Name: using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data
Uploaded: 2019-05-15T13:00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of General Medical Sciences Grant R01 GM125943, National Geographic Grant CP-044R-17; Fondo di ricerca islandese sovvenzione 152336-051; e l'Università dell'Illinois presso i fondi per le startup di Chicago. Inoltre, ringraziamo i seguenti collaboratori: Dr. Amanda Bulman per l'assistenza con i parametri di acquisizione delle proteine MALDI-TOF MS; Dr. Terry Moore e Dr. Atul Jain per ricrystallizzare la matrice di acido alfa-ciano-4-idrossicininnamiche (CHCA).

<ol>
	<li>Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+TOF+MS+profiling+of+bacteria+at+the+strain+level:+A+review.">MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review.</a> Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).</li><li>Cain, T. C., Lubman, D. M., Weber, W. J., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+bacteria+using+protein+profiles+from+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Differentiation of bacteria using protein profiles from matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8 (12), 1026-1030 (1994).</li><li>Holland, R. D., Wilkes, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+intact+whole+bacteria+based+on+spectral+patterns+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+with+time-of-flight+mass+spectrometry.">Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 10 (10), 1227-1232 (1996).</li><li>Rahi, P., Prakash, O., Shouche, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass-spectrometry+(MALDI-TOF+MS)+based+microbial+identifications:+challenges+and+scopes+for+microbial+ecologists.">Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass-spectrometry (MALDI-TOF MS) based microbial identifications: challenges and scopes for microbial ecologists.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1359 (2016).</li><li>Silva, R., Lopes, N. P., Silva, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+MALDI+mass+spectrometry+in+natural+products+analysis.">Application of MALDI mass spectrometry in natural products analysis.</a> Planta Medica. 82, 671-689 (2016).</li><li>Clark, C. M., Costa, M. S., Sanchez, L. M., Murphy, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+MALDI-TOF+mass+spectrometry+protein+and+specialized+metabolite+analyses+to+rapidly+discriminate+bacterial+function.">Coupling MALDI-TOF mass spectrometry protein and specialized metabolite analyses to rapidly discriminate bacterial function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4981-4986 (2018).</li><li>Freiwald, A., Sauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+classification+and+identification+of+bacteria+by+mass+spectrometry.">Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 4 (5), 732-742 (2009).</li><li>Schulthess, B., Bloemberg, G. V., Zbinden, R., B&#246;ttger, E. C., Hombach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Bruker+MALDI+Biotyper+for+identification+of+Gram-positive+rods:+development+of+a+diagnostic+algorithm+for+the+clinical+laboratory.">Evaluation of the Bruker MALDI Biotyper for identification of Gram-positive rods: development of a diagnostic algorithm for the clinical laboratory.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1089-1097 (2014).</li><li>Schumann, P., Maier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+mass+spectrometry+applied+to+classification+and+identification+of+bacteria.">MALDI-TOF mass spectrometry applied to classification and identification of bacteria.</a> Methods in Microbiology. 41, 275-306 (2014).</li><li>Chambers, M. C., Maclean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics.">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534 (2008).</li><li>Martens, L., Chambers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mzML-a+community+standard+for+mass+spectrometry+data.">mzML-a community standard for mass spectrometry data.</a> Molecular &#38; Cellular Proteomics. 10 (1), (2011).