Name: using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data
Uploaded: 2019-05-15T13:00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom National Institute of General Medical Sciences Grant R01 GM125943, National Geographic Grant CP-044R-17 unterstützt; Zuschuss des isländischen Forschungsfonds 152336-051; und University of Illinois at Chicago Startup Funds. Außerdem danken wir den folgenden Mitwirkenden: Dr. Amanda Bulman für die Unterstützung bei den Parametern für den Erwerb von MALDI-TOF MS-Proteinen; Dr. Terry Moore und Dr. Atul Jain zur Rekristallisation von Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic acid matrix (CHCA).

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	<li>Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+TOF+MS+profiling+of+bacteria+at+the+strain+level:+A+review.">MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review.</a> Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).</li><li>Cain, T. C., Lubman, D. M., Weber, W. J., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+bacteria+using+protein+profiles+from+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Differentiation of bacteria using protein profiles from matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8 (12), 1026-1030 (1994).</li><li>Holland, R. D., Wilkes, J. 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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das IDBac-Protokoll beschreibt die Erfassung und Analyse von bis zu 384 bakteriellen Isolaten in 4 h durch einen einzigen Forscher. Mit IDBac ist es nicht notwendig, DNA aus bakteriellen Isolaten zu extrahieren oder spezielle Metabolitenextrakte aus flüssigen Fermentationsbrühen zu erzeugen und sie mit chromatographischen Methoden zu analysieren. Stattdessen werden Protein- und spezialisierte Metabolitendaten gesammelt, indem Material aus Bakterienkolonien einfach direkt auf eine MALDI-Zielplatte verteilt wird. Dies reduziert den Zeit- und Kostenaufwand für alternative Techniken wie 16S rRNA-Gensequenzierung und LCMS9erheblich.
Es ist wichtig, der MALDI-Platte einen Matrixrohling und Kalibrierflecken hinzuzufügen, und wir empfehlen die Verwendung einer geeigneten Anzahl von Replikationen, um Reproduzierbarkeit und statistisches Vertrauen zu gewährleisten. Die Anzahl der Replikationen ist experimentabhängig. Wenn ein Benutzer beispielsweise beabsichtigt, Tausende von Kolonien von einer Sammlung von Umweltdiversitätsplatten zu unterscheiden, können weniger Replikationen erforderlich sein (unser Labor sammelt drei technische Replikationen pro Kolonie). Wenn ein Benutzer eine benutzerdefinierte Datenbank mit Stämmen aus bestimmten bakteriellen Taxa erstellen möchte, um schnell Unterartenklassifikationen unbekannter Isolate zu bestimmen, dann sind weitere Replikationen angebracht (unser Labor sammelt acht biologische Replikationen pro Dehnung).
IDBac ist ein Werkzeug zur schnellen Differenzierung hochverwandter bakterienisolate auf der Grundlage vermeintlicher taxonomischer Informationen und spezialisierter Metabolitenproduktion. Es kann orthogonale Methoden wie eingehende genetische Analysen, Studien mit Metabolitenproduktion und -funktion oder die Charakterisierung der spezialisierten Metabolitenstruktur durch Kernspinresonanzspektroskopie und/oder LC-MS/MS.
Die spezialisierte Metabolitenproduktion (IDBac MANs) ist sehr anfällig für bakterielle Wachstumsbedingungen, insbesondere mit verschiedenen Medien, was eine potenzielle Einschränkung der Methode darstellt. Diese Eigenschaften können jedoch vom Benutzer ausgenutzt werden, da IDBac leicht MANs erzeugen kann, die die Unterschiede in der spezialisierten Metabolitenproduktion unter einer Vielzahl von Wachstumsbedingungen zeigen. Es ist wichtig zu beachten, dass zwar spezialisierte Metaboliten-Fingerabdrücke je nach Wachstumsbedingung variieren können, wir aber zuvor gezeigt haben, dass Protein-Fingerabdrücke über diese Variablen hinweg relativ stabil bleiben (siehe Clark et al.6). Im Umgang mit Umweltdiversitätsplatten empfehlen wir, bakterielle Isolate vor der Analyse zu reinigen, um mögliche Beiträge aus benachbarten bakteriellen Quergesprächen zu reduzieren.
Schließlich ist das Fehlen einer durchsuchbaren öffentlichen Datenbank mit Protein-MS-Fingerabdrücken ein großes Manko bei der Verwendung dieser Methode zur Klassifizierung unbekannter Umweltbakterien. Wir haben IDBac in diesem Sinne erstellt und die automatisierte Konvertierung von Daten in ein von der Community akzeptiertes Open-Source-Format (mzML)10,11,12 integriert und die Software so konzipiert, dass das Suchen, Teilen und Erstellen von benutzerdefinierte Datenbanken. Wir sind dabei, eine große öffentliche Datenbank (>10.000 voll charakterisierte Stämme) zu erstellen, die die Klassifizierung einiger Isolate auf Artenebene ermöglicht, einschließlich Links zu GenBank-Beitrittsnummern, wenn verfügbar.
IDBac ist Open Source und der Code ist für jedermann verfügbar, um seine Datenanalyse- und Visualisierungsanforderungen anzupassen. Wir empfehlen den Benutzern, eine umfangreiche Literatur (Sauer et al.7, Silva et al.5) zu konsultieren, um ihre experimentellen Ziele zu unterstützen und zu entwerfen. Wir veranstalten ein Diskussionsforum unter: https://groups.google.com/forum/#!forum/idbac und eine Möglichkeit, Probleme mit der Software zu melden unter: https://github.com/chasemc/IDBacApp/issues.

