Name: using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data
Uploaded: 2019-05-15T13:00:00
Duration: 9 min 29 s
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Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de ciências médicas gerais Grant R01 GM125943, National Geographic Grant CP-044R-17; Concessão do fundo de pesquisa Islandês 152336-051; e da Universidade de Illinois em Chicago fundos de inicialização. Além disso, agradecemos aos seguintes contribuidores: Dr. Amanda Bulman para assistência com os parâmetros de aquisição de proteínas MALDI-TOF MS; Dr. Terry Moore e Dr. Atul Jain para recristalização Alpha-cyano-4-Hydroxycinnamic Acid Matrix (CHCA).

<ol>
	<li>Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+TOF+MS+profiling+of+bacteria+at+the+strain+level:+A+review.">MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review.</a> Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).</li><li>Cain, T. C., Lubman, D. M., Weber, W. J., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+bacteria+using+protein+profiles+from+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Differentiation of bacteria using protein profiles from matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8 (12), 1026-1030 (1994).</li><li>Holland, R. D., Wilkes, J. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass-spectrometry+(MALDI-TOF+MS)+based+microbial+identifications:+challenges+and+scopes+for+microbial+ecologists.">Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass-spectrometry (MALDI-TOF MS) based microbial identifications: challenges and scopes for microbial ecologists.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1359 (2016).</li><li>Silva, R., Lopes, N. P., Silva, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+MALDI+mass+spectrometry+in+natural+products+analysis.">Application of MALDI mass spectrometry in natural products analysis.</a> Planta Medica. 82, 671-689 (2016).</li><li>Clark, C. M., Costa, M. S., Sanchez, L. M., Murphy, B. 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Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo IDBac detalha a proteína bacteriana e a aquisição e análise de dados metabólito especializados de até 384 isolados bacterianos em 4 h por um único pesquisador. Com IDBac não há necessidade de extrair DNA de isolados bacterianos ou gerar extratos metabólitos especializados de caldos de fermentação líquida e analisá-los usando métodos cromatográficos. Em vez disso, os dados de proteínas e metabólito especializados são recolhidos simplesmente espalhando material de colônias bacterianas diretamente sobre uma placa alvo MALDI. Isto reduz extremamente o tempo e o custo associados com as técnicas alternativas tais como o sequenciamento do gene 16S rRNA e o LCMS9.