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo IDBac descrive la proteina batterica e l'acquisizione e l'analisi di dati sui metaboliti specializzati fino a 384 isolati batterici in 4 h da un singolo ricercatore. Con IDBac non è necessario estrarre il DNA dagli isolati batterici o generare estratti di metaboliti specializzati dai brodi di fermentazione liquida e analizzarli utilizzando metodi cromatografici. Invece, i dati sulle proteine e sui metaboliti specializzati vengono raccolti semplicemente diffondendo materiale dalle colonie batteriche direttamente su una piastra bersaglio MALDI. Questo riduce notevolmente il tempo e i costi associati a tecniche alternative come il sequenziamento genico 16S rRNA e LCMS9.
È importante aggiungere una matrice vuota e punti di calibrazione alla piastra MALDI, e si consiglia di utilizzare un numero appropriato di repliche per garantire la riproducibilità e la fiducia statistica. Il numero di repliche dipenderà dall'esperimento. Ad esempio, se un utente intende differenziare migliaia di colonie da una raccolta di piastre di diversità ambientale, potrebbero essere necessarie meno repliche (il nostro laboratorio raccoglie tre repliche tecniche per colonia). In alternativa, se un utente desidera creare un database personalizzato di ceppi da specifici taxa batterici per determinare rapidamente le classificazioni sottospecie di isolati sconosciuti, allora più repliche sono appropriate (il nostro laboratorio raccoglie otto repliche biologiche per ceppo).
IDBac è uno strumento per differenziare rapidamente gli isolati batterici altamente correlati sulla base di informazioni tassonomiche putative e produzione di metaboliti specializzati. Può integrare o servire come precursore di metodi ortogonali come analisi genetiche approfondite, studi che coinvolgono la produzione e la funzione dei metaboliti, o la caratterizzazione della struttura di metaboliti specializzati mediante spettroscopia a risonanza magnetica nucleare e/o LC-MS/MS.
La produzione specializzata di metaboliti (MAN IDBac) è altamente suscettibile alle condizioni di crescita batterica, in particolare utilizzando diversi supporti, che è una potenziale limitazione del metodo. Tuttavia questi tratti possono essere sfruttati dall'utente, come IDBac può facilmente generare MAN mostrando le differenze nella produzione di metaboliti specializzati in una varietà di condizioni di crescita. È importante notare che, sebbene le impronte digitali dei metaboliti specializzati possono variare a seconda della condizione di crescita, abbiamo dimostrato in precedenza che le impronte digitali delle proteine rimangono relativamente stabili in queste variabili (vedi Clark et al.6). Quando si tratta di piastre di diversità ambientale, si consiglia di purificare gli isolati batterici prima dell'analisi al fine di ridurre i possibili contributi dal cross-talk batterico vicino.
Infine, la mancanza di un database pubblico ricercabile di impronte digitali delle proteine MS è una grave carenza nell'uso di questo metodo per classificare i batteri ambientali sconosciuti. Abbiamo creato IDBac con questo in mente, e incluso la conversione automatica dei dati in un formato open source accettato dalla comunità (mzML)10,11,12 e progettato il software per consentire la ricerca, la condivisione e la creazione di database personalizzati. Stiamo creando una grande banca dati pubblica (>10,000 ceppi completamente caratterizzati), che permetterà la classificazione di alcuni isolati a livello di specie, compresi i collegamenti ai numeri di adesione genBank quando disponibili.
IDBac è open source e il codice è disponibile per chiunque per personalizzare le proprie esigenze di analisi e visualizzazione dei dati. Consigliamo agli utenti di consultare un vasto corpo di letteratura (Sauer et al.7, Silva et al.5) per aiutare a sostenere e progettare i loro obiettivi sperimentali. Ospitiamo un forum di discussione all'indirizzo: https://groups.google.com/forum/#!forum/idbac e un mezzo per segnalare problemi con il software all'indirizzo: https://github.com/chasemc/IDBacApp/issues.

