Name: using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data
Uploaded: 2019-05-15T13:00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data at JoVE.com

עבודה זו היתה נתמכת על ידי המכון הלאומי של מדעי הרפואה הכללית גרנט R01 GM125943, נשיונל ג'יאוגרפיק CP-044R-17; מלגת קרן המחקר האיסלנדי 152336-051; ואוניברסיטת אילינוי. בקרנות האתחול של שיקגו כמו כן, אנו מודים לתורמים הבאים: ד ר אמנדה בולמן לקבלת סיוע בפרמטרים לרכישת חלבונים באמצעות מלנדי-תוף MS; ד ר טרי מור וד ר מריה ג'יין עבור התקן אלפא-cyano-4-hydroxycinnamic חומצה מטריקס (CHCA).

<ol>
	<li>Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+TOF+MS+profiling+of+bacteria+at+the+strain+level:+A+review.">MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review.</a> Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).</li><li>Cain, T. C., Lubman, D. M., Weber, W. J., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+bacteria+using+protein+profiles+from+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Differentiation of bacteria using protein profiles from matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8 (12), 1026-1030 (1994).</li><li>Holland, R. D., Wilkes, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+intact+whole+bacteria+based+on+spectral+patterns+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+with+time-of-flight+mass+spectrometry.">Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 10 (10), 1227-1232 (1996).</li><li>Rahi, P., Prakash, O., Shouche, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass-spectrometry+(MALDI-TOF+MS)+based+microbial+identifications:+challenges+and+scopes+for+microbial+ecologists.">Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass-spectrometry (MALDI-TOF MS) based microbial identifications: challenges and scopes for microbial ecologists.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1359 (2016).</li><li>Silva, R., Lopes, N. P., Silva, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+MALDI+mass+spectrometry+in+natural+products+analysis.">Application of MALDI mass spectrometry in natural products analysis.</a> Planta Medica. 82, 671-689 (2016).</li><li>Clark, C. M., Costa, M. S., Sanchez, L. M., Murphy, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+MALDI-TOF+mass+spectrometry+protein+and+specialized+metabolite+analyses+to+rapidly+discriminate+bacterial+function.">Coupling MALDI-TOF mass spectrometry protein and specialized metabolite analyses to rapidly discriminate bacterial function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4981-4986 (2018).</li><li>Freiwald, A., Sauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+classification+and+identification+of+bacteria+by+mass+spectrometry.">Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 4 (5), 732-742 (2009).</li><li>Schulthess, B., Bloemberg, G. V., Zbinden, R., B&#246;ttger, E. C., Hombach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Bruker+MALDI+Biotyper+for+identification+of+Gram-positive+rods:+development+of+a+diagnostic+algorithm+for+the+clinical+laboratory.">Evaluation of the Bruker MALDI Biotyper for identification of Gram-positive rods: development of a diagnostic algorithm for the clinical laboratory.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1089-1097 (2014).</li><li>Schumann, P., Maier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+mass+spectrometry+applied+to+classification+and+identification+of+bacteria.">MALDI-TOF mass spectrometry applied to classification and identification of bacteria.</a> Methods in Microbiology. 41, 275-306 (2014).</li><li>Chambers, M. C., Maclean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics.">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534 (2008).</li><li>Martens, L., Chambers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mzML-a+community+standard+for+mass+spectrometry+data.">mzML-a community standard for mass spectrometry data.</a> Molecular &#38; Cellular Proteomics. 10 (1), (2011).</li></ol>

