Name: using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data
Uploaded: 2019-05-15T13:00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institute of General Medical Sciences Grant R01 GM125943, National Geographic Grant CP-044R-17; Det islandske forskningsfondet Grant 152336-051; og University of Illinois i Chicago oppstart midler. Også, vi takker følgende bidragsytere: Dr. Amanda Bulman for hjelp med MALDI-TOF MS protein oppkjøpet parametere; Dr. Terry Moore og Dr. Atul Jain for recrystallizing Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid Matrix (CHCA).

<ol>
	<li>Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+TOF+MS+profiling+of+bacteria+at+the+strain+level:+A+review.">MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review.</a> Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).</li><li>Cain, T. C., Lubman, D. M., Weber, W. J., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+bacteria+using+protein+profiles+from+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Differentiation of bacteria using protein profiles from matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8 (12), 1026-1030 (1994).</li><li>Holland, R. D., Wilkes, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+intact+whole+bacteria+based+on+spectral+patterns+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+with+time-of-flight+mass+spectrometry.">Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 10 (10), 1227-1232 (1996).</li><li>Rahi, P., Prakash, O., Shouche, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass-spectrometry+(MALDI-TOF+MS)+based+microbial+identifications:+challenges+and+scopes+for+microbial+ecologists.">Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass-spectrometry (MALDI-TOF MS) based microbial identifications: challenges and scopes for microbial ecologists.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1359 (2016).</li><li>Silva, R., Lopes, N. P., Silva, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+MALDI+mass+spectrometry+in+natural+products+analysis.">Application of MALDI mass spectrometry in natural products analysis.</a> Planta Medica. 82, 671-689 (2016).</li><li>Clark, C. M., Costa, M. S., Sanchez, L. M., Murphy, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+MALDI-TOF+mass+spectrometry+protein+and+specialized+metabolite+analyses+to+rapidly+discriminate+bacterial+function.">Coupling MALDI-TOF mass spectrometry protein and specialized metabolite analyses to rapidly discriminate bacterial function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4981-4986 (2018).</li><li>Freiwald, A., Sauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+classification+and+identification+of+bacteria+by+mass+spectrometry.">Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 4 (5), 732-742 (2009).</li><li>Schulthess, B., Bloemberg, G. V., Zbinden, R., B&#246;ttger, E. C., Hombach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Bruker+MALDI+Biotyper+for+identification+of+Gram-positive+rods:+development+of+a+diagnostic+algorithm+for+the+clinical+laboratory.">Evaluation of the Bruker MALDI Biotyper for identification of Gram-positive rods: development of a diagnostic algorithm for the clinical laboratory.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1089-1097 (2014).</li><li>Schumann, P., Maier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+mass+spectrometry+applied+to+classification+and+identification+of+bacteria.">MALDI-TOF mass spectrometry applied to classification and identification of bacteria.</a> Methods in Microbiology. 41, 275-306 (2014).</li><li>Chambers, M. C., Maclean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics.">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534 (2008).</li><li>Martens, L., Chambers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mzML-a+community+standard+for+mass+spectrometry+data.">mzML-a community standard for mass spectrometry data.