Una delle principali barriere per i ricercatori che studiano la funzione batterica è la capacità di valutare rapidamente e simultaneamente l'identità tassonomica di un microrganismo e la sua capacità di produrre metaboliti specializzati. Ciò ha impedito progressi significativi nella comprensione della relazione tra filologia batterica e produzione specializzata di metaboliti nella maggior parte dei batteri isolati dall'ambiente. Sebbene i metodi basati sulla SM che utilizzano impronte proteiche per raggruppare e identificare i batteri siano ben descritti1,2,3,4, questi studi sono stati generalmente eseguiti su piccoli gruppi di isolati, in modo specifico per le specie. È importante sottolineare che le informazioni sulla produzione di metaboliti specializzati, uno dei principali fattori della funzione microbica nell'ambiente, sono rimaste non incorporate in questi studi. Silva et al.5 ha recentemente fornito una storia completa che descrive il sottoutilizzo di MALDI-TOF MS per analizzare i metaboliti specializzati e la carenza di software per alleviare gli attuali colli di bottiglia bioinformatica. Per far fronte a queste carenze, abbiamo creato IDBac, una pipeline di bioinformatica che integra modalità lineare e riflettore di MALDI-TOF MS6. Ciò consente agli utenti di visualizzare e differenziare rapidamente gli isolati batterici in base alle impronte digitali MS sia proteiche che specializzate.
IDBac è conveniente, ad alta velocità effettiva e progettato per l'utente laico. È liberamente disponibile (chasemc.github.io/IDBac) e richiede solo l'accesso a uno spettrometro di massa MALDI-TOF (la modalità riflettore sarà necessaria per l'analisi specialized dei metaboliti). La preparazione del campione si basa sul semplice metodo di "trasferimento diretto esteso"7,8 e i dati vengono raccolti con acquisizioni lineari e di riflettore consecutive su un singolo punto MALDI-target. Con IDBac, è possibile analizzare la produzione di filo putativo e metabolita specializzata di centinaia di colonie in meno di quattro ore, tra cui la preparazione del campione, l'acquisizione dei dati e la visualizzazione dei dati. Questo presenta un significativo vantaggio in termini di tempo e costi rispetto ai metodi tradizionali di identificazione dei batteri (come il sequenziamento genico) e all'analisi della produzione metabolica (spettrometria cromatometria-massa liquida [LCMS] e metodi cromatografici simili).
Utilizzando i dati ottenuti nell'analisi in modalità lineare, IDBac impiega il clustering gerarchico per rappresentare la parentela degli spettri proteici. Poiché gli spettri rappresentano per lo più proteine ribosomiche ionizzate, forniscono una rappresentazione della diversità filogenetica presente in un campione. Inoltre, IDBac incorpora dati in modalità riflettore per visualizzare le impronte digitali dei metaboliti specializzati come Metabolite Association Networks (MAN). I MAN sono reti bipartite che consentono una facile visualizzazione della produzione di metaboliti condivisi e unici tra isolati batterici. La piattaforma IDBac consente ai ricercatori di analizzare sia i dati sulle proteine che sui metaboliti specializzati in tandem, ma anche individualmente se viene acquisito un solo tipo di dati. È importante sottolineare che IDBac elabora i dati non elaborati degli strumenti Bruker e Xiamen, nonché txt, tab, csv, mzXML e mzML. Ciò elimina la necessità di conversione manuale e formattazione dei set di dati e riduce significativamente il rischio di errore dell'utente o di gestione errata dei dati MS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>60-002-65</td>
			<td>LC-MS Ultra CHROMASOLV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex Speed LEF MALDI-TOF instrument</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics Bacterial test standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0884024</td>
			<td>Bruker Daltonics 8604530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Peptide Calibration standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9846988</td>
			<td>Bruker Daltonics 8206195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>99.5+%, Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target Plate</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-500</td>
			<td>Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any is ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC293810010</td>
			<td>99.5%, for biochemistry, ACROS Organics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>28166-41-8</td>
			<td>(C2020-25G) &#8805;98% (TLC), powder</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data