. למחברים אין מה לגלות

פרוטוקול IDBac פרטים חלבון חיידקי והתמחה מטבוליזם נתונים רכישה וניתוח של עד 384 חיידקי בודד 4 h על ידי חוקר אחד. עם idbac אין צורך לחלץ DNA מבודד בקטריאלי או ליצור תמציות מטבוליט מיוחדות מתוך התסיסה נוזלי ולנתח אותם באמצעות שיטות כרומטוגרפי. במקום זאת, חלבונים ונתונים מטבוליזם מיוחדים נאספים על ידי הפצת חומר פשוט ממושבות חיידקי ישירות על צלחת היעד MALDI. זה מפחית במידה ניכרת את הזמן ואת העלות הקשורים טכניקות חלופיות כגון רצף הגנים של 16 rRNA ו LCMS9.
חשוב להוסיף כתמים של מטריצה ריקה וכיול ללוח MALDI, ואנו ממליצים להשתמש במספר מתאים של שכפול כדי להבטיח שימוש בלתי מוצפן ובטחון סטטיסטי. מספרי השכפל יהיו תלויי-ניסוי. לדוגמה, אם משתמש מתכוון להבדיל בין אלפי מושבות מאוסף של לוחות גיוון סביבתי, ייתכן שיהיה צורך בפחות משכפל (המעבדה שלנו אוספת שלושה משכפל טכני לכל מושבה). לחילופין, אם משתמש מבקש ליצור מסד נתונים מותאם אישית של זנים מתוך מטקבקטריאלי ספציפיים כדי לקבוע במהירות סיווגים תת מיני של מבודד לא ידוע, אז משכפל יותר מתאים (המעבדה שלנו אוספת שמונה משכפל ביולוגי לכל מתח).
IDBac הוא כלי להבדיל במהירות מאוד הקשורים בקטריאלי בהתבסס על מידע מטקמיים וייצור מטבוליזם המקצועית. זה יכול להשלים או לשמש כמבשר לשיטות אורתוגונאליות כגון ניתוחים גנטיים מעמיק, מחקרים הכרוכים בייצור מטבוליזם ותפקוד, או אפיון של מבנה מטבוליט מיוחדים על ידי ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית ו/או LC-MS/MS.
ייצור מטבוליזם המקצועית (IDBac מאנס) הוא פגיע מאוד לתנאי גידול חיידקי, במיוחד באמצעות מדיה שונים, אשר היא מגבלה פוטנציאלית של השיטה. עם זאת תכונות אלה ניתן לנצל על ידי המשתמש, כמו IDBac יכול בקלות ליצור מאמינים מראה את ההבדלים בייצור מטבוליזם המקצועית תחת מגוון רחב של תנאי גדילה. חשוב לציין כי בעוד טביעות אצבעות מיוחדים מטבוליזם עשוי להשתנות בתנאי הצמיחה, הצגנו בעבר כי טביעות אצבע של חלבונים נשארים יציבים יחסית על פני משתנים אלה (ראה קלארק ואח '6). כאשר מתעסקים עם לוחות מגוון סביבתי, אנו ממליצים לטהר מבודד חיידקי לפני ניתוח כדי להפחית את התרומות האפשריות מפני שכנים בקטריות שכנות.
לבסוף, חוסר במאגר המידע הציבורי הניתן לחיפוש של טביעות אצבעות של חלבון MS הוא קיצור מרכזי המגיע השימוש בשיטה זו כדי לסווג חיידקים סביבתיים לא ידועים. יצרנו idbac עם זה בראש, וכללה המרה אוטומטית של נתונים לתוך פורמט מקובל הקהילה קוד פתוח (mzml)10,11,12 ועיצב את התוכנה כדי לאפשר חיפוש, שיתוף, ויצירה של מסדי נתונים מותאמים אישית. אנחנו בתהליך של יצירת מסד נתונים ציבורי גדול (> 10000 מאופיין במלואו), אשר יאפשר סיווג של כמה בודד לרמת המינים, כולל קישורים למספרי ההצטרפות של GenBank כאשר הם זמינים.
IDBac הוא מקור פתוח והקוד זמין עבור כל אחד כדי להתאים אישית את הצרכים שלהם ניתוח נתונים והדמיה. אנו ממליצים למשתמשים להתייעץ עם גוף ספרות נרחב (זאואר ואח '7, סילבה et al.5) כדי לסייע בתמיכה ובעיצוב המטרות הנסיוניות שלהם. אנו מארחים פורום לדיון ב: https://groups.google.com/forum/#!forum/idbac ואמצעים כדי לדווח על בעיות עם התוכנה ב: https://github.com/chasemc/IDBacApp/issues.