Ein großes Hindernis für Forscher, die die bakterielle Funktion untersuchen, ist die Fähigkeit, schnell und gleichzeitig die taxonomische Identität eines Mikroorganismus und seine Fähigkeit zur Herstellung spezialisierter Metaboliten zu bewerten. Dies hat signifikante Fortschritte beim Verständnis der Beziehung zwischen bakterieller Phylogenie und spezialisierter Metabolitenproduktion in der Mehrheit der aus der Umwelt isolierten Bakterien verhindert. Obwohl MS-basierte Methoden, die Protein-Fingerabdrücke verwenden, um Bakterien zu gruppieren und zu identifizieren, gut beschrieben sind1,2,3,4, wurden diese Studien im Allgemeinen an kleinen Gruppen von Isolaten durchgeführt, artspezifisch. Wichtig ist, dass Informationen über die spezialisierte Metabolitenproduktion, ein wichtiger Treiber der mikrobiellen Funktion in der Umwelt, in diesen Studien nicht berücksichtigt wurden. Silva et al.5 lieferten vor kurzem eine umfassende Geschichte, die die Unternutzung von MALDI-TOF MS zur Analyse spezialisierter Metaboliten und den Mangel an Software zur Linderung aktueller Bioinformatik-Engpässe detailliert darlegte. Um diese Mängel zu beheben, haben wir IDBac geschaffen, eine Bioinformatik-Pipeline, die sowohl lineare als auch reflekronische Modi von MALDI-TOF MS6integriert. Dies ermöglicht es Benutzern, bakterielle Isolate schnell zu visualisieren und zu unterscheiden, die sowohl auf Protein- als auch auf spezialisierten Metaboliten-MS-Fingerabdrücken basieren.
IDBac ist kostengünstig, mit hohem Durchsatz und für den Laienbenutzer konzipiert. Es ist frei verfügbar (chasemc.github.io/IDBac) und erfordert nur Zugriff auf ein MALDI-TOF-Massenspektrometer (für die spezielle Metabolitenanalyse ist ein Reflekronmodus erforderlich). Die Probenvorbereitung basiert auf der einfachen Methode der "erweiterten direkten Übertragung"7,8 und die Daten werden mit aufeinanderfolgenden linearen und reflekronischen Erfassungen an einem einzigen MALDI-Zielpunkt gesammelt. Mit IDBac ist es möglich, die vermeintliche Phylogenie und spezialisierte Metabolitenproduktion von Hunderten von Kolonien in weniger als vier Stunden zu analysieren, einschließlich Probenvorbereitung, Datenerfassung und Datenvisualisierung. Dies stellt einen erheblichen Zeit- und Kostenvorteil gegenüber herkömmlichen Methoden zur Identifizierung von Bakterien (z. B. Gensequenzierung) und zur Analyse des metabolischen Outputs (Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie [LCMS] und ähnliche chromatographische Methoden) dar.
Mithilfe von Daten, die in der Linearmodusanalyse gewonnen wurden, verwendet IDBac hierarchisches Clustering, um die Verwandtheit von Proteinspektren darzustellen. Da die Spektren meist ionisierte ribosomale Proteine darstellen, bieten sie eine Darstellung der phylogenetischen Vielfalt, die in einer Probe vorhanden ist. Darüber hinaus enthält IDBac Daten im Reflectron-Modus, um spezielle Metaboliten-Fingerabdrücke als Metabolit-Assoziationsnetzwerke (MANs) anzuzeigen. MANs sind zweiteilige Netzwerke, die eine einfache Visualisierung der gemeinsamen und einzigartigen Metabolitenproduktion zwischen bakteriellen Isolaten ermöglichen. Die IDBac-Plattform ermöglicht es Forschern, sowohl Protein- als auch spezialisierte Metabolitendaten im Tandem, aber auch einzeln zu analysieren, wenn nur ein Datentyp erfasst wird. Wichtig ist, dass IDBac Rohdaten von Bruker- und Xiamen-Instrumenten sowie txt, tab, csv, mzXML und mzML verarbeitet. Dadurch entfällt die manuelle Konvertierung und Formatierung von Datensätzen und das Risiko von Benutzerfehlern oder falscher Verarbeitung von MS-Daten wird erheblich reduziert.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>60-002-65</td>
			<td>LC-MS Ultra CHROMASOLV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex Speed LEF MALDI-TOF instrument</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics Bacterial test standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0884024</td>
			<td>Bruker Daltonics 8604530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Peptide Calibration standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9846988</td>
			<td>Bruker Daltonics 8206195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>99.5+%, Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target Plate</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-500</td>
			<td>Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any is ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC293810010</td>
			<td>99.5%, for biochemistry, ACROS Organics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>28166-41-8</td>
			<td>(C2020-25G) &#8805;98% (TLC), powder</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data