</a> Molecular &#38; Cellular Proteomics. 10 (1), (2011).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Den IDBac protokollen detaljer bakteriell protein og spesialiserte metabolitten datainnsamling og analyse av opptil 384 bakteriell isolerer i 4 timer av en enkelt forsker. Med IDBac er det ikke nødvendig å trekke ut DNA fra bakteriell isolerer eller generere spesialiserte metabolitten ekstrakter fra flytende gjæring kjøttkraft og analysere dem ved hjelp av kromatografiske metoder. I stedet, protein og spesialisert metabolitten data er samlet inn ved å spre materiale fra bakterielle kolonier direkte på en MALDI mål plate. Dette reduserer betydelig tid og kostnader forbundet med alternative teknikker som 16S rRNA gen sekvensering og LCMS9.
Det er viktig å legge en matrise blank og kalibrering flekker til MALDI plate, og vi anbefaler å bruke et passende antall replikerer for å sikre reproduserbarhet og statistisk tillit. Antallet replikeres vil bli eksperiment avhengig. For eksempel, hvis en bruker har til hensikt å differensiere tusenvis av kolonier fra en samling av miljømessige mangfold plater, færre replikerer kan være nødvendig (vår Lab samler tre tekniske replikerer per koloni). Alternativt, hvis en bruker ønsker å opprette en egendefinert database av stammer fra bestemte bakterielle arter å raskt bestemme sub-arter klassifikasjoner av ukjent isolat, deretter flere replikerer er hensiktsmessig (vår Lab samler åtte biologiske replikerer per eller belastning).
IDBac er et verktøy for raskt å skille svært relaterte bakterielle isolerer basert på antatte taksonomisk informasjon og spesialiserte metabolitten produksjon. Det kan utfylle eller tjene som en forløper til ortogonale metoder som i dybden genetiske analyser, studier som involverer metabolitten produksjon og funksjon, eller karakterisering av spesialiserte metabolitten struktur av Nuclear magnetisk resonans spektroskopi og/eller LC-MS/MS.
Specialized metabolitten produksjon (IDBac MANs) er svært utsatt for bakterielle vekstforhold, spesielt ved hjelp av ulike medier, som er en potensiell begrensning av metoden. Men disse egenskapene kan utnyttes av brukeren, som IDBac kan lett generere MANs viser forskjellene i spesialiserte metabolitten produksjon under en rekke vekstforhold. Det er viktig å merke seg at mens spesialiserte metabolitten fingeravtrykk kan variere fra vekst tilstand, har vi tidligere vist at protein fingeravtrykk fortsatt relativt stabilt på tvers av disse variablene (se Clark et al.6). Når du arbeider med miljømessige mangfold plater, anbefaler vi rensing bakteriell isolat før analyse for å redusere mulige bidrag fra nabokommunene bakteriell cross-talk.
Til slutt, mangelen på en søkbar offentlig database med protein MS fingeravtrykk er en stor brist i bruk av denne metoden for å klassifisere ukjente miljømessige bakterier. Vi opprettet IDBac med dette i tankene, og inkluderte automatisk konvertering av data til et Community-akseptert Open-Source format (mzML)10,11,12 og utviklet programvaren for å tillate søking, deling og opprettelse av egendefinerte databaser. Vi er i ferd med å skape en stor offentlig database (> 10000 fullt karakterisert stammer), som vil tillate klassifisering av noen isolerer til arten-nivå, inkludert lenker til GenBank tiltredelse tall når det er tilgjengelig.
IDBac er åpen kildekode og koden er tilgjengelig for alle å tilpasse sine dataanalyse og visualisering behov. Vi anbefaler at brukerne Rådfører seg med en omfattende mengde litteratur (sauer et al.7, Silva et al.5) for å hjelpe til med å støtte og designe sine eksperimentelle mål. Vi arrangerer et forum for diskusjon på: https://groups.google.com/forum/#!forum/idbac og et middel til å rapportere problemer med programvaren på: https://GitHub.com/chasemc/IDBacApp/Issues.