מחסום מרכזי לחוקרים הלומדים פונקציה חיידקית היא היכולת להעריך במהירות ובו בו את הזהות הטקקיות של מיקרואורגניזם ויכולתו לייצר מטבוליטים מיוחדים. זה מנע התקדמות משמעותית בהבנת הקשר בין הקימוט החיידקי וייצור מטבוליזם מיוחדים ברוב החיידקים מבודדים מהסביבה. למרות שיטות מבוססות MS המשתמשות בטביעות אצבע של חלבונים לקבוצה וזיהוי חיידקים מתוארים היטב1,2,3,4, מחקרים אלה בדרך כלל בוצעו על קבוצות קטנות של בודד, באופן ספציפי למין. חשוב מכך, מידע על ייצור מטבוליזם מיוחדים, הנהג העיקרי של תפקוד חיידקים בסביבה, נשאר משולב במחקרים אלה. סילבה ואח '5 לאחרונה סיפקה היסטוריה מקיפה המפרט את השימוש התחתון של MALDI-תוף MS לנתח מטבוליטים מיוחדים ומחסור של תוכנה כדי להקל על צווארי בקבוק הנוכחי בביואינפורמטיקה. על מנת לטפל בחסרונות אלה, יצרנו IDBac, צינור ביואינפורמטיקה המשלב הן ליניארי ו הרפלקסים של מצבי MALDI-תוף MS6. זה מאפשר למשתמשים להמחיש במהירות ולהבדיל חיידקי בודד מבוסס על החלבון הן מטבוליזם וטביעות אצבעות MS מיוחדים, בהתאמה.
IDBac הוא חסכוני, תפוקה גבוהה, ומיועד המשתמש שכבה. היא זמינה באופן חופשי (chasemc.github.io/IDBac), ומחייבת גישה לספקטרומטר מסה של MALDI-תוף (במצב של הרפלקסים הדרושים לניתוח מטבוליזם). הכנה לדוגמא מסתמכת על השיטה הפשוטה "המורחבת ישירה" שיטה7,8 ונתונים נאספים עם ברציפות ליניארי ו-הרפלקסים של רכישות במקום יחיד maldi-יעד. עם IDBac, אפשר לנתח את הקימוט הפוטוטיבית וייצור מטבוליזם מיוחדות של מאות מושבות בפחות מארבע שעות, כולל הכנה לדוגמא, רכישת נתונים, ויזואליזציה של נתונים. זה מציג זמן משמעותי ויתרון עלות על שיטות מסורתיות של זיהוי חיידקים (כגון רצף גנים), וניתוח פלט מטבולית (כרומטוגרפיה נוזלית המסה ספקטרומטריה [LCMS] ושיטות כרומוגרפיות דומות).
באמצעות נתונים שהושגו בניתוח מצב ליניארי, IDBac משתמש באשכולות הירארכיים כדי לייצג את המצב החדש של ספקטרום החלבונים. כיוון שהספקטרום מייצג בעיקר חלבונים ריבוזומניים, הם מספקים ייצוג של הגיוון הפילוגנטי הקיים במדגם. בנוסף, IDBac משלבת רפלקסים במצב נתונים כדי להציג טביעות אצבעות מיוחדות לייט מטבוליזם כמו רשתות האגודה מטבוליט (מאנס). מאמינים הם רשתות דו-צדדי המאפשרים הדמיה קלה של ייצור המטמיטבוליט משותף ייחודי בין בודד בקטריאלי. הפלטפורמה IDBac מאפשר לחוקרים לנתח הן חלבונים ונתוני מטבוליזם מיוחדים בטנדם, אבל גם בנפרד, אם רק אחד מסוג הנתונים הוא רכשה. חשוב מכך, IDBac מעבד נתונים גולמיים מ Bruker ו ש'יאמן מכשירים, כמו גם txt, tab, csv, mzXML, ו Mzxml. פעולה זו מבטלת את הצורך בהמרה ידנית ובעיצוב של ערכות נתונים, ומפחיתה באופן משמעותי את הסיכון של שגיאת משתמש או משנה של נתוני MS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>60-002-65</td>
			<td>LC-MS Ultra CHROMASOLV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex Speed LEF MALDI-TOF instrument</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics Bacterial test standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0884024</td>
			<td>Bruker Daltonics 8604530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Peptide Calibration standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9846988</td>
			<td>Bruker Daltonics 8206195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>99.5+%, Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target Plate</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-500</td>
			<td>Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any is ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC293810010</td>
			<td>99.5%, for biochemistry, ACROS Organics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>28166-41-8</td>
			<td>(C2020-25G) &#8805;98% (TLC), powder</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data