Um die Beziehung zwischen bakterieller Phylogenie und spezialisierter Metabolitenproduktion von Bakterienkolonien, die auf Nährstoffagar wachsen, zu visualisieren, haben wir IDBac entwickelt – eine kostengünstige und hochdurchsatzbasierte Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisierung. Zeit-des-Flug-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) Bioinformatik-Pipeline. IDBac Software ist für Nicht-Experten entwickelt, ist frei verfügbar, und in der Lage, ein paar bis Tausende von Bakterienkolonien zu analysieren. Hier stellen wir Verfahren zur Vorbereitung von Bakterienkolonien für die MALDI-TOF MS-Analyse, MS-Instrumentenbedienung sowie Datenverarbeitung und Visualisierung in IDBac vor. Insbesondere weisen wir Anwender an, Bakterien auf Basis von Protein-MS-Fingerabdrücken in Dendrogramme zu gruppieren und interaktiv Metabolite Association Networks (MANs) aus spezialisierten Metabolitendaten zu erstellen.

Wir analysierten sechs Stämme von Micromonospora Chokoriensis und zwei Stämme von Bacillus subtilis, die zuvor charakterisiert wurden6, mit Daten zur Verfügung doI: 10.5281/zenodo.2574096. Folgende Anweisungen auf der Registerkarte Start mit Rohdaten haben wir die Option Klicken Sie hier, um Bruker-Dateien zu konvertieren, ausgewählt und den von IDBac bereitgestellten Anweisungen für jedes Dataset gefolgt (Abbildung 14).
Nachdem die automatisierteKonvertierung und die Vorverarbeitung/Spitzenschritte abgeschlossen waren, machten wir einen neuen kombinierten IDBac-Experiment, indem wir Proben aus den beiden Experimenten in ein einziges Experiment übertrugen, das sowohl Bacillus als auch Mikromonosopora-Proben (Abbildung 15). Die resultierende Analyse umfasste den Vergleich von Proteinspektren mithilfe von Spiegeldiagrammen, wie in Abbildung 16dargestellt, was für die Bewertung der Spektrenqualität und das Anpassen von Spitzenauswahleinstellungen nützlich war. Abbildung 17 zeigt einen Screenshot der Proteinclustering-Ergebnisse mit ausgewählten Standardeinstellungen. Das Dendrogramm wurde durch Anpassen des Schwellenwerts auf dem Diagramm (erscheint als gepunktete Linie) eingefärbt. Bemerkenswert ist die klare Trennung zwischen Gattungen, mit M. chokoriensis und B. subtilis isoliert Clustering getrennt.
Abbildung 18, Abbildung 19und Abbildung 20 unterstreichen die Möglichkeit, MANs von vom Benutzer ausgewählten Regionen zu generieren, indem Sie auf das Proteindendrogramm klicken und es ziehen. Damit konnten wir schnell MANs erstellen, um nur die B. subtilis Stämme zu vergleichen (Abbildung 18), nur die M. chokoriensis Stämme (Abbildung 19), und alle Stämme gleichzeitig (Abbildung 20). Die primäre Funktion dieser Netzwerke besteht darin, den Forschern einen umfassenden Überblick über den Grad der spezialisierten Metabolitenüberlappung zwischen Bakterien zu geben. Mit diesen Daten in der Hand haben die Forscher nun die Fähigkeit, fundierte Entscheidungen aus nur einer kleinen Menge an Material zu treffen, das aus einer Bakterienkolonie abgekratzt wurde.