Per visualizzare la relazione tra la filoicina batterica e la produzione specializzata di metaboliti di colonie batteriche che crescono sull'agar nutritivo, abbiamo sviluppato IDBac, un sistema di desorpizzazione/ionizzazione del laser a matrice a basso costo e ad alta produttività spettrorometria di massa a tempo di volo (MALDI-TOF MS) pipeline bioinformatica. Il software IDBac è progettato per i non esperti, è liberamente disponibile e in grado di analizzare da poche a migliaia di colonie batteriche. Qui presentiamo le procedure per la preparazione di colonie batteriche per l'analisi MALDI-TOF MS, il funzionamento dello strumento MS e l'elaborazione e la visualizzazione dei dati in IDBac. In particolare, istruiamo gli utenti su come raggruppare i batteri in dendrogrammi sulla base delle impronte digitali delle proteine MS e creare interattivamente Metabolite Association Networks (MAN) da dati specializzati sui metaboliti.

Abbiamo analizzato sei ceppi di Micromonospora chokoriensis e due ceppi di Bacillus subtilis, precedentemente caratterizzati6, utilizzando i dati disponibili presso DOI: 10.5281/zenodo.2574096. Seguendo le istruzioni nella scheda A partire da dati non elaborati, è stata selezionata l'opzione Fare clic qui per convertire i file Bruker e sono seguite le istruzioni fornite da IDBac per ogni set di dati (Figura 14).
Dopo aver completato la conversione automatizzata e i passaggi di pre-elaborazione/picco, abbiamo proceduto alla creazione di un nuovo esperimento IDBac combinato trasferendo i campioni dei due esperimenti in un unico esperimento contenente sia Bacillus che Campioni di micromonosopora (Figura 15). L'analisi risultante ha comportato il confronto degli spettri proteici utilizzando grafici a specchio, come illustrato nella figura 16,che è stato utile per valutare la qualità degli spettri e regolare le impostazioni di selezione del picco. Figura 17 mostra uno screenshot dei risultati di clustering di proteine con le impostazioni predefinite selezionate. Il dendrogramma è stato colorato regolando la soglia sul grafico (appare come una linea tratteggiata). Da notare la netta separazione tra generi, con M. chokoriensis e B. subtilis isola il clustering separatamente.
Figura 18, Figura 19e Figura 20 evidenziare la possibilità di generare NOMI DI codice AD delle regioni selezionate dall'utente facendo clic e trascinando traslochi tra le proteine dendrogramma. Con questo siamo stati in grado di creare rapidamente MAN per confrontare solo i ceppi B. subtilis (Figura 18), solo i ceppi M. chokoriensis (Figura 19), e tutti i ceppi contemporaneamente (Figura 20). La funzione principale di queste reti è quella di fornire ai ricercatori un'ampia panoramica del grado di sovrapposizione dei metaboliti specializzati tra i batteri. Con questi dati in mano, i ricercatori hanno ora la capacità di prendere decisioni informate solo da una piccola quantità di materiale raschiato da una colonia batterica.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2.jpg"> Figura 14: Elaborazione spectra. Gli spettri autoFlex di Bruker scaricati sono stati convertiti ed elaborati utilizzando IDBac. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2.jpg"> Figura 15: Esperimento IDBac combinato. Poiché gli spettri Micromonospora e Bacillus sono stati raccolti su diverse placche bersaglio MALDI, i due esperimenti sono stati successivamente combinati in un unico esperimento, "Bacillus_Micromonsopora". Questo è stato fatto all'interno della scheda "Lavorare con esperimenti precedenti", seguendo le istruzioni all'interno del menu "Trasferire campioni da esperimenti precedenti a nuovi/altri esperimenti". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 16" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2.jpg"> Figura 16: Confronto. Micromonspora e Bacillus spettri sono stati confrontati utilizzando i grafici a specchio all'interno della pagina "Protein Data Analysis". In definitiva, sono state scelte le impostazioni di picco predefinite. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 17" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2.jpg"> Figura 17: Clustering gerarchico. Clustering gerarchico, utilizzando le impostazioni predefinite, correttamente raggruppato Bacillus e Micromonospora isola. Il dendrogramma è stato colorato "tagliando" il dendrogramma ad un'altezza arbitraria (visualizzato come una linea tratteggiata) e 100 bootstrap utilizzati per mostrare la fiducia nella diramazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 18" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2.jpg"> Figura 18: MAN creato selezionando i ceppi Bacillus sp. dal dendrogramma proteico ha mostrato la produzione differenziale di metaboliti specializzati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 19" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2.jpg"> Figura 19: MAN creato selezionando i sei ceppi Micromonospora sp. dal dendrogramma proteico hanno mostrato la produzione differenziale di metaboliti specializzati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 20" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2.jpg"> Figura 20: Ceppi MAN di Bacillus sp. e Micromonospora sp. che mostrano una produzione differenziale di metaboliti specializzati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data at JoVE.com

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

IDBac è una pipeline di bioinformatica a base di spettrometria di massa open source che integra dati provenienti da proteine intatte e spettri di metaboliti specializzati, raccolti su materiale cellulare raschiato da colonie batteriche. La conduttura consente ai ricercatori di organizzare rapidamente centinaia di migliaia di colonie batteriche in gruppi tassonomici putativi e di differenziarle ulteriormente in base alla produzione specializzata di metaboliti.

Utilizzo della pipeline OPEN-Source MALDI TOF-MS IDBac per l'analisi dei dati sulle proteine microbiche e sui metaboliti specializzati

