains isolats au niveau de l'espèce, y compris des liens vers les numéros d'adhésion de GenBank lorsqu'ils seront disponibles.
IDBac est open source et le code est disponible pour tout le monde pour personnaliser leurs besoins d'analyse de données et de visualisation. Nous recommandons aux utilisateurs de consulter un vaste corpus de littérature (Sauer et al.7, Silva et coll.5) pour les aider à soutenir et à concevoir leurs objectifs expérimentaux. Nous organisons un forum de discussion à: https://groups.google.com/forum/#!forum/idbac et un moyen de signaler les problèmes avec le logiciel à: https://github.com/chasemc/IDBacApp/issues.

Un obstacle majeur pour les chercheurs qui étudient la fonction bactérienne est la capacité d'évaluer rapidement et simultanément l'identité taxonomique d'un micro-organisme et sa capacité à produire des métabolites spécialisés. Cela a empêché des progrès significatifs dans la compréhension de la relation entre la phylogénie bactérienne et la production spécialisée de métabolites dans la majorité des bactéries isolées de l'environnement. Bien que les méthodes basées sur la SP qui utilisent des empreintes digitales protéiques pour regrouper et identifier les bactéries soient bien décrites1,2,3,4, ces études ont généralement été réalisées sur de petits groupes d'isolats, d'une manière spécifique à l'espèce. Fait important, l'information sur la production spécialisée de métabolites, un moteur majeur de la fonction microbienne dans l'environnement, n'a pas été incorporée dans ces études. Silva et coll.5 ont récemment fourni un historique complet détaillant la sous-utilisation de MALDI-TOF MS pour analyser les métabolites spécialisés et la pénurie de logiciels pour soulager les goulots d'étranglement actuels en bioinformatique. Afin de remédier à ces lacunes, nous avons créé IDBac, un pipeline bioinformatique qui intègre à la fois les modes linéaires et réfléchissants de MALDI-TOF MS6. Cela permet aux utilisateurs de visualiser et de différencier rapidement les isolats bactériens à partir de protéines et de métabolites spécialisés, respectivement, les empreintes digitales de la SP.
IDBac est rentable, à haut débit, et conçu pour l'utilisateur laïc. Il est disponible gratuitement (chasemc.github.io/IDBac), et ne nécessite l'accès qu'à un spectromètre de masse MALDI-TOF (le mode réflecteur sera nécessaire pour l'analyse spécialisée des métabolites). La préparation de l'échantillon repose sur la méthode simple de « transfert direct étendu »7,8 et les données sont recueillies avec des acquisitions linéaires et réfléchissantes consécutives sur un seul point MALDI-cible. Avec IDBac, il est possible d'analyser la phylogénie putative et la production spécialisée de métabolites de centaines de colonies en moins de quatre heures, y compris la préparation d'échantillons, l'acquisition de données et la visualisation des données. Ceci présente un avantage significatif de temps et de coût sur les méthodes traditionnelles d'identification des bactéries (telles que le séquençage de gène), et d'analyse de la sortie métabolique (spectrométrie de masse de chromatographie liquide [LCMS] et méthodes chromatographiques semblables).
À l'aide de données obtenues dans le cadre d'une analyse linéaire en mode, IDBac utilise un clusterhiérarchique pour représenter la parenté des spectres protéiques. Étant donné que les spectres représentent principalement des protéines ribosomal ionisées, ils fournissent une représentation de la diversité phylogénétique présente dans un échantillon. En outre, IDBac intègre des données en mode réflecteur pour afficher des empreintes digitales spécialisées métabolites sous forme de metabolite Association Networks (MANs). Les MAN sont des réseaux bipartites qui permettent une visualisation facile de la production de métabolites partagée et unique entre les isolats bactériens. La plate-forme IDBac permet aux chercheurs d'analyser à la fois les données protéiques et les métabolites spécialisés en tandem, mais aussi individuellement si un seul type de données est acquis. Fait important, IDBac traite les données brutes des instruments Bruker et Xiamen, ainsi que txt, onglet, csv, mzXML et mzML. Cela élimine le besoin de conversion manuelle et de mise en forme des ensembles de données, et réduit considérablement le risque d'erreur de l'utilisateur ou de mauvaise manipulation des données De SP.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>60-002-65</td>
			<td>LC-MS Ultra CHROMASOLV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex Speed LEF MALDI-TOF instrument</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics Bacterial test standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0884024</td>
			<td>Bruker Daltonics 8604530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Peptide Calibration standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9846988</td>
			<td>Bruker Daltonics 8206195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>99.5+%, Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target Plate</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-500</td>
			<td>Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any is ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC293810010</td>
			<td>99.5%, for biochemistry, ACROS Organics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>28166-41-8</td>
			<td>(C2020-25G) &#8805;98% (TLC), powder</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data