É importante adicionar uma matriz em branco e pontos de calibração à placa MALDI, e recomendamos o uso de um número adequado de repetições para garantir a reprodutibilidade e a confiança estatística. O número de repetições será dependente do experimento. Por exemplo, se um usuário pretende diferenciar milhares de colônias de uma coleção de placas de diversidade ambiental, menos repetições podem ser necessárias (nosso laboratório coleta três repetições técnicas por colônia). Alternativamente, se um usuário deseja criar um banco de dados personalizado de cepas de táxons bacterianos específicos para determinar rapidamente classificações de subespécies de isolados desconhecidos, mais réplicas são apropriadas (nosso laboratório coleta oito repetições biológicas por tensão).
O IDBac é uma ferramenta para diferenciar rapidamente os isolados bacterianos altamente relacionados baseados na informação taxonômica putativa e na produção especializada do metabolito. Pode complementar ou servir como um precursor de métodos ortogonais, tais como análises genéticas aprofundadas, estudos envolvendo produção e função do metabolito, ou caracterização da estrutura do metabolito especializado por espectroscopia de ressonância magnética nuclear e/ou LC-MS/MS.
A produção de metabolito especializado (IDBac MANs) é altamente suscetível a condições de crescimento bacteriano, especialmente utilizando diferentes meios de comunicação, o que é uma potencial limitação do método. No entanto, essas características podem ser exploradas pelo usuário, como IDBac pode prontamente gerar MANs mostrando as diferenças na produção de metabólito especializados uma variedade de condições de crescimento. É importante notar que, embora as impressões digitais do metabolito especializado possam variar de acordo com a condição de crescimento, mostramos previamente que as impressões digitais de proteínas permanecem relativamente estáveis nessas variáveis (ver Clark et al.6). Ao lidar com as placas de diversidade ambiental, recomendamos a purificação de isolados bacterianos antes da análise, a fim de reduzir possíveis contribuições de cross-talk bacteriano vizinho.
Finalmente, a falta de uma base de dados pública pesquisável de impressões digitais da proteína MS é um lacuna principal no uso deste método para classificar bactérias ambientais desconhecidas. Criamos o idbac com isso em mente e incluímos a conversão automatizada de dados em um formato de código aberto aceito pela Comunidade (mzml)10,11,12 e projetamos o software para permitir a pesquisa, compartilhamento e criação de bancos de dados personalizados. Estamos no processo de criação de um grande banco de dados público (> 10000 cepas totalmente caracterizadas), o que permitirá a classificação de alguns isolados para o nível de espécie, incluindo links para números de adesão GenBank quando disponível.
IDBac é fonte aberta e o código está disponível para qualquer pessoa personalizar suas necessidades de análise e visualização de dados. Recomendamos que os usuários consultem um extenso corpo de literatura (Sauer et al.7, Silva et al.5) para ajudar a apoiar e projetar seus objetivos experimentais. Nós hospedamos um fórum para discussão em: https://groups.google.com/forum/#!forum/idbac e um meio para relatar problemas com o software em: https://github.com/chasemc/IDBacApp/issues.