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2.jpg"> Abbildung 14: Spectra-Verarbeitung. Heruntergeladene Bruker autoFlex Spektren wurden mit IDBac konvertiert und verarbeitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2.jpg"> Abbildung 15: Kombiniertes IDBac-Experiment. Da die Spektren Micromonospora und Bacillus auf verschiedenen MALDI-Zielplatten gesammelt wurden, wurden die beiden Experimente anschließend zu einem einzigen Experiment -"Bacillus_Micromonsopora" zusammengefasst. Dies geschah im Bereich "Arbeiten mit früheren Experimenten" nach Anweisungen im Menü "Proben aus früheren Experimenten auf neue/andere Experimente übertragen". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 16" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2.jpg"> Abbildung 16: Vergleich. Mikromonspora- und Bacillus-Spektren wurden anhand der Spiegeldiagramme auf der Seite "Proteindatenanalyse" verglichen. Letztendlich wurden Standard-Spitzeneinstellungen ausgewählt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 17" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2.jpg"> Abbildung 17: Hierarchisches Clustering. Hierarchisches Clustering, mit Standardeinstellungen, korrekt gruppiert Bacillus und Micromonospora Isolate. Das Dendrogramm wurde durch "Schneiden" des Dendrogramms in beliebiger Höhe (angezeigt als gestrichelte Linie) und 100 Bootstraps, die verwendet wurden, um Vertrauen in verzweigte Zuzweigungen zu zeigen, eingefärbt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 18" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2.jpg"> Abbildung 18: MAN erstellt durch die Auswahl der Bacillus sp. Stämme aus dem Protein Dendrogramm zeigte Differentialproduktion von spezialisierten Metaboliten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 19" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2.jpg"> Abbildung 19: MAN entstand durch die Auswahl der sechs Micromonospora sp. Stämme aus dem Protein Dendrogramm zeigte differentiale Produktion von spezialisierten Metaboliten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 20" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2.jpg"> Abbildung 20: MAN von Bacillus sp. und Micromonospora sp. Stämmen, die eine differenzielle Produktion von spezialisierten Metaboliten zeigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data at JoVE.com

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

IDBac ist eine Open-Source-Pipeline für Massenspektrometrie, die Daten sowohl aus intakten Proteinen als auch aus spezialisierten Metabolitenspektren integriert, die auf Zellmaterial gesammelt werden, das aus Bakterienkolonien abgekratzt wurde. Die Pipeline ermöglicht es Forschern, schnell Hunderte bis Tausende von Bakterienkolonien in vermeintliche taxonomische Gruppen zu organisieren und sie auf der Grundlage der spezialisierten Metabolitenproduktion weiter zu differenzieren.