Afin de visualiser la relation entre la phylogénie bactérienne et la production spécialisée de métabolites des colonies bactériennes poussant sur l'agar nutritif, nous avons développé IDBac-une desorption/ionisation laser à faible coût et à haut débit spectrométrie de masse en temps de vol (MALDI-TOF MS) pipeline bioinformatique. Le logiciel IDBac est conçu pour les non-experts, est disponible gratuitement, et capable d'analyser quelques à des milliers de colonies bactériennes. Ici, nous présentons des procédures pour la préparation des colonies bactériennes pour l'analyse mS MALDI-TOF, l'opération des instruments de SP, et le traitement et la visualisation des données dans IDBac. En particulier, nous instruisons les utilisateurs comment regrouper les bactéries en dendrogrammes à partir d'empreintes digitales protéiques de la SP et créons de manière interactive les réseaux d'associations de métabolites (MN) à partir de données spécialisées sur les métabolites.

Nous avons analysé six souches de Micromonospora chokoriensis et deux souches de Bacillus subtilis, qui étaient auparavant caractérisées6, en utilisant des données disponibles à DOI: 10.5281/zenodo.2574096. Suivant les instructions dans l'onglet Démarrage avec données brutes, nous avons sélectionné l'option Cliquez ici pour convertir les fichiers Bruker et suivi les instructions fournies par IDBac pour chaque jeu de données (Figure 14).
Une fois les étapes automatisées de conversion et de prétraitement/pic, nous avons procédé à la création d'une nouvelle expérience combinée IDBac en transférant des échantillons des deux expériences dans une seule expérience contenant à la fois Bacillus et Échantillons de micromonosopora (figure 15). L'analyse qui en a résulté a consisté à comparer les spectres protéiques à l'aide de parcelles miroirs, telles qu'illustrées à la figure 16, ce qui a été utile pour évaluer la qualité des spectres et ajuster les paramètres de pic-picking. Figure 17 affiche une capture d'écran des résultats de regroupement de protéines avec les paramètres par défaut sélectionnés. Le dendrogramme a été coloré en ajustant le seuil sur l'intrigue (apparaît comme une ligne pointillée). Il convient de noter la séparation claire entre les genres, avec à la fois M. chokoriensis et B. subtilis isole groupage séparément.
Figure 18, Figure 19, et Figure 20 mettent en évidence la capacité de générer des NAM de régions sélectionnées par l'utilisateur en cliquant et en faisant glisser à travers le dendrogramme de protéines. Avec cela, nous avons été en mesure de créer rapidement DES NMA pour comparer seulement les souches B. subtilis (Figure 18), seulement les souches de M. chokoriensis (Figure 19), et toutes les souches simultanément (Figure 20). La fonction principale de ces réseaux est de fournir aux chercheurs une vue d'ensemble du degré de chevauchement des métabolites spécialisés entre les bactéries. Avec ces données en main, les chercheurs ont maintenant la capacité de prendre des décisions éclairées à partir seulement d'une petite quantité de matériel gratté à partir d'une colonie bactérienne.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2.jpg"> Figure 14 : Traitement spectral. Les spectres autoFlex Bruker téléchargés ont été convertis et traités à l'aide d'IDBac. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2.jpg"> Figure 15 : Expérience combinée IDBac. Étant donné que les spectres Micromonospora et Bacillus ont été recueillis sur différentes plaques cibles MALDI, les deux expériences ont ensuite été combinées en une seule expérience - "Bacillus-Micromonsopora". Cela a été fait dans l'onglet "Travailler avec des expériences antérieures", en suivant les instructions dans le menu "Transférer des échantillons d'expériences précédentes à de nouvelles /autres expériences". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 16" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2.jpg"> Figure 16 : Comparaison. Les spectres De Micromonspora et Bacillus ont été comparés à l'aide des parcelles miroirs de la page « Analyse des données protéiques ». En fin de compte, les paramètres de pointe par défaut ont été choisis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 17" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2.jpg"> Figure 17 : Regroupement hiérarchique. Le clustering hiérarchique, à l'aide de paramètres par défaut, a correctement regroupé les isolats Bacillus et Micromonospora. Le dendrogramme a été coloré en « coupant » le dendrogramme à une hauteur arbitraire (affichée comme une ligne pointillée) et 100 bootstraps utilisés pour montrer la confiance dans la ramification. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 18" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2.jpg"> Figure 18 : L'homme créé en sélectionnant les souches de Bacillus sp. du dendrogramme protéique a montré une production différentielle de métabolitesspécialisés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 19" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2.jpg"> Figure 19 : L'homme créé en sélectionnant les six souches de Micromonospora sp. du dendrogramme protéique a montré la production différentielle de métabolites spécialisés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 20" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2.jpg"> Figure 20 : MAN de Bacillus sp. et Micromonospora sp. souches montrant une production différentielle de métabolites spécialisés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