Uma grande barreira para pesquisadores que estudam a função bacteriana é a capacidade de avaliar rapidamente e simultaneamente a identidade taxonômica de um microrganismo e sua capacidade de produzir metabólitos especializados. Isso impediu avanços significativos na compreensão da relação entre a filogenia bacteriana e a produção de metabólito especializado na maioria das bactérias isoladas do ambiente. Embora os métodos baseados em MS que usam impressões digitais de proteínas para agrupar e identificar bactérias sejam bem descritos1,2,3,4, esses estudos geralmente foram realizados em pequenos grupos de isolados, de forma específica da espécie. É importante ressaltar que as informações sobre a produção de metabólito especializado, um dos principais condutores de função microbiana no ambiente, permaneceram não incorporadas nesses estudos. Silva et al.5 forneceram recentemente uma história abrangente detalhando o baixo uso de MALDI-TOF MS para analisar metabólitos especializados e a escassez de softwares para aliviar os gargalos atuais de Bioinformática. A fim de abordar essas deficiências, criamos IDBac, um pipeline de Bioinformática que integra os modos linear e reflectron de MALDI-TOF MS6. Isto permite que os usuários visualizem e diferenciem rapidamente os isolados bacterianos baseados na proteína e nas impressões digitais especializadas do MS do metabolito, respectivamente.
IDBac é rentável, alta taxa de transferência, e projetado para o usuário leigo. Está disponível livremente (chasemc.github.io/IDBac), e exige somente o acesso a um espectrómetro maciço de MALDI-TOF (o modo do reflectron será exigido para a análise especializada do metabolito). A preparação da amostra depende do método simples de "transferência direta estendida"7,8 e os dados são coletados com aquisições consecutivas lineares e de reflectron em um único ponto do MALDI-alvo. Com IDBac, é possível analisar a filogenia putativa e a produção de metabólito especializado de centenas de colônias em menos de quatro horas, incluindo preparação de amostras, aquisição de dados e visualização de dados. Isto apresenta uma vantagem significativa do tempo e do custo sobre métodos tradicionais de identificar as bactérias (tais como o sequenciamento do gene), e analisando a saída metabólica (cromatografia líquida-espectrometria maciça [LCMS] e métodos cromatográficos similares).
Usando dados obtidos na análise de modo linear, IDBac emprega agrupamento hierárquico para representar a parentalidade dos espectros proteicos. Uma vez que os espectros representam principalmente proteínas ribossômicas ionizadas, eles fornecem uma representação da diversidade filogenética presente em uma amostra. Além disso, o idbac incorpora dados de modo reflectron para exibir as impressões digitais especializadas do metabolito como metabolito Association Networks (Mans). Mans são redes bipartido que permitem a fácil visualização da produção de metabólito compartilhada e única entre isolados bacterianos. A plataforma IDBac permite que os pesquisadores analisem os dados de proteínas e metabólito especializados em tandem, mas também individualmente, se apenas um tipo de dados for adquirido. Importante, IDBac processa dados brutos de instrumentos de Bruker e de Xiamen, assim como o txt, a aba, o CSV, o mzXML, e o mzML. Isso elimina a necessidade de conversão manual e formatação de conjuntos de dados, e reduz significativamente o risco de erro do usuário ou manipulação incorreta de dados MS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>60-002-65</td>
			<td>LC-MS Ultra CHROMASOLV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex Speed LEF MALDI-TOF instrument</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics Bacterial test standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0884024</td>
			<td>Bruker Daltonics 8604530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Peptide Calibration standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9846988</td>
			<td>Bruker Daltonics 8206195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>99.5+%, Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target Plate</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-500</td>
			<td>Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any is ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC293810010</td>
			<td>99.5%, for biochemistry, ACROS Organics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>28166-41-8</td>
			<td>(C2020-25G) &#8805;98% (TLC), powder</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data