En stor barriere for forskere som studerer bakteriell funksjon er evnen til raskt og samtidig vurdere taksonomisk identiteten til en mikroorganismen og dens evne til å produsere spesialiserte metabolitter. Dette har forhindret betydelige fremskritt i å forstå forholdet mellom bakteriell fylogeni og spesialisert metabolitten produksjon i de fleste bakterier isolert fra miljøet. Selv om MS-baserte metoder som bruker protein fingeravtrykk for å gruppere og identifisere bakterier er godt beskrevet1,2,3,4, disse studiene har generelt vært utført på små grupper av isolat, på en art-spesifikk måte. Viktigere, informasjon om spesialiserte metabolitten produksjon, en stor pådriver for mikrobiell funksjon i miljøet, har vært kommunefritt i disse studiene. Silva et al.5 nylig gitt en omfattende historie detaljering UNDERUSE av MALDI-TOF MS å analysere spesialiserte metabolitter og mangel på programvare for å avlaste dagens bioinformatikk flaskehalser. For å løse disse svakhetene, skapte vi IDBac, en bioinformatikk rørledning som integrerer både lineære og reflectron moduser MALDI-TOF MS6. Dette gjør at brukerne raskt visualisere og differensiere bakteriell isolerer basert på både protein og spesialiserte metabolitten MS fingeravtrykk, henholdsvis.
IDBac er kostnadseffektiv, høy gjennomstrømming, og designet for lå brukeren. Det er fritt tilgjengelig (chasemc.github.io/IDBac), og krever bare tilgang til en MALDI-TOF masse spektrometer (reflectron modus vil være nødvendig for spesialiserte metabolitten analyse). Prøve forberedelser er avhengig av den enkle "utvidet direkte overføring"-metoden7,8 og data samles inn med etterfølgende lineære og reflectron oppkjøp på ett enkelt MALDI sted. Med IDBac, er det mulig å analysere antatte fylogeni og spesialisert metabolitten produksjon av hundrevis av kolonier på under fire timer, inkludert prøve utarbeidelse, datainnsamling, og data visualisering. Dette presenterer en betydelig tid og kostnader fordel over tradisjonelle metoder for å identifisere bakterier (for eksempel gen sekvensering), og analysere metabolske output (flytende kromatografi-Mass massespektrometri [LCMS] og lignende kromatografiske metoder).
Ved hjelp av data innhentet i lineær modus analyse, sysselsetter IDBac hierarkisk Clustering å representere Relatedness av protein Spectra. Siden Spectra for det meste representerer ionisert ribosomal proteiner, gir de en representasjon av Fylogenetiske mangfoldet stede i en prøve. I tillegg inkorporerer IDBac reflectron modus data for å vise spesialiserte metabolitten fingeravtrykk som metabolitten Association Networks (MANs). MANs er bipartite nettverk som gir mulighet for enkel visualisering av delte og unike metabolitten produksjon mellom bakteriell isolerer. Den IDBac plattformen lar forskere til å analysere både protein og spesialiserte metabolitten data i tandem, men også individuelt hvis bare én data-type er ervervet. Viktigere, IDBac behandler rådata fra bruker og Xiamen instrumenter, samt txt, tab, CSV, mzXML, og mzML. Dette eliminerer behovet for manuell konvertering og formatering av datasett, og reduserer risikoen for bruker feil eller mishandling av MS-data betraktelig.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>60-002-65</td>
			<td>LC-MS Ultra CHROMASOLV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex Speed LEF MALDI-TOF instrument</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics Bacterial test standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0884024</td>
			<td>Bruker Daltonics 8604530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Peptide Calibration standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9846988</td>
			<td>Bruker Daltonics 8206195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>99.5+%, Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target Plate</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-500</td>
			<td>Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any is ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC293810010</td>
			<td>99.5%, for biochemistry, ACROS Organics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>28166-41-8</td>
			<td>(C2020-25G) &#8805;98% (TLC), powder</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data