על מנת להמחיש את היחסים בין בקטריאלי תולדות והפקה מטבוליזם המקצועית של מושבות חיידקי גדל על מזינים אגר, פיתחנו idbac-בעלות נמוכה ותפוקה גבוהה באמצעות מטריצה לייזר בסיוע בלייזר/יינון ביומוטמטריה (MALDI-תוף MS)-הצינור הגדול של הטיסה. תוכנת IDBac מיועד שאינם מומחים, הוא זמין באופן חופשי, ומסוגל לנתח כמה אלפי מושבות חיידקי. כאן, אנו מציגים הליכים להכנת מושבות חיידקי לניתוח MS MALDI-תוף, הפעלת כלי MS, עיבוד נתונים והדמיה ב-IDBac. בפרט, אנו מורים למשתמשים כיצד לאשכול חיידקים לתוך העצים בהתבסס על טביעות אצבעות חלבון MS ו אינטראקטיבי ליצור רשתות האגודה מטבולייט (מאנס) מתוך נתונים מיוחדים מטבוליזם.

ניתחנו שישה זנים של מיקרוונונוספורסיה ושני זנים של באקלוס subtilis, אשר היו מאופיינים בעבר6, באמצעות נתונים זמינים בדוי: 10.5281/zenodo. 2574096. להלן ההנחיות בכרטיסיה ' התחלה עם נתוני Raw ', בחרנו באפשרות לחץ כאן כדי להמיר קבצי bruker ובעקבות ההנחיות שסופקו על-ידי idbac עבור כל ערכת נתונים (איור 14).
לאחר ההמרה אוטומטי מראש/השיא השלבים הסתיימו, התקדמנו ליצור ניסוי IDBac משולב חדש על ידי העברת דגימות משני ניסויים לתוך ניסוי אחד המכיל את מקרתגו וגם דגימות מיקרומטר (איור 15). הניתוח שהתקבל מעורב בהשוואת ספקטרום החלבון באמצעות חלקות מראה, כתמונה באיור 16, שהיה שימושי להערכת איכות הספקטרום והתאמת הגדרות איסוף השיא. איור 17 מציג צילום מסך של תוצאות באשכולות החלבון עם הגדרות ברירת המחדל שנבחרו. הגודגרמה הייתה צבועה על ידי התאמת הסף לעלילה (מופיע כקו מנוקד). של הערה היא ההפרדה הבהירה בין genera, עם שתי הצ מבודדת ו B. subtilis מבודד אשכולות בנפרד.
איור 18, איור 19, ואיור 20 הדגש את היכולת ליצור מאמינים של אזורים שנבחרו על ידי המשתמש על-ידי לחיצה וגרירה על-פני עץ החלבון. עם זאת היינו מסוגלים במהירות ליצור מאמינים כדי להשוות רק את הזנים B. subtilis (איור 18), רק M. הצ זנים (איור19), ואת כל הזנים בו זמנית (איור 20). התפקיד העיקרי של רשתות אלה היא לספק לחוקרים סקירה רחבה של מידת החפיפה המקצועית מטבוליזם בין חיידקים. עם נתונים אלה בהישג יד, החוקרים יש כעת את היכולת לקבל החלטות מושכלות מכמות קטנה בלבד של חומר מגורד מתוך מושבה חיידקית.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2.jpg"> איור 14: העיבוד של ספקטרה. ספקטרום ברוקר autoFlex שהורד הומרו ועובדו באמצעות IDBac. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2.jpg"> איור 15: ניסוי IDBac משולב. מכיוון שהמיקרוונוספורט ובאקלוס ספקטרום נאספו בלוחות מטרה שונים, שני הניסויים המשולבים לאחר מכן בניסוי יחיד-"Bacillus_Micromonsopora". זה נעשה בתוך הכרטיסייה "עבודה עם ניסויים קודמים", בעקבות ההנחיות בתוך התפריט "דגימות העברה מניסויים קודמים לניסויים חדשים/אחרים". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 16" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2.jpg"> איור 16: השוואה. מיקרואוספורא ובאקלוס ספקטרום הושוו באמצעות מחלקות המראה בתוך דף "ניתוח נתוני חלבון". בסופו של דבר, הגדרות השיא המוגדר כברירת מחדל נבחרו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 17" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2.jpg"> איור 17: קיבוץ באשכולות הירארכי. קיבוץ באשכולות הירארכי, שימוש בהגדרות ברירת המחדל, מקובצים באופן תקין באמצעות מיקרולוס ומיקרומטר. הגוגיגרמה הייתה צבועה על ידי "חיתוך" הגודגרמה בגובה שרירותי (מוצג כקו מקווקו) ו-100 האתחול השתמשו כדי להראות ביטחון בהסתעפות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 18" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2.jpg"> איור 18: האדם נוצר על ידי בחירת הזנים של מקרתגו sp. מן החלבונים החלבון הראו הפקה דיפרנציאלית של מטבוליטים מיוחדים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 19" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2.jpg"> איור 19: האדם נוצר על ידי בחירת ששת מיקרומטר sp. זנים מן החלבונים החלבון הראו הייצור הדיפרנציאלי של מטבוליטים מיוחדים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 20" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2.jpg"> איור 20: האיש של באקלוס sp. ו מיקרוונוספורמטר sp. זנים המציגים ייצור דיפרנציאלי של מטבוליטים מיוחדים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data at JoVE.com