A fim de visualizar a relação entre a filogenia bacteriana e a produção de metabólito especializado de colônias bacterianas que crescem em ágar nutriente, desenvolvemos IDBac — uma dessorção/ionização a laser assistida por matriz de baixo custo e alta taxa de transferência pipeline de Bioinformática de espectrometria de massas em tempo de voo (MALDI-TOF MS). IDBac software é projetado para não-especialistas, está disponível gratuitamente, e capaz de analisar alguns a milhares de colônias bacterianas. Aqui, apresentamos procedimentos para a preparação de colônias bacterianas para análise de MALDI-TOF MS, operação de instrumento MS e processamento e visualização de dados em IDBac. Em particular, Instruímos os usuários como agrupar bactérias em dendrogramas com base em impressões digitais de proteína MS e criar interativamente redes de associação de metabolito (MANs) de dados de metabólito especializados.

Foram analisadas seis cepas de Micromonospora chokoriensis e duas cepas de Bacillus subtilis, que foram caracterizadas anteriormente6, utilizando dados disponíveis em doi: 10.5281/zenodo. 2574096. Seguindo as instruções na guia iniciando com dados brutos , selecionamos a opção clique aqui para converter os arquivos do Bruker e seguimos a instrução fornecida pelo idbac para cada conjunto de dados (Figura 14).
Depois que as etapas automatizadas da conversão e do pré-processamento/pico-peaking foram terminadas, nós proseguimos criar um experimento combinado novo do IDBac Transferindo amostras dos dois experimentos em um único experimento que contem o bacilo e Amostras de micromonosopora (Figura 15). A análise resultante envolveu a comparação de espectros proteicos utilizando parcelas espelhadas, como ilustrado na Figura 16, que foi útil para avaliar a qualidade dos espectros e ajustar as configurações de pico-picking. A Figura 17 exibe uma captura de tela dos resultados de clustering de proteínas com as configurações padrão selecionadas. O dendrograma foi colorido ajustando o limiar no gráfico (aparece como uma linha pontilhada). Nota-se a clara separação entre gêneros, com os isolados de M. chokoriensis e B. subtilis em agrupamento separado.
Figura 18, Figura 19e Figura 20 destacam a capacidade de gerar Mans de regiões selecionadas pelo usuário clicando e arrastando através do dendrograma de proteínas. Com isso, pudemos criar rapidamente MANs para comparar apenas as cepas de B. subtilis (Figura 18), apenas as cepas de M. chokoriensis (Figura 19) e todas as cepas simultaneamente (Figura 20). A função preliminar destas redes é fornecer investigadores uma vista geral larga do grau de sobreposição especializada do metabolito entre bactérias. Com esses dados em mãos, os pesquisadores agora têm a capacidade de tomar decisões informadas a partir de apenas uma pequena quantidade de material raspado de uma colônia bacteriana.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2.jpg"> Figura 14: processamento de espectros. Os espectros baixados do autoFlex do Bruker foram convertidos e processados usando IDBac. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2.jpg"> Figura 15: experimento de IDBac combinado. Porque os espectros da Micromonospora e do bacilo foram coletados em placas diferentes do alvo de MALDI, os dois experimentos foram combinados subseqüentemente em um único experimento-"Bacillus_Micromonsopora". Isso foi feito dentro da aba "trabalhar com experimentos anteriores", seguindo as instruções no menu "transferir amostras de experimentos anteriores para novos/outros experimentos". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 16" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2.jpg"> Figura 16: comparação. Micromonspora e Bacillus Spectra foram comparados utilizando as parcelas espelhadas na página "análise de dados proteicos". Em última análise, as configurações de pico padrão foram escolhidas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 17" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2.jpg"> Figura 17: agrupamento hierárquico. Agrupamento hierárquico, usando configurações padrão, agrupados corretamente Bacillus e Micromonospora isolados. O dendrograma foi colorido por "cortar" o dendrograma em uma altura arbitrária (exibido como uma linha tracejada) e 100 bootstraps usados para mostrar confiança na ramificação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 18" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2.jpg"> Figura 18: o homem criado selecionando as cepas de Bacillus SP. do dendrograma de proteínas mostrou produção diferencial de metabólitos especializados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 19" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2.jpg"> Figura 19: o homem criado selecionando as seis cepas de Micromonospora SP. do dendrograma de proteínas mostrou produção diferencial de metabólitos especializados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 20" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2.jpg"> Figura 20: o homem das cepas de Bacillus SP. e Micromonospora SP. mostra uma produção diferencial de metabólitos especializados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

IDBac é um pipeline de Bioinformática baseado em espectrometria de massas de código aberto que integra dados de proteínas intactas e espectros metabólito especializados, coletados em material celular raspado de colônias bacterianas. O pipeline permite que os pesquisadores organizem rapidamente centenas a milhares de colônias bacterianas em grupos taxonômicos putativos e diferenciem-se ainda mais com base na produção de metabólito especializado.

Usando o pipeline de código aberto MALDI TOF-MS IDBac para análise de proteína microbiana e dados metabólito especializados