For å visualisere forholdet mellom bakteriell fylogeni og spesialisert metabolitten produksjon av bakterielle kolonier som vokser på næringsstoffer agar, utviklet vi IDBac-en lav pris og høy gjennomstrømming matrise-assistert laser desorpsjon/ionisering Time-of-Flight masse massespektrometri (MALDI-TOF MS) bioinformatikk rørledning. IDBac programvare er utviklet for ikke-eksperter, er fritt tilgjengelig, og i stand til å analysere noen få til tusenvis av bakterielle kolonier. Her presenterer vi prosedyrer for utarbeidelse av bakterie kolonier for MALDI-TOF MS analyse, MS instrument drift, og databehandling og visualisering i IDBac. Spesielt instruerer vi brukerne hvordan å klynge bakterier i dendrograms basert på protein MS fingeravtrykk og interaktivt opprette metabolitten Association Networks (MANs) fra spesialiserte metabolitten data.

Vi analyserte seks stammer av Micromonospora chokoriensis og to stammer av Bacillus subtilis, som tidligere var karakterisert6, ved hjelp av data tilgjengelig på doi: 10.5281/zenodo. 2574096. Følgende retninger i starter med RAW data tab, valgte vi alternativet Klikk her for å konvertere bruker filer og fulgte IDBac-forutsatt instruksjoner for hvert datasett (figur 14).
Etter automatisert konvertering og forbehandling/peak-topp trinnene ble fullført, fortsatte vi å lage en ny kombinert IDBac eksperiment ved å overføre prøver fra to eksperimenter i et enkelt eksperiment som inneholder både Bacillus og Micromonosopora prøver (Figur 15). Den resulterende analysen involvert sammenligne protein Spectra bruke speilet tomter, som avbildet i Figur 16, som var nyttig for å evaluere Spectra kvalitet og justere peak-plukking innstillinger. Figur 17 viser en skjermdump av proteinet Clustering resultater med standardinnstillingene valgt. Dendrogram ble farget ved å justere terskelen på plottet (vises som en prikket linje). Av notatet er det klare skillet mellom slekter, med både M. chokoriensis og B. subtilis isolerer klynger separat.
Figur 18, Figur 19, og figur 20 fremheve evnen til å generere MANs av bruker-utvalgte regioner ved å klikke og dra over proteinet dendrogram. Med dette var vi i stand til å raskt skape MANs å sammenligne bare B. subtilis stammer(figur 18), bare M. chokoriensis stammer (Figur 19), og alle stammene samtidig (figur 20). Den primære funksjon av disse nettverkene er å gi forskere en bred oversikt over graden av spesialiserte metabolitten overlapping mellom bakterier. Med disse dataene i hånden, forskere har nå kapasitet til å ta informerte beslutninger fra bare en liten mengde materiale skrapet fra en bakteriell koloni.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2.jpg"> Figur 14: Spectra prosessering. Nedlastede bruker autoFlex Spectra ble konvertert og behandlet ved hjelp IDBac. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2.jpg"> Figur 15: kombinert IDBac eksperimentet. Fordi Micromonospora og Bacillus Spectra ble samlet på ulike MALDI mål plater, de to eksperimentene ble deretter kombinert i et enkelt eksperiment-"Bacillus_Micromonsopora". Dette ble gjort i "arbeid med tidligere eksperimenter"-fanen, følgende retninger i menyen "Overfør prøver fra tidligere eksperimenter til nye/andre eksperimenter". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 16" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2.jpg"> Figur 16: sammenligning. Micromonspora og Bacillus Spectra ble sammenlignet ved hjelp av speilet tomter innenfor "protein data analyse" side. Til syvende og sist ble standard topp innstillinger valgt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 17" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2.jpg"> Figur 17: hierarkisk gruppering. Hierarkisk klynging, bruker standardinnstillinger, riktig gruppert Bacillus og Micromonospora isolerer. Dendrogram var farget av "cutting" dendrogram på en vilkårlig høyde (vises som en stiplet-linje) og 100 håret brukes til å vise tillit i forgrening. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 18" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2.jpg"> Figur 18: man opprettet ved å velge Bacillus Sp. stammer fra proteinet dendrogram viste differensial produksjon av spesialiserte metabolitter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 19" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2.jpg"> Figur 19: man opprettet ved å velge de seks Micromonospora Sp. stammer fra proteinet dendrogram viste differensial produksjon av spesialiserte metabolitter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 20" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2.jpg"> Figur 20: Man of Bacillus Sp. og Micromonospora Sp. stammer som viser en differensiell produksjon av spesialiserte metabolitter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data at JoVE.com

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

IDBac er en åpen-kildekode Mass massespektrometri-baserte bioinformatikk rørledning som integrerer data fra både intakt protein og spesialiserte metabolitten Spectra, samlet på celle materiale skrapet fra bakterielle kolonier. Rørledningen gjør det mulig for forskere å raskt organisere hundrevis til tusenvis av bakterielle kolonier i antatte taksonomisk grupper, og ytterligere differensiere dem basert på spesialiserte metabolitten produksjon.

Ved hjelp av Open-Source MALDI TOF-MS IDBac rørledning for analyse av mikrobiell protein og spesialiserte metabolitten data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