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

IDBac accoppia i dati delle specifiche di massa provenienti da proteine e regioni metabolite specializzate di isolati batterici sconosciuti per discriminare rapidamente tra isolati in base alla loro identità e alla loro potenziale funzione ambientale. Il nostro software di origine ufficio estende l'utilità delle strategie di identificazione microbica basate su MALDI TOF esistenti. Questa estensione include l'analisi del metabolismo specializzato come un modo aggiuntivo per distinguere tra colonie con fenotipi simili.Una grande sfida nel caratterizzare microrganismi sconosciuti è distinguere isolati strettamente correlati. IDBac fornisce ai ricercatori un modo semplice e veloce per caratterizzare gli isolati attraverso la profilazione di proteine e piccole molecole. IDBac fornisce un confronto visivo della produzione specializzata di metaboliti all'interno di un campione batterico e può fornire informazioni su un'ampia gamma di argomenti di ricerca, dagli studi ecologici alla scoperta di piombo nel farmaco.Ci sono molti modi in cui i dati MALDI possono essere salvati tra e tra gli strumenti. Se hai problemi a far funzionare i file con IDBac, invia un problema a GitHub di IDBac. Utilizzando uno stuzzicadenti sterile, trasferire una piccola porzione di una colonia batterica nel punto appropriato su una piastra MALDI pulita.Stendere uniformemente la colonia batterica sul posto in modo che il punto appaia il più piatto possibile. Sovrapporre un microlitro di acido formico di grado spettrometrico di massa al 70% sui punti di controllo del campione e della matrice e consentire all'acido di asciugarsi all'aria in una cappa aspirante chimica. Successivamente, aggiungere un microlitro di soluzione a matrice MALDI precedentemente preparata ai punti di controllo del campione e del supporto matriciale e lasciare asciugare completamente l'aria.Dopo aver istituito lo spettrometro di massa MALDI TOF, acquisire gli spettri. Salvare gli spettri proteici in una cartella e gli spettri metaboliti specializzati in una seconda cartella separata. Per iniziare questa procedura, scaricare il software IDBac.Fare doppio clic sul pulsante install_idbac per avviare il programma di installazione. Fare quindi doppio clic sul collegamento desktop IDBac per avviare IDBac che si aprirà nella scheda introduzione per impostazione predefinita. Fate clic sulla scheda Inizio con dati grezzi (Starting with Raw Data) e scegliete dal menu crea esperimento IDBac il tipo di dati da utilizzare con IDBac.Quando si imposta la conversione e l'elaborazione dei file di dati, immettere un nome descrittivo per l'esperimento in cui richiesto e fare clic sulla cartella dati non elaborati e selezionare la cartella appropriata. Quindi fare clic su Elabora dati. Dopo aver convertito i file e averli e lavorati con IDBac, passare alla pagina degli esperimenti precedenti e selezionare un esperimento con cui lavorare.Aggiungere informazioni sugli esempi utilizzando il menu, fare clic qui per modificare l'esperimento selezionato. Immettere informazioni nel foglio di calcolo autopopolazione e premere Salva. Quando si è pronti per iniziare l'analisi, assicurarsi che l'esperimento con cui lavorare sia selezionato.Quindi selezionare l'analisi dei dati proteici. Nella pagina di analisi dei dati proteici, scegliere le impostazioni di picco di picco e valutare gli spettri proteici dei campioni tramite i grafici a specchio visualizzati. Regolare la percentuale di repliche in cui deve essere presente un picco per includerlo per l'analisi.Utilizzando i grafici a specchio come guida visiva, regolare il segnale in base al taglio del rumore che mantiene i picchi più autentici e il minimo rumore notando che più repliche in un valore di presenza di picco percentuale più elevato consentirà la selezione di un segnale inferiore al taglio del rumore. In seguito, specificate la massa inferiore e superiore per caricare i cutoff che dettano l'intervallo di valori di massa all'interno di ogni spettro da utilizzare in ulteriori analisi da parte dell'IDBac. All'interno della pagina di analisi dei dati proteici, selezionare la scheda Dendrogramma per consentire il raggruppamento dei campioni in un dendrogramma in base alle misure di distanza selezionate dall'utente e agli algoritmi di clustering.Fate clic su seleziona campioni (Select Samples) dal menu e seguite le istruzioni per selezionare i campioni da includere nell'analisi. Solo i campioni che contengono spettri proteici verranno visualizzati all'interno della casella dei campioni disponibili. Utilizzare i valori predefiniti per gli algoritmi di distanza e clustering e selezionare le intensità come input.Per visualizzare i valori del bootstrap sul dendrogramma, immettere un numero compreso tra due e 1.000 sotto le trappole per stivali. Per iniziare a personalizzare il dendrogramma, aprire il menu regola il dendrogramma. Per colorare le linee del dendrogramma, selezionare clic per modificare le linee e selezionare le opzioni desiderate.Per tracciare le informazioni dal foglio di calcolo accanto al dendrogramma, selezionare il pulsante incorpora informazioni sugli esempi. In questo modo si aprirà un pannello in cui una categoria si autopolerà in base ai valori immessi. Per inserire campioni da un altro esperimento, selezionate il pulsante di menu inserisci campioni da un altro esperimento