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

O IDBac acotoda dados de especificações de massa de proteínas e regiões metabólitos especializados de isolados bacterianos desconhecidos para discriminar rapidamente entre isolados com base em sua identidade e em sua potencial função ambiental. Nosso software de origem de escritório amplia a utilidade das estratégias de identificação microbiana baseadas em MALDI TOF existentes. Esta extensão inclui a análise do metabolismo especializado como uma forma adicional de diferenciar entre colônias com fenótipos semelhantes.Um grande desafio na caracterização de microrganismos desconhecidos é distinguir isolados intimamente relacionados. O IDBac fornece aos pesquisadores uma maneira fácil e rápida de caracterizar isolados através de perfis de proteínas e pequenas moléculas. O IDBac fornece uma comparação visual da produção especializada de metabólitos dentro de uma amostra bacteriana e pode fornecer insights sobre uma ampla gama de tópicos de pesquisa, desde estudos ecológicos até descoberta de chumbo de drogas.Existem muitas maneiras pelas quais os dados MALDI podem ser salvos entre e entre os instrumentos. Se você tiver problemas para obter arquivos para trabalhar com o IDBac, envie um problema ao GitHub do IDBac. Usando um palito estéril, transfira uma pequena porção de uma colônia bacteriana para o local apropriado em uma placa MALDI limpa.Espalhe a colônia bacteriana uniformemente sobre o local para que o local pareça o mais plano possível. Sobrepor um microliter de 70% de espectrometria de massa grau de ácido fórmico nos pontos de controle de amostra e matriz e permitir que o ácido seque em uma capa de fumaça química. Em seguida, adicione um microliter de solução matricial MALDI previamente preparada aos pontos de controle de mídia de amostra e matriz e permita secar completamente o ar.Depois de configurar o espectrômetro de massa MALDI TOF, adquira o espectro. Salve o espectro de proteínas em uma pasta e o espectro metabólito especializado em uma segunda pasta separada. Para iniciar este procedimento, baixe o software IDBac.Clique duas vezes no install_idbac baixado para iniciar o instalador. Em seguida, clique duas vezes no atalho de desktop IDBac para iniciar o IDBac, que será aberto na guia de introdução por padrão. Clique na guia Iniciar com Dados Brutos e escolha entre criar um menu de experimentos IDBac o tipo de dados a serem usados com o IDBac.Ao configurar a conversão e processamento de arquivos de dados, insira um nome descritivo para o experimento onde solicitado e clique na pasta de dados brutos e selecione a pasta apropriada. Em seguida, clique em Dados de processo. Depois de converter os arquivos e processá-los com o IDBac, navegue até o trabalho com a página de experimentos anteriores e selecione um experimento para trabalhar.Adicione informações sobre amostras usando o menu clique aqui para modificar o experimento selecionado. Insira informações na planilha autopovoada e pressione Salvar. Quando estiver pronto para iniciar a análise, certifique-se de que o experimento para trabalhar seja selecionado.Em seguida, selecione a análise de dados de proteínas. Na página de análise de dados proteicos, escolha as configurações de pico de pico e avalie os espectros proteicos das amostras através das parcelas espelhadas exibidas. Ajuste a porcentagem de réplicas nas quais um pico deve estar presente para que ele seja incluído para análise.Usando as parcelas espelhadas como orientação visual, ajuste o sinal para corte de ruído que retém os picos mais genuínos e o menor ruído observando que mais se replica em um valor de presença de pico percentual mais alto permitirá a seleção de um sinal mais baixo para corte de ruído. A seguir, especifique a massa inferior e superior para carregar cortes ditando a faixa de valores de massa dentro de cada espectro a ser usada em análise suplementar pelo IDBac. Na página de análise de dados de proteínas, selecione a guia Dendrogram para permitir o agrupamento de amostras em um dendrograma de acordo com as medidas de distância selecionadas pelo usuário e algoritmos de clustering.Clique em selecionar amostras no menu e siga as instruções para selecionar amostras a serem contidas na análise. Apenas amostras que contenham espectros proteicos serão exibidas dentro da caixa de amostras disponível. Use os valores padrão para os algoritmos de distância e clustering e selecione intensidades como a entrada.Para exibir os valores da bootstrap no dendrograma, digite um número entre dois e 1.000 sob botas. Para começar a personalizar o dendrograma, abra o menu de dendrograma. Para colorir as linhas do dendrograma, selecione clicar para modificar linhas e selecione as opções desejadas.Para traçar informações da planilha ao lado do dendrograma, selecione o botão incorporar informações sobre amostras. Isso abrirá um painel onde uma categoria se autopopovoará com base nos valores inseridos. Para inserir amostras de outro experimento, selecione o botão do menu inserir amostras de outro experimento e siga as instruções no painel recém-aberto.Prossiga para a página de análise de dados de pequenas moléculas para permitir a visualização de dados por meio de análise de componentes principais e redes de associação metabólica que usam redes bipartite para exibir a correlação de massa de pequenas moléculas para cobrar valores com amostras. Clique e arraste no dendrograma para destacar amostras selecionadas de interesse a serem analisadas. Se nenhuma amostra for destacada ou nenhum dendrograma de proteínas for criado, uma rede de associação metabólica de um subconjunto aleatório ou todas as amostras aparecerão, respectivamente.Para subtrair uma mídia de matriz em branco na rede de associação metabólica, abra o menu selecione uma amostra para subtrair e escolha a amostra apropriada para usar em branco. Abra as configurações do menu show/hide MAN para selecionar os valores desejados para uma porcentagem de presença máxima e replicar, sinalizar para ruídos e cortes de massa superior e inferior. Use as pequenas parcelas espelhadas de moléculas para orientar a seleção dessas configurações.Para relatar resultados, copie o texto dentro das sugestões de relatórios do parágrafo de análise man para fornecer ao usuário configurações definidas usadas para gerar rede de associação metabólica criada. Seis cepas de Micromonospora chokoriensis e duas manchas de subtilis Bacillus foram analisadas utilizando dados do software IDBac. Seguindo as instruções na inicialidade com a guia de dados brutos, a opção clique aqui para converter arquivos Bruker e o IDBac fornecido instruções foram seguidas para cada conjunto de dados.Para as etapas de pico de conversão e pré-processamento automatizadas, um experimento combinado de IDBac foi criado transferindo amostras de Bacillus e Micromonospora dos dois experimentos para um único experimento. A análise resultante envolveu a comparação de espectros proteicos usando parcelas espelhadas que foram úteis para avaliar a qualidade dos espectros e ajustar as configurações de pico de pico. Uma captura de tela dos resultados de agrupamento de proteínas com configurações padrão selecionadas é mostrada aqui.O dendrograma foi colorido ajustando o limiar da trama. Note-se que a clara separação entre gêneros com M.chokoriensis e B.subtilis isola agrupamento separadamente. Ao clicar e arrastar através do dendrograma de proteína, foi possível criar rapidamente redes de associação metabólica para comparar apenas as cepas de B.subtilis, apenas as cepas de M.chokoriensis, e todas as cepas simultaneamente.A função primária dessas redes é fornecer aos pesquisadores uma visão geral ampla do grau de sobreposição metabólica especializada entre bactérias. Ao trabalhar com novos dados, use os gráficos espelhados do IDBac para garantir que seus dados fazem sentido e os espectros sejam de alta qualidade. Avalie criticamente seu design experimental e resultados a cada passo.O IDBac permite que os pesquisadores construam pequenas e diversas bibliotecas de microrganismos para investigação posterior. Isso reduz consideravelmente os custos associados às bibliotecas microbianas tradicionalmente grandes e redundantes. Como o IDBac permite visualizar a sobreposição metabólica especializada em grupos filogenéticos altamente semelhantes, ele pode ser usado para gerar questões de pesquisa e hipóteses que ligam dois campos tipicamente desconectados.O ácido fórmico é cáustico e deve ser manuseado em uma capa de fumaça química. Alguns isolados ambientais podem representar potenciais riscos à saúde e todas as cepas devem ser tratadas como nível dois de biossegurança.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Método para a identificação de molécula pequena inibidores da interacção proteína-proteína entre HCN1 e TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Bioquímica

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Avaliação da viabilidade de um consórcio bacteriano sintético na Interface Host-micróbio em Vitro Gut

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 em 1: uma etapa de purificação da afinidade para a análise paralela de proteína-proteína e proteína-metabólito complexos

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Revisão e ensaio de reparo de DNA usando extensão de nucleotídeo único e análise de espectrometria de massa MALDI-TOF

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Livre de calibração em Vitro quantificação da proteína Homo-oligomerização usando instrumentação comercial e livre, Open Source Software de análise de brilho

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Um pipeline de preparação de amostras para microcristais na linha de feixe VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Fazendo medições de FRET de molécula única precisas e precisas usando o smfBox de código aberto

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Processamento de amostras de proteômica de espingarda automatizada por um robô de laboratório de código aberto

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Coleta de dados crio-EM de partícula única com inclinação do estágio usando Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...