IDBac par masse spec data fra protein og spesialiserte metabolittregioner av ukjente bakterielle isolater for raskt å diskriminere mellom isolater basert på både deres identitet og deres potensielle miljøfunksjon. Vår kontorkildeprogramvare utvider nytten av eksisterende MALDI TOF-baserte mikrobielle identifikasjonsstrategier. Denne utvidelsen inkluderer analyse av spesialisert metabolisme som en ekstra måte å skille mellom kolonier med lignende fenotyper.En stor utfordring med å karakterisere ukjente mikroorganismer er å skille mellom nært beslektede isolater. IDBac gir forskere en enkel og rask måte å karakterisere isolater gjennom protein og liten molekylprofilering. IDBac gir en visuell sammenligning av spesialisert metabolittproduksjon i en bakteriell prøve og kan gi innsikt i et bredt spekter av forskningsemner fra økologiske studier til narkotikablyfunn.Det er mange måter at MALDI-data kan lagres mellom og blant instrumenter. Hvis du har problemer med å få filer til å fungere med IDBac, send inn et problem til IDBac's GitHub. Bruk en steril tannpirker, overfør en liten del av en bakteriell koloni til riktig sted på en ren MALDI-plate.Spre bakteriekolonien jevnt over stedet slik at stedet ser så flatt ut som mulig. Overlegg en mikroliter på 70% massespektrometrigrad formikrosyre på prøven og matrisekontrollpunktene og la syren lufttørke i en kjemisk røykhette. Deretter legger du til en mikroliter av tidligere forberedt MALDI matriseløsning til prøve- og matrisemediekontrollpunktene og lar lufttørke helt.Etter å ha satt opp MALDI TOF massespektrometer, skaffe spektra. Lagre proteinspektra i en mappe og den spesialiserte metabolitten spektra i en annen egen mappe. Last ned IDBac-programvaren for å starte denne prosedyren.Dobbeltklikk på den nedlastede install_idbac for å starte installasjonsprogrammet. Deretter dobbeltklikker du på IDBac-skrivebordssnarveien for å starte IDBac som åpnes i introduksjonsfanen som standard. Klikk på Start med rådata-fanen og velg fra opprett en IDBac-eksperimentmeny hvilken type data som skal brukes med IDBac.Når du konfigurerer konvertering og behandling av datafiler, skriver du inn et beskrivende navn for eksperimentet der du blir bedt om det, og klikker på rådatamappen og velger riktig mappe. Klikk deretter på Behandle data. Når du har konvertert filene og behandlet dem med IDBac, navigerer du til arbeidet med tidligere eksperimenter-siden og velger et eksperiment du vil arbeide med.Legg til informasjon om eksempler ved hjelp av menyen klikk her for å endre det valgte eksperimentet. Skriv inn informasjon i det autoutfylte regnearket, og trykk lagre. Når du er klar til å starte analysen, må du sørge for at eksperimentet skal arbeide med er valgt.Velg deretter proteindataanalyse. På siden for proteindataanalyse velger du toppinnstillingene og evaluerer proteinspektraet av prøver via de viste speilplottene. Juster prosentandelen av replikeringer der en topp må være til stede for at den skal inkluderes for analyse.Ved hjelp av speilplottene som visuell veiledning, justerer du signalet til støyavskjæring som beholder de mest ekte toppene, og den minst støyen som ser at flere replikerer i en høyere prosentandel topp tilstedeværelsesverdi vil tillate valg av et lavere signal til støy cutoff. Etter dette angir du den nedre og øvre massen for å lade cutoffs som dikterer omfanget av masseverdier innenfor hvert spektrum som skal brukes i videre analyse av IDBac. På siden for analyse av proteindata velger du kategorien Dendrogram for å tillate gruppering av prøver i et dendrogram i henhold til brukervalgte avstandsmål og klyngealgoritmer.Klikk velg eksempler på menyen, og følg instruksjonene for å velge eksempler som skal inkluderes i analysen. Bare prøver som inneholder proteinspektra vil bli vist i den tilgjengelige prøveboksen. Bruk standardverdiene for avstands- og klyngealgoritmene, og velg intensiteter som inndata.Hvis du vil vise bootstrap-verdier på dendrogramet, angir du et tall mellom to og 1000 under bootstraps. Hvis du vil begynne å tilpasse dendrogrammet, åpner du menyen juster dendrogram. Hvis du vil fargelegge dendrogramlinjene, velger du klikk for å endre linjer og velger de ønskede alternativene.Hvis du vil tegne informasjon fra regnearket ved siden av dendrogrammet, velger du knappen inkorporerer informasjon om eksempler. Dette åpner et panel der en kategori vil fylle ut selv basert på de angitte verdiene. Hvis du vil sette inn eksempler fra et annet eksperiment, velger du menyknappen sett inn eksempler fra et annet eksperiment og følger instruksjonene i det nyåpnede panelet.Gå videre til den lille