Verwendung der Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline zur Analyse von mikrobiellen Protein- und Spezialisierten Metabolitendaten

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

IDBac koppelt Massendaten aus Protein- und spezialisierten Metabolitenregionen unbekannter Bakterienisolate, um schnell zwischen Isolaten zu unterscheiden, die sowohl auf ihrer Identität als auch auf ihrer potenziellen Umweltfunktion basieren. Unsere Office-Source-Software erweitert den Nutzen bestehender MALDI TOF-basierter mikrobiellen Identifikationsstrategien. Diese Erweiterung umfasst die Analyse des spezialisierten Stoffwechsels als zusätzliche Möglichkeit, zwischen Kolonien mit ähnlichen Phänotypen zu unterscheiden.Eine große Herausforderung bei der Charakterisierung unbekannter Mikroorganismen besteht darin, eng verwandte Isolate zu unterscheiden. IDBac bietet Forschern eine einfache und schnelle Möglichkeit, Isolate durch Protein- und Kleinmolekülprofilierung zu charakterisieren. IDBac bietet einen visuellen Vergleich der spezialisierten Metabolitenproduktion innerhalb einer bakteriellen Probe und kann Einblicke in ein breites Spektrum von Forschungsthemen geben, von ökologischen Studien bis hin zur Entdeckung von Wirkstoffen.Es gibt viele Möglichkeiten, malDI-Daten zwischen und zwischen Instrumenten zu speichern. Wenn Sie Probleme haben, Dateien mit IDBac zu arbeiten, senden Sie ein Problem an IDBac s GitHub. Mit einem sterilen Zahnstocher einen kleinen Teil einer Bakterienkolonie an die entsprechende Stelle auf einer sauberen MALDI-Platte übertragen.Verteilen Sie die Bakterienkolonie gleichmäßig über die Stelle, so dass der Fleck so flach wie möglich erscheint. Überlagern Sie einen Mikroliter 70%massenspektrometriegrad ammic acid auf die Proben- und Matrixkontrollpunkte und lassen Sie die Säure in einer chemischen Rauchhaube trocknen. Als nächstes fügen Sie einen Mikroliter zuvor vorbereiteter MALDI-Matrixlösung zu den Proben- und Matrixmedienkontrollpunkten hinzu und lassen Sie die Luft vollständig trocknen.Nach dem Einrichten des MALDI TOF-Massenspektrometers erwerben Sie die Spektren. Speichern Sie die Proteinspektren in einem Ordner und die spezialisierten Metabolitenspektren in einem zweiten separaten Ordner. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, laden Sie die IDBac-Software herunter.Doppelklicken Sie auf die heruntergeladene install_idbac, um das Installationsprogramm zu initiieren. Doppelklicken Sie als Nächstes auf die IDBac-Desktopverknüpfung, um IDBac zu starten, das standardmäßig auf der Registerkarte Einführung geöffnet wird. Klicken Sie auf die Registerkarte Start mit Rohdaten und wählen Sie aus dem IDBac-Experimentmenü den Typ der Daten aus, die mit IDBac verwendet werden sollen.Geben Sie beim Einrichten der Konvertierung und Verarbeitung von Datendateien einen beschreibenden Namen für das Experiment ein, in dem Sie dazu aufgefordert werden, und klicken Sie auf den Rohdatenordner, und wählen Sie den entsprechenden Ordner aus. Klicken Sie dann auf Prozessdaten. Nachdem Sie die Dateien konvertiert und mit IDBac verarbeitet haben, navigieren Sie zur Seite mit früheren Experimenten und wählen Sie ein Experiment aus, mit dem Sie arbeiten möchten.Fügen Sie Informationen zu Beispielen hinzu, die sie im Menü verwenden, klicken Sie hier, um das ausgewählte Experiment zu ändern. Geben Sie Informationen in die automatisch ausgefüllte Kalkulationstabelle ein, und drücken Sie Speichern. Wenn Sie bereit sind, mit der Analyse zu beginnen, stellen Sie sicher, dass das Experiment ausgewählt ist, mit dem gearbeitet werden soll.Wählen Sie dann die Proteindatenanalyse