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

IDBac הוא מקור פתוח המסה ספקטרומוטוריקה מבוססי צינור ביואינפורמטיקה המשלבת נתונים מחלבונים שלמים, ספקטרום מטבוליזם מיוחדים, שנאסף על החומר הנייד מגורד ממושבות חיידקי. צינור מאפשר לחוקרים לארגן במהירות מאות אלפי מושבות חיידקי לתוך קבוצות מטקמיים ועוד להבדיל אותם מבוסס על ייצור מטבוליזם המקצועית.

באמצעות מקור פתוח MALDI תוף-MS IDBac הניתוח של חלבון מיקרוביאלית ונתונים מיוחדים מטבוליט

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

IDBac זוגות נתוני מפרט מסה מחלבון ואזורי מטבוליט מיוחדים של מבודדים חיידקיים לא ידועים כדי להפלות במהירות בין מבודדים המבוססים הן על זהותם והן על תפקודם הסביבתי הפוטנציאלי. תוכנת המקור המשרדית שלנו מרחיבה את התועלת של אסטרטגיות זיהוי מיקרוביאליות מבוססות MALDI TOF קיימות. הרחבה זו כוללת ניתוח של חילוף חומרים מיוחד כדרך נוספת להבדיל בין מושבות עם פנוטיפים דומים.אתגר מרכזי באפיון מיקרואורגניזמים לא ידועים הוא להבחין בין מבודדים קרובים. IDBac מספק לחוקרים דרך קלה ומהירה לאפיין מבודדים באמצעות פרופיל חלבון ומולקולות קטנות. IDBac מספק השוואה חזותית של ייצור מטבוליט מיוחד בתוך מדגם חיידקי והוא יכול לספק תובנה לתוך מגוון רחב של נושאי מחקר ממחקרים אקולוגיים לגילוי עופרת סמים.ישנן דרכים רבות שבהן ניתן לשמור נתוני MALDI בין ובין מכשירים. אם אתה מתקשה לגרום לקבצים לעבוד עם IDBac, שלח בעיה ל- GitHub של IDBac. באמצעות קיסם סטרילי, להעביר חלק קטן של מושבה חיידקית למקום המתאים על צלחת MALDI נקי.פזרו את מושבת החיידקים באופן שווה על פני הנקודה כך שהנקודה תופיע שטוחה ככל האפשר. שכבת-על מיקרוליטר אחד של 70% חומצה פורמטית ברמת ספקטרומטריית מסה על נקודות הבקרה של הדגימה והמטריצה ומאפשרת לחומצה להתייבש במכסה המנוע של האדים הכימיים. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של פתרון מטריצת MALDI שהוכן בעבר לנקודות בקרת המדיה לדוגמה ולמטריצה ולאפשר אוויר יבש לחלוטין.לאחר הגדרת ספקטרומטר המסה MALDI TOF, לרכוש את הספקטרום. שמור את ספקטרום החלבון בתיקיה אחת ואת ספקטרום המטבוליט המיוחד בתיקיה נפרדת שנייה. כדי להתחיל בהליך זה, הורד את תוכנת IDBac.לחץ פעמיים על הלחצן install_idbac כדי ליזום את תוכנית ההתקנה. לאחר מכן לחץ פעמיים על קיצור הדרך לשולחן העבודה IDBac כדי להפעיל את IDBac שייפתח בכרטיסיה מבוא כברירת מחדל. לחץ על הכרטיסיה התחל עם נתונים גולמיים ובחר מתוך תפריט הניסוי יצירת IDBac סוג הנתונים שישמש עם IDBac.בעת הגדרת ההמרה והעיבוד של קבצי נתונים, הזן שם תיאורי עבור הניסוי שבו התבקש ולחץ על תיקיית נתונים גולמיים ובחר את התיקיה המתאימה. לאחר מכן לחץ על נתוני תהליך. לאחר המרת הקבצים ועיבודם באמצעות IDBac, נווט אל העבודה עם דף הניסויים הקודמים ובחר ניסוי לעבוד איתו.