e seguite le indicazioni nel pannello appena aperto.Passare alla pagina di analisi dei dati delle piccole molecole per consentire la visualizzazione dei dati in base alle principali reti di analisi dei componenti e di associazione metabolica che utilizzano reti bipartite per visualizzare la correlazione della massa di piccole molecole per caricare i valori con i campioni. Fare clic e trascinare sul dendrogramma per evidenziare alcuni campioni di interesse da analizzare. Se non vengono evidenziati campioni o non è stato creato alcun dendrogramma proteico, apparirà rispettivamente una rete di associazione metabolita di un sottoinsieme casuale o di tutti i campioni.Per sottrarre un supporto di matrice vuoto nella rete di associazione dei metaboliti, aprire il menu selezionare un campione da sottrarre e scegliere l'esempio appropriato da utilizzare come vuoto. Aprite le impostazioni man di menu show/hide per selezionare i valori desiderati per una percentuale di presenza di picco e replica, segnale al rumore e tagli di massa superiore e inferiore. Utilizzare i grafici a specchio a piccola molecola per guidare la selezione di queste impostazioni.Per riportare i risultati, copiare il testo all'interno dei suggerimenti per la segnalazione del paragrafo di analisi MAN per fornire all'utente impostazioni definite utilizzate per generare una rete di associazione metabolica creata. Sei ceppi di Micromonospora chokoriensis e due macchie di Bacillus subtilis sono stati analizzati utilizzando i dati nel software IDBac. Seguendo le indicazioni nella scheda iniziale con i dati non elaborati, l'opzione clicca qui per convertire i file Bruker è stata selezionata e l'IDBac ha fornito istruzioni per ogni set di dati.Ai passaggi di picco di picco di conversione e pre-elaborazione automatizzati, è stato creato un esperimento IDBac combinato trasferendo campioni di Bacillus e Micromonospora dai due esperimenti in un unico esperimento. L'analisi risultante ha comportato il confronto di spettri proteici utilizzando grafici a specchio che sono stati utili per valutare la qualità degli spettri e regolare le impostazioni di picco di picco. Qui viene mostrato uno screenshot dei risultati del clustering proteico con le impostazioni predefinite selezionate.Il dendrogramma è stato colorato regolando la soglia sulla trama. Da notare che la netta separazione tra generi con M.chokoriensis e B.subtilis isola il clustering separatamente. Facendo clic e trascinando attraverso il dendrogramma proteico, è stato possibile creare rapidamente reti di associazione metabolica per confrontare solo i ceppi di B.subtilis, solo i ceppi di M.chokoriensis e tutti i ceppi contemporaneamente.La funzione principale di queste reti è fornire ai ricercatori un'ampia panoramica del grado di sovrapposizione di metaboliti specializzati tra batteri. Quando si utilizzano nuovi dati, utilizzare i grafici mirror di IDBac per assicurarsi che i dati siano sensati e che gli spettri siano di alta qualità. Valuta criticamente il tuo progetto sperimentale e i risultati in ogni fase.IDBac consente ai ricercatori di costruire piccole e diverse librerie di microrganismi per ulteriori indagini. Ciò riduce notevolmente i costi associati alle librerie microbiche tradizionalmente grandi e ridondanti. Poiché IDBac consente di visualizzare sovrapposizioni di metaboliti specializzati all'interno di gruppi filogenetici altamente simili, può essere utilizzato per generare domande e ipotesi di ricerca che collegano due campi tipicamente disconnessi.L'acido formico è caustico e deve essere maneggiato in una cappa chimica dei fumi. Alcuni isolati ambientali possono rappresentare potenziali rischi per la salute e tutti i ceppi devono essere trattati come livello di biosicurezza due.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metodo per identificare piccole molecole inibitori della interazione proteina-proteina tra HCN1 e TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Ricerca

Biochimica

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Valutare la fattibilità di un consorzio batterico sintetico sull'interfaccia ospite-microbo In Vitro Gut

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: purificazione di affinità per l'analisi parallela di proteina-proteina e proteina-metabolita complessi in un unico passaggio

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Correzione di bozze e saggio di riparazione del DNA usando l'analisi di spettrometria di massa di singolo Nucleotide estensione e MALDI-TOF

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Privo di calibrazione In Vitro quantificazione delle proteine omo-oligomerizzazione utilizzando Strumentazione commerciale e libero, Open Source Software di analisi di luminosità

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Una pipeline di preparazione del campione per microcristalli presso la linea di fascio VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Effettuare misurazioni FRET a singola molecola precise e accurate utilizzando l'smfBox open source

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Elaborazione dei campioni di Shotgun Proteomics automatizzata da un robot da laboratorio open source

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Raccolta dati Cryo-EM a singola particella con inclinazione dello stadio utilizzando Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...