IDBac est un pipeline bioinformatique à base de spectrométrie de masse open source qui intègre des données provenant à la fois de protéines intactes et de spectres de métabolites spécialisés, recueillis sur des matériaux cellulaires extraits de colonies bactériennes. Le pipeline permet aux chercheurs d'organiser rapidement des centaines à des milliers de colonies bactériennes en groupes taxonomiques putatifs, et de les différencier davantage en fonction de la production spécialisée de métabolites.

Utilisation du pipeline Open-Source MALDI TOF-MS IDBac pour l'analyse des protéines microbiennes et des données spécialisées sur les métabolites

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

IDBac couples données spec de masse de protéines et de régions métabolites spécialisées d’isolats bactériens inconnus pour discriminer rapidement entre les isolats en fonction de leur identité et leur fonction environnementale potentielle. Notre logiciel de source de bureau étend l’utilité des stratégies existantes d’identification microbienne basées sur MALDI TOF. Cette extension comprend l’analyse du métabolisme spécialisé comme un moyen supplémentaire de différencier les colonies avec des phénotypes similaires.Un défi majeur dans la caractérisation des micro-organismes inconnus consiste à distinguer les isolats étroitement apparentés. IDBac offre aux chercheurs un moyen facile et rapide de caractériser les isolats par le profilage des protéines et des petites molécules. IDBac fournit une comparaison visuelle de la production spécialisée de métabolites au sein d’un échantillon bactérien et peut fournir un aperçu d’un large éventail de sujets de recherche, des études écologiques à la découverte de plomb médicamenteuse.Il existe de nombreuses façons d’économiser les données MALDI entre et entre les instruments. Si vous avez de la difficulté à obtenir des fichiers pour travailler avec IDBac, soumettez un problème à GitHub d’IDBac. À l’aide d’un cure-dent stérile, transférer une petite partie d’une colonie bactérienne à l’endroit approprié sur une plaque MALDI propre.Répartir uniformément la colonie bactérienne sur place afin que l’endroit semble aussi plat que possible. Superposer un microlitre de 70 % d’acide formic de qualité spectrométrie de masse sur l’échantillon et les taches de contrôle matricielle et permettre à l’acide de sécher à l’air dans un capot chimique. Ensuite, ajoutez un microlitre de solution matricielle MALDI précédemment préparée aux taches de contrôle des médias de l’échantillon et de la matrice et laissez sécher complètement l’air.Après avoir mis en place le spectromètre de masse MALDI TOF, acquérir les spectres. Enregistrez les spectres protéiques dans un dossier et les spectres métabolites spécialisés dans un deuxième dossier distinct. Pour commencer cette procédure, téléchargez le logiciel IDBac.Double-cliquez sur le install_idbac pour lancer l’installateur. Ensuite, cliquez deux fois sur le raccourci de bureau IDBac pour lancer IDBac qui s’ouvrira sur l’onglet d’introduction par défaut. Cliquez sur l’onglet Démarrer avec des données brutes et choisissez parmi le menu d’expérience IDBac le type de données à utiliser avec IDBac.Lors de la configuration de la conversion et du traitement des fichiers de données, entrez un nom descriptif pour l’expérience lorsque cela est motivé et cliquez sur le dossier de données brutes et sélectionnez le dossier approprié. Cliquez ensuite sur Les données de processus. Après avoir