aus. Wählen Sie auf der Seite Proteindatenanalyse die Spitzeneinstellungen aus und bewerten Sie die Proteinspektren von Proben über die angezeigten Spiegeldiagramme. Passen Sie den Prozentsatz der Replikationen an, in denen ein Spitzenwert vorhanden sein muss, damit er für die Analyse einbezogen werden kann.Wenn Sie die Spiegeldiagramme als visuelle Führung verwenden, passen Sie das Signal an die Geräuschabschaltung an, die die echantesten Spitzen beibehält, und stellen Sie fest, dass mehr Replikationen in einem höheren prozentsatzualen Spitzenanwesenheitswert die Auswahl eines niedrigeren Signals zum Rauschen-Cutoff ermöglichen. Geben Sie anschließend die untere und obere Masse an, um Cutoffs aufzuladen, die den Bereich der Massenwerte innerhalb jedes Spektrums diktieren, das für die weitere Analyse durch IDBac verwendet werden soll. Wählen Sie auf der Seite Proteindatenanalyse die Registerkarte Dendrogram aus, um Proben in ein Dendrogramm entsprechend den vom Benutzer ausgewählten Entfernungsmaßen und Clusteringalgorithmen zu gruppieren.Klicken Sie im Menü auf Samples auswählen, und folgen Sie den Anweisungen, um Beispiele auszuwählen, die in die Analyse eingeschlossen werden sollen. Nur Proben, die Proteinspektren enthalten, werden in der verfügbaren Probenbox angezeigt. Verwenden Sie die Standardwerte für die Entfernungs- und Clusteralgorithmen, und wählen Sie Intensitäten als Eingabe aus.Um Bootstrap-Werte auf dem Dendrogramm anzuzeigen, geben Sie eine Zahl zwischen zwei und 1 000 unter Bootstraps ein. Um mit der Anpassung des Dendrogramms zu beginnen, öffnen Sie das Menü "Dendrogramm" anpassen. Um die Linien des Dendrogramms zu färben, wählen Sie auf , um Linien zu ändern, und wählen Sie die gewünschten Optionen aus.Um Informationen aus der Kalkulationstabelle neben dem Dendrogramm zu zeichnen, wählen Sie die Schaltfläche Informationen zu Beispielen integrieren. Dadurch wird ein Bereich geöffnet, in dem sich eine Kategorie basierend auf den eingegebenen Werten selbst auffüllt. Um Beispiele aus einem anderen Experiment einzufügen, wählen Sie die Menüschaltfläche Samples aus einem anderen Experiment ein und folgen Sie den Anweisungen im neu geöffneten Bereich.Fahren Sie zur Seite der kleinen Moleküldatenanalyse fort, um die Datenvisualisierung durch Prinzipkomponentenanalyse und metabolische Assoziationsnetzwerke zu ermöglichen, die zweiseitige Netzwerke verwenden, um die Korrelation der kleinen Molekülmasse anzuzeigen, um Werte mit Proben aufzuladen. Klicken und ziehen Sie auf das Dendrogramm, um ausgewählte, zu analysierende Beispiele hervorzuheben. Wenn keine Proben hervorgehoben oder kein Proteindendrogramm erstellt wurde, wird ein Metabolitenzuordnungsnetzwerk aus einer zufälligen Teilmenge bzw. allen Proben angezeigt.Um ein Matrixmedium-Leerfeld im Metabolitenzuordnungsnetzwerk zu subtrahieren, öffnen Sie das Menü, wählen Sie ein Zuziehen des Samples aus, und wählen Sie das entsprechende Beispiel aus, das als Leerzeichen verwendet werden soll. Öffnen Sie das Menü MAN-Einstellungen anzeigen/ausblenden, um die gewünschten Werte für einen Prozentsatz der Spitzenpräsenz auszuwählen und zu replizieren, auf Rauschen zu signalisieren und die oberen und unteren Massenabschaltungen. Verwenden Sie die kleinen Molekülspiegeldiagramme, um die Auswahl dieser Einstellungen zu steuern.Kopieren Sie den Text im Abschnitt "Vorschläge für die Meldung von MAN-Analysen", um die benutzerdefinierten Einstellungen bereitzustellen, die zum Generieren eines erstellten metabolischen Assoziationsnetzwerks verwendet werden. Sechs Stämme von Micromonospora Chokoriensis und zwei Flecken von Bacillus