molekyldataanalysesiden for å muliggjøre datavisualisering ved prinsippkomponentanalyse og metabolske tilknytningsnettverk som bruker bipartitenettverk for å vise korrelasjonen av liten molekylmasse for å lade verdier med prøver. Klikk og dra på dendrogram for å utheve utvalgte eksempler av interesse som skal analyseres. Hvis ingen prøver er uthevet eller ingen protein dendrogram ble opprettet, en metabolitt tilknytning nettverk av enten en tilfeldig delsett eller alle prøver vil vises henholdsvis.Hvis du vil trekke et matrisemedi tomt i metabolitten tilknytningsnettverk, åpner du menyen og velger et eksempel for å trekke fra og velger riktig eksempel som skal brukes som en tom. Åpne menyen vis/skjul MAN-innstillinger for å velge de ønskede verdiene for en prosentandel av topptilstedeværelse og replikering, signal til støy og øvre og nedre masseavskjæringer. Bruk de små molekylspeilplottene til å veilede valget av disse innstillingene.For rapportering av resultater kopierer du teksten i avsnittet forslag til rapportering av MAN-analyse for å gi de brukerdefinerte innstillingene som brukes til å generere opprettet metabolsk tilknytningsnettverk. Seks stammer av Micromonospora chokoriensis og to flekker av Bacillus subtilis ble analysert ved hjelp av data i IDBac-programvaren. Følgende veibeskrivelser i kategorien rådata ble alternativet klikk her for å konvertere Bruker-filer valgt, og IDBac-instruksjonene ble fulgt for hvert datasett.Til de automatiserte trinnene for konvertering og forhåndsbehandling av toppbehandling ble det opprettet et kombinert IDBac-eksperiment ved å overføre Bacillus- og Micromonospora-eksempler fra de to eksperimentene til ett enkelt eksperiment. Den resulterende analysen involverte sammenligning av proteinspektra ved hjelp av speilplott som var nyttige for å evaluere spektrakvalitet og justere toppinnstillinger. Et skjermbilde av proteinklyngeresultatene med standardinnstillingene valgt, vises her.Dendrogram ble farget ved å justere terskelen på plottet. Merk er den klare separasjonen mellom slekter med både M.chokoriensis og B.subtilis isolerer klynger separat. Ved å klikke og dra over protein dendrogram, det var mulig å raskt opprette metabolske foreningen nettverk for å sammenligne bare B.subtilis stammer, bare M.chokoriensis stammer, og alle stammene samtidig.Den primære funksjonen til disse nettverkene er å gi forskerne en bred oversikt over graden av spesialisert metabolitt overlapping mellom bakterier. Når du arbeider med nye data, bruk IDBac speilplott for å sikre at dataene dine gir mening og spektra er av høy kvalitet. Vurder eksperimentell design og resultater på et trinn kritisk.IDBac gjør det mulig for forskere å bygge små og varierte biblioteker av mikroorganismer for videre undersøkelse. Dette reduserer i stor grad kostnadene forbundet med tradisjonelt store og overflødige mikrobielle biblioteker. Fordi IDBac lar deg visualisere spesialisert metabolittoverlapping i svært like fylogenetiske grupper, kan den brukes til å generere forskningsspørsmål og hypoteser som kobler to vanligvis frakoblede felt.Maursyre er etsende og bør håndteres i en kjemisk røykhette. Noen miljøisoler kan utgjøre potensielle helsefarer, og alle stammer bør behandles som biosikkerhet nivå to.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metode for å identifisere lavmolekylære inhibitorer av protein-protein samhandling mellom HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Vurdere levedyktigheten til et syntetisk bakteriell konsortium til In Vitro Gut vert-mikrobe-grensesnittet

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: trinns affinitet rensing for parallell analyse av Protein-Protein og Protein-metabolitten komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlesing og DNA reparasjon analysen Single nukleotid forlengelse og MALDI-TOF massespektrometri analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantifisering av Protein Homo-oligomerization med kommersielle instrumentering og gratis, åpen kildekode lysstyrke analyseprogramvare

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En prøveforberedelsesrørledning for mikrokrystaller ved VMXm-strålelinjen

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Foreta presise og nøyaktige FRET-målinger med ett molekyl ved hjelp av åpen kildekode-smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Hagle proteomics prøvebehandling automatisert av en åpen kildekode lab robot

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Kryo-EM-datainnsamling med enkeltpartikler med scenetilt ved bruk av Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...