converti les fichiers et les avoir traités avec IDBac, accédez au travail avec la page d’expériences précédentes et sélectionnez une expérience avec qui travailler.Ajoutez des informations sur les échantillons à l’aide du menu cliquez ici pour modifier l’expérience sélectionnée. Entrez des informations dans la feuille de calcul autopopulée et appuyez sur Enregistrer. Lorsque vous êtes prêt à commencer l’analyse, assurez-vous que l’expérience avec qui travailler est sélectionnée.Sélectionnez ensuite l’analyse des données protéiques. Dans la page d’analyse des données protéiques, choisissez les paramètres de pointe et évaluez les spectres protéiques des échantillons via les parcelles miroir affichées. Ajuster le pourcentage de répliques dans lesquelles un pic doit être présent pour qu’il soit inclus pour analyse.En utilisant les parcelles miroir comme guidage visuel, réglez le signal à la coupure de bruit qui conserve les pics les plus authentiques et le moins de bruit notant que plus de répliques dans un pourcentage plus élevé de la valeur de présence maximale permettra la sélection d’un signal inférieur à la coupure de bruit. Par la suite, spécifiez la masse inférieure et supérieure pour charger les seuils dictant la gamme de valeurs de masse dans chaque spectre à utiliser dans une analyse plus approfondie par IDBac. Dans la page d’analyse des données protéiques, sélectionnez l’onglet Dendrogram pour permettre de regrouper les échantillons dans un dendrogram en fonction des mesures de distance sélectionnées par l’utilisateur et des algorithmes de clustering.Cliquez sur sélectionner des échantillons sur le menu et suivez les instructions pour sélectionner les échantillons à inclure dans l’analyse. Seuls les échantillons contenant des spectres protéiques seront affichés dans la boîte d’échantillons disponible. Utilisez les valeurs par défaut pour les algorithmes de distance et de clustering et sélectionnez les intensités comme entrée.Pour afficher les valeurs bootstrap sur le dendrogram, entrez un nombre entre deux et 1000 sous bootstraps. Pour commencer à personnaliser le dendrogram, ouvrez le menu de déndrogram. Pour colorier les lignes du dendrogram, sélectionnez cliquez pour modifier les lignes et sélectionner les options souhaitées.Pour tracer les informations de la feuille de calcul à côté du dendrogram, sélectionnez le bouton incorporer des informations sur les échantillons. Cela ouvrira un panel où une catégorie s’auto-peuplera en fonction des valeurs saisies. Pour insérer des échantillons d’une autre expérience, sélectionnez le bouton menu insérer des échantillons d’une autre expérience et suivez les instructions dans le panneau nouvellement ouvert.Passez à la page d’analyse des données des petites molécules pour permettre la visualisation des données par l’analyse des composants principaux et les réseaux d’associations métaboliques qui utilisent des réseaux bipartites pour afficher la corrélation de la masse des petites molécules pour charger les valeurs avec des échantillons. Cliquez et faites glisser sur le dendrogram pour mettre en évidence certains échantillons d’intérêt à analyser. Si aucun échantillon n’est mis en évidence ou si aucun dendrogram protéique n’a été créé, un réseau d’association de métabolites d’un sous-ensemble aléatoire ou de tous les échantillons apparaîtra respectivement.Pour soustraire un média matriciel vide dans le réseau d’associations de métabolites, ouvrez le menu sélectionnez un échantillon pour