הוסף מידע אודות דוגמאות באמצעות התפריט לחץ כאן כדי לשנות את הניסוי שנבחר. הזן מידע לתוך הגיליון האלקטרוני עם תפוקה אוטומטית והקש שמור. כאשר מוכן להתחיל את הניתוח, ודא שהניסוי לעבוד איתו נבחר.לאחר מכן בחרו ניתוח נתוני חלבון. בדף ניתוח נתוני החלבון, בחר את שיא הגדרות השיא והערך את ספקטרום החלבון של דגימות באמצעות חלקות המראה המוצגות. התאם את אחוז השכפולים שבהם יש להציג שיא כדי שהוא ייכלל לניתוח.באמצעות חלקות המראה כהדרכה חזותית, התאם את האות לניתוק רעשים השומר על הפסגות המקוריות ביותר והרעש הנמוך ביותר המעיד על כך שיותר שכפולים בערך נוכחות גבוה יותר של אחוז שיא יאפשרו בחירה של אות נמוך יותר לניתוק רעשים. לאחר מכן, ציין את המסה התחתונה והעליונה לטעינה של חתכים המכתיבים את טווח ערכי המסה בתוך כל ספקטרום שישמש לניתוח נוסף על-ידי IDBac. בתוך דף ניתוח נתוני החלבון, בחר את הכרטיסייה Dendrogram כדי לאפשר קיבוץ דגימות לדנדרוגרמה בהתאם למידות המרחק שנבחרו על-ידי המשתמש ואלגוריתמי הקיבוץ באשכולות.לחץ על בחר דוגמאות בתפריט ובצע את ההוראות כדי לבחור דוגמאות שייכללו בניתוח. רק דגימות המכילות ספקטרום חלבונים יוצגו בתוך תיבת הדגימות הזמינה. השתמש בערכי ברירת המחדל עבור אלגוריתמי המרחק והקיבוץ באשכולות ובחר את התעצמויות כקלט.כדי להציג ערכי אתחול בדנדרוגרמה, הזן מספר בין שתיים ל- 1,000 תחת אתחול. כדי להתחיל בהתאמה אישית של הנדרוגרמה, פתחו את תפריט התאם את הדנדרוגרם. לצביעת הקווים של הנדרוגרמה, בחרו לחצו לשינוי קווים ובחרו באפשרויות הרצויות.כדי להתוות מידע מהגיליון האלקטרוני לצד ה- dendrogram, בחר בלחצן לשלב מידע אודות דוגמאות. פעולה זו תפתח חלונית שבה קטגוריה תאכלס את עצמה בהתבסס על הערכים שהוזנו. להוספת דגימות מניסוי אחר, בחרו בלחצן התפריט להוסיף דגימות מניסוי אחר ועקבו אחר ההוראות בחלונית החדשה שנפתחה.המשך לדף ניתוח הנתונים של מולקולות קטנות כדי לאפשר תצוגה חזותית של נתונים על-ידי ניתוח רכיבים עקרוניים ורשתות שיוך מטבוליות שמשתמשות ברשתות דו-מפלגתיות כדי להציג את המתאם של מסת מולקולה קטנה כדי לטעון ערכים עם דגימות. לחץ וגרור על הדנדרוגרמה כדי לסמן דוגמאות נבחרות של עניין שיש לנתח. אם לא הודגשו דגימות או שלא נוצרה דנדרוגרמת חלבונים, תופיע רשת שיוך מטבוליטים של תת-קבוצה אקראית או של כל הדגימות בהתאמה.כדי להחסיר מדיית מטריצה ריקה ברשת שיוך המטבוליטים, פתח את התפריט בחר דוגמה לחסר ובחר את הדוגמה המתאימה לשימוש כריק. פתח את התפריט הצג/הסתר הגדרות MAN כדי לבחור את הערכים הרצויים עבור אחוז מנוכחות שיא ולשכפל, אות לרעש וחיתוך מסה עליון ותחתון. השתמש בחלקות מראה של מולקולה קטנה כדי להנחות את הבחירה של הגדרות אלה.