subtilis wurden mit Daten in der IDBac Software analysiert. Folgende Anweisungen in der Registerkarte "Anfangs mit Rohdaten" wurde die Option zum Konvertieren von Bruker-Dateien ausgewählt und die idBac bereitgestellten Anweisungen für jeden Datensatz befolgt.Zu den automatisierten Konvertierungs- und Vorverarbeitungsspitzenschritten wurde ein kombiniertes IDBac-Experiment erstellt, indem Bacillus- und Micromonospora-Proben aus den beiden Experimenten in ein einziges Experiment übertragen wurden. Die resultierende Analyse umfasste den Vergleich von Proteinspektren mithilfe von Spiegeldiagrammen, die für die Bewertung der Spektrenqualität und die Anpassung von Spitzenwerten nützlich waren. Ein Screenshot der Proteinclustering-Ergebnisse mit den ausgewählten Standardeinstellungen wird hier gezeigt.Das Dendrogramm wurde durch Anpassen des Schwellenwerts auf dem Diagramm eingefärbt. Bemerkenswert ist die klare Trennung zwischen Gattungen mit M.chokoriensis und B.subtilis Isolate Clustering getrennt. Durch Anklicken und Ziehen über das Protein Dendrogramm, es war möglich, schnell metabolische Assoziationsnetzwerke zu erstellen, um nur die B.subtilis Stämme zu vergleichen, nur die M.chokoriensis Stämme, und alle Stämme gleichzeitig.Die primäre Funktion dieser Netzwerke besteht darin, den Forschern einen umfassenden Überblick über den Grad der spezialisierten Metabolitenüberlappung zwischen Bakterien zu geben. Wenn Sie mit neuen Daten arbeiten, verwenden Sie die Spiegeldiagramme von IDBac, um sicherzustellen, dass Ihre Daten sinnvoll sind und Spektren qualitativ hochwertig sind. Bewerten Sie Ihr experimentelles Design und Ihre Ergebnisse bei jedem Schritt kritisch.IDBac ermöglicht es Forschern, kleine und vielfältige Bibliotheken von Mikroorganismen für weitere Untersuchungen zu bauen. Dies reduziert die Kosten für traditionell große und redundante mikrobielle Bibliotheken erheblich. Da IDBac es Ihnen ermöglicht, spezialisierte Metabolitenüberlappungen innerhalb sehr ähnlicher phylogenetischer Gruppen zu visualisieren, kann es verwendet werden, um Forschungsfragen und Hypothesen zu generieren, die zwei typischerweise getrennte Felder verknüpfen.Ameisensäure ist ätzend und sollte in einer chemischen Rauchhaube behandelt werden. Einige Umweltisolate können potenzielle Gesundheitsgefahren darstellen, und alle Stämme sollten als Biosicherheitsstufe zwei behandelt werden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN1- und TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Forschung

Biochemie

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Beurteilung der Lebensfähigkeit eines synthetischen bakterielle Konsortiums auf der In-vitro- Darm Host-Mikrobe Oberfläche

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlesen und DNA-Reparatur-Assay mit Einzel-Nukleotid-Erweiterung und MALDI-TOF Massenspektrometrie-Analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrierung-kostenlose In-vitro- Quantifizierung von Protein Homo-Oligomerisierung mit kommerziellen Instrumentierung und kostenlose Open Source-Helligkeit-Analyse-Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Eine Probenvorbereitungspipeline für Mikrokristalle an der VMXm-Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Präzise und genaue Einzelmolekül-FRET-Messungen mit der Open-Source-smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Shotgun Proteomics Probenverarbeitung automatisiert durch einen Open-Source-Laborroboter

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Einzelpartikel-Kryo-EM-Datenerfassung mit Stage Tilt unter Verwendung von Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...