soustraire et choisissez l’échantillon approprié à utiliser comme blanc. Ouvrez le menu afficher/masquer les paramètres MAN pour sélectionner les valeurs désirées pour un pourcentage de présence maximale et répliquer, signaler au bruit et les coupures de masse supérieures et inférieures. Utilisez les petites parcelles miroir molécule pour guider la sélection de ces paramètres.Pour la communication des résultats, copiez le texte dans les suggestions de rapport man analyse paragraphe pour fournir les paramètres définis par l’utilisateur utilisés pour générer créé réseau d’association métabolique. Six souches de Micromonospora chokoriensis et deux taches de Bacillus subtilis ont été analysées à l’aide de données dans le logiciel IDBac. Suivant les instructions dans le démarrage avec l’onglet données brutes, l’option cliquez ici pour convertir les fichiers Bruker a été sélectionnée et l’IDBac a fourni des instructions ont été suivies pour chaque ensemble de données.Aux étapes de pointe de conversion et de pré-traitement automatisées, une expérience IDBac combinée a été créée en transférant des échantillons bacillus et micromonospora des deux expériences en une seule expérience. L’analyse qui en a résulté consistait à comparer les spectres protéiques à l’aide de parcelles miroirs qui étaient utiles pour évaluer la qualité des spectres et ajuster les paramètres de pointe. Une capture d’écran des résultats de clustering protéique avec les paramètres par défaut sélectionnés est affichée ici.Le dendrogram a été coloré en ajustant le seuil sur la parcelle. Il convient de noter la séparation claire entre les genres avec les isolats M.chokoriensis et B.subtilis regroupés séparément. En cliquant et en faisant glisser à travers le dendrogram protéique, il a été possible de créer rapidement des réseaux d’associations métaboliques pour comparer uniquement les souches B.subtilis, seules les souches M.chokoriensis, et toutes les souches simultanément.La fonction principale de ces réseaux est de fournir aux chercheurs un large aperçu du degré de chevauchement spécialisé des métabolites entre les bactéries. Lorsque vous travaillez avec de nouvelles données, utilisez les parcelles miroir d’IDBac pour vous assurer que vos données sont logiques et que les spectres sont de haute qualité. Évaluez de façon critique votre conception expérimentale et vos résultats à chaque étape.IDBac permet aux chercheurs de construire des bibliothèques petites et diversifiées de micro-organismes pour une étude plus approfondie. Cela réduit considérablement les coûts associés aux bibliothèques microbiennes traditionnellement grandes et redondantes. Étant donné qu’IDBac vous permet de visualiser le chevauchement des métabolites spécialisés au sein de groupes phylogénétiques très similaires, il peut être utilisé pour générer des questions de recherche et des hypothèses qui relient deux champs généralement déconnectés.L’acide formique est caustique et doit être manipulé dans une hotte chimique de fumée. Certains isolats environnementaux peuvent présenter des risques potentiels pour la santé et toutes les souches devraient être traitées comme de niveau de biosécurité deux.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Procédé pour l&#39;identification d&#39;inhibiteurs de petites molécules de l&#39;interaction protéine-protéine entre HCN1 et TRIP8b

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Recherche

Biochimie

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