לקבלת תוצאות דיווח, העתק את הטקסט בתוך ההצעות לדיווח על פיסקת ניתוח MAN כדי לספק את ההגדרות המוגדרות על-ידי המשתמש המשמשות ליצירת רשת שיוך מטבולית שנוצרה. שישה זנים של מיקרומונוספורה chokoriensis ושני כתמים של Bacillus subtilis נותחו באמצעות נתונים בתוכנת IDBac. בעקבות הוראות התחלה עם כרטיסיית נתונים גולמיים, האפשרות לחץ כאן כדי להמיר קבצי Bruker נבחרה IDBac סיפק הוראות עבור כל ערכת נתונים.לשלבי שיא ההמרה האוטומטיים והעיבוד מראש, נוצר ניסוי IDBac משולב על ידי העברת דגימות Bacillus ומיקרומונוספורה משני הניסויים לניסוי יחיד. הניתוח שנוצר כלל השוואת ספקטרום חלבון באמצעות חלקות מראה שהיה שימושי להערכת איכות ספקטרום והתאמת הגדרות שיא שיא. צילום מסך של תוצאות אשכולות החלבון עם הגדרות ברירת המחדל שנבחרו מוצג כאן.הדנדרוגרם נצבע על ידי התאמת הסף על העלילה. ראוי לציין כי ההפרדה הברורה בין סוגים עם M.chokoriensis ו B.subtilis מבודד קיבוץ בנפרד. על ידי לחיצה וגרירה על פני דנדרוגרמת החלבון, ניתן היה ליצור במהירות רשתות שיוך מטבוליות כדי להשוות רק את זני B.subtilis, רק את זני M.chokoriensis, ואת כל הזנים בו זמנית.הפונקציה העיקרית של רשתות אלה היא לספק לחוקרים סקירה רחבה של מידת החפיפה מטבוליט מיוחד בין חיידקים. בעת עבודה עם נתונים חדשים, השתמש בהתוויות המראה של IDBac כדי להבטיח שהנתונים שלך הגיוניים והספקטרום באיכות גבוהה. הערך באופן קריטי את העיצוב והתוצאות הניסיוניים שלך בכל שלב.IDBac מאפשר לחוקרים לבנות ספריות קטנות ומגוונות של מיקרואורגניזמים להמשך חקירה. פעולה זו מפחיתה מאוד את העלויות הקשורות לספריות מיקרוביות גדולות ומיותרות באופן מסורתי. מכיוון IDBac מאפשר לך לדמיין חפיפה מטבוליט מיוחדים בתוך קבוצות פילוגנטיות דומות מאוד, זה יכול לשמש כדי ליצור שאלות מחקר השערות המקשרות שני שדות מנותקים בדרך כלל.חומצה פורמית היא קאוסטית ויש לטפל בה ברדס אדים כימיים. מבודדים סביבתיים מסוימים עלולים להוות סכנות בריאותיות פוטנציאליות ויש להתייחס לכל הזנים כאל רמה ביו-בטיחותית 2.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

הערכת הכדאיות של קונסורציום חיידקי סינתטי על הממשק מארח-חיידק במעיים במבחנה

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

הגהה ואת וזמינותו תיקון ה-DNA באמצעות ניתוח ספקטרומטר מסה MALDI-TOF והסיומת נוקלאוטיד יחיד

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

צינור הכנה לדוגמה עבור מיקרוקריסטלים בקו הקרן VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

ביצוע מדידות FRET מדויקות ומדויקות באמצעות smfBox קוד פתוח

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

רובה ציד Proteomics עיבוד מדגם אוטומטי על ידי רובוט מעבדה קוד פתוח

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

איסוף נתוני Cryo-EM של חלקיק יחיד עם הטיית במה באמצעות Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...