Name: using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data
Uploaded: 2019-05-15T13:00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальным институтом общих медицинских наук Грант R01 GM125943, National Geographic Грант CP-044R-17; Исландский исследовательский фонд Грант 152336-051; и Иллинойский университет в Чикаго стартап-фондов. Кроме того, мы благодарим следующих участников: д-р Аманда Булман за помощь в приобретении белка MALDI-TOF MS; Д-р Терри Мур и д-р Атул Джайн для рекристаллизации альфа-циано-4-гидроксициннамической кислотной матрицы (CHCA).

<ol>
	<li>Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+TOF+MS+profiling+of+bacteria+at+the+strain+level:+A+review.">MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review.</a> Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).</li><li>Cain, T. C., Lubman, D. M., Weber, W. J., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+bacteria+using+protein+profiles+from+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Differentiation of bacteria using protein profiles from matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8 (12), 1026-1030 (1994).</li><li>Holland, R. D., Wilkes, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+intact+whole+bacteria+based+on+spectral+patterns+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+with+time-of-flight+mass+spectrometry.">Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 10 (10), 1227-1232 (1996).</li><li>Rahi, P., Prakash, O., Shouche, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass-spectrometry+(MALDI-TOF+MS)+based+microbial+identifications:+challenges+and+scopes+for+microbial+ecologists.">Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass-spectrometry (MALDI-TOF MS) based microbial identifications: challenges and scopes for microbial ecologists.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1359 (2016).</li><li>Silva, R., Lopes, N. P., Silva, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+MALDI+mass+spectrometry+in+natural+products+analysis.">Application of MALDI mass spectrometry in natural products analysis.</a> Planta Medica. 82, 671-689 (2016).</li><li>Clark, C. M., Costa, M. S., Sanchez, L. M., Murphy, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+MALDI-TOF+mass+spectrometry+protein+and+specialized+metabolite+analyses+to+rapidly+discriminate+bacterial+function.">Coupling MALDI-TOF mass spectrometry protein and specialized metabolite analyses to rapidly discriminate bacterial function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4981-4986 (2018).</li><li>Freiwald, A., Sauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+classification+and+identification+of+bacteria+by+mass+spectrometry.">Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 4 (5), 732-742 (2009).</li><li>Schulthess, B., Bloemberg, G. V., Zbinden, R., B&#246;ttger, E. C., Hombach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Bruker+MALDI+Biotyper+for+identification+of+Gram-positive+rods:+development+of+a+diagnostic+algorithm+for+the+clinical+laboratory.">Evaluation of the Bruker MALDI Biotyper for identification of Gram-positive rods: development of a diagnostic algorithm for the clinical laboratory.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1089-1097 (2014).</li><li>Schumann, P., Maier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+mass+spectrometry+applied+to+classification+and+identification+of+bacteria.">MALDI-TOF mass spectrometry applied to classification and identification of bacteria.</a> Methods in Microbiology. 41, 275-306 (2014).</li><li>Chambers, M. C., Maclean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics.">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534 (2008).</li><li>Martens, L., Chambers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mzML-a+community+standard+for+mass+spectrometry+data.">mzML-a community standard for mass spectrometry data.</a> Molecular &#38; Cellular Proteomics. 10 (1), (2011).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Протокол IDBac детализирует бактериальный белок и специализированные метаболитные данные по сбору и анализу до 384 бактериальных изолятов в 4 ч одним исследователем. С IDBac нет необходимости извлекать ДНК из бактериальных изолятов или генерировать специализированные экстракты метаболита из жидкого брожения бульонов и анализировать их с помощью хроматографических методов. Вместо этого, белок и специализированные данные метаболита собираются просто распространяя материал из бактериальных колоний непосредственно на целевую пластину MALDI. Это значительно сокращает время и затраты, связанные с альтернативными методами, такимикак секвенирование генов 16S rRNA и LCMS 9.
Важно добавить в пластину MALDI матричные пустые и калибровочные пятна, и мы рекомендуем использовать соответствующее количество репликантов для обеспечения воспроизводимости и статистической достоверности. Количество репликатов будет зависеть от экспериментов. Например, если пользователь намеревается отличить тысячи колоний от коллекции тарелок экологического разнообразия, может потребоваться меньше репликаторов (наша лаборатория собирает три технических реплика на одну колонию). Кроме того, если пользователь хочет создать пользовательскую базу данных штаммов от конкретных бактериальных таксонов для быстрого определения подвидов классификаций неизвестных изолятов, то больше репликаций являются целесообразными (наша лаборатория собирает восемь биологических репликаторов на деформации).
IDBac является инструментом для быстрой дифференциализации высоко связанных бактериальных изолятов на основе ожидаемой таксономической информации и специализированного производства метаболитов. Он может дополнять или служить предшественником ортогональных методов, таких как углубленный генетический анализ, исследования, связанные с производством и функцией метаболита, или характеристика специализированной структуры метаболита с помощью ядерной магнитно-резонансной спектроскопии и/или LC-MS/MS.
Специализированное производство метаболитов (IDBac MANs) очень восприимчиво к бактериальным условиям роста, особенно с использованием различных носителей, что является потенциальным ограничением метода. Однако эти черты могут быть использованы пользователем, так как IDBac может легко генерировать MANs, показывающие различия в специализированном производстве метаболитов в различных условиях роста. Важно отметить, что в то время как специализированные метаболитовые отпечатки пальцев могут варьироваться в зависимости от состояния роста, мы ранее показали, что отпечатки белка остаются относительно стабильными по этим переменным (см. Clark et al.6). При работе с тарелость разнообразия окружающей среды, мы рекомендуем очищать бактериальные изоляты до анализа, чтобы уменьшить возможные вклады от соседних бактериальных перекрестных разговоров.
Наконец, отсутствие поисковой общедоступной базы данных отпечатков пальцев белка MS является одним из основных недостатков в использовании этого метода для классификации неизвестных экологических бактерий. Мы создали IDBac с учетом этого и включили автоматизированное преобразование данных в общепринятый формат с открытым исходным кодом (mzML)10,11,12 и разработали программное обеспечение, позволяющее осуществлять поиск, обмен и создание пользовательские базы данных. Мы находимся в процессе создания большой публичной базы данных (10 000 полностью охарактеризованных штаммов), которая позволит классифицировать некоторые изоляты на уровне видов, включая ссылки на номера присоединений GenBank при наличии.
IDBac является открытым исходным кодом, и код доступен для всех, чтобы настроить свои потребности анализа данных и визуализации. Мы рекомендуем пользователям проконсультироваться с обширным объемомлитературы (Sauer et al. 7, Silva et al.5),чтобы помочь поддержать и разработать свои экспериментальные цели. Мы проводим форум для обсуждения по адресу: https://groups.google.com/forum/#!forum/idbac и средства для сообщения о проблемах с программным обеспечением по адресу: https://github.com/chasemc/IDBacApp/issues.

Основным препятствием для исследователей, изучающих бактериальную функцию, является способность быстро и одновременно оценивать таксономическую идентичность микроорганизма и его способность производить специализированные метаболиты. Это предотвратило значительные достижения в понимании взаимосвязи между бактериальной филогенией и специализированным производством метаболитов в большинстве бактерий, изолированных от окружающей среды. Хотя MS-методы, которые используют отпечатки пальцев белка для группы и выявления бактерий хорошо описаны1,2,3,4, эти исследования, как правило, были выполнены на небольших группах изолятов, в видовой манере. Важно отметить, что информация о специализированном производстве метаболитов, который является основным фактором микробной функции в окружающей среде, в этих исследованиях остается неинкорпорированной. Сильва и др.5 недавно представили всеобъемлющую историю с подробным описанием недостаточного использования MALDI-TOF MS для анализа специализированных метаболитов и нехватки программного обеспечения для облегчения текущих узких мест биоинформатики. Для устранения этих недостатков мы создали IDBac, конвейер биоинформатики, который интегрирует как линейные,так и отражающие режимы MALDI-TOF MS 6. Это позволяет пользователям быстро визуализировать и дифференцировать бактериальные изоляты на основе белка и специализированных метаболитных MS отпечатков пальцев, соответственно.
IDBac является экономически эффективным, высокой пропускной записи, и предназначен для неспециалистов. Он находится в свободном доступе (chasemc.github.io/IDBac) и требует доступа только к масс-спектрометру MALDI-TOF (режим отражательного режима потребуется для специализированного метаболита). Подготовка образцов основывается на простомметоде "расширенной прямой передачи" 7,8 иданные собираются с последовательными линейными и отражательными приобретениями на одном месте MALDI-целевой. С помощью IDBac можно проанализировать предохранение от филогении и специализированного производства метаболитов в сотнях колоний менее чем за четыре часа, включая подготовку образцов, получение данных и визуализацию данных. Это представляет собой значительное временное и затратное преимущество по сравнению с традиционными методами выявления бактерий (таких как секвенирование генов) и анализа метаболического выхода (жидкой хроматографии-масс-спектрометрии (LCMS) и аналогичных хроматографических методов).
Используя данные, полученные в линейном режиме анализа, IDBac использует иерархическую кластеризацию для представления родственности белковых спектров. Поскольку спектры в основном представляют ионизированные рибосомные белки, они обеспечивают представление филогенетического разнообразия, присутствующее в образце. Кроме того, IDBac включает данные отражательного режима для отображения специализированных метаболитных отпечатков пальцев в виде сетей метаболитной ассоциации (MANs). MAN представляют собой двухсторонние сети, которые позволяют легко визуализировать совместное и уникальное производство метаболитов между бактериальными изолятами. Платформа IDBac позволяет исследователям анализировать как белковые, так и специализированные метаболитовые данные в тандеме, но также индивидуально, если приобретен только один тип данных. Важно отметить, что IDBac обрабатывает необработанные данные с инструментов Bruker и Xiamen, а также txt, tab, csv, mzXML и mzML. Это устраняет необходимость ручного преобразования и форматирования наборов данных и значительно снижает риск ошибки пользователя или неправильного обращения с данными MS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>60-002-65</td>
			<td>LC-MS Ultra CHROMASOLV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex Speed LEF MALDI-TOF instrument</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics Bacterial test standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0884024</td>
			<td>Bruker Daltonics 8604530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Peptide Calibration standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9846988</td>
			<td>Bruker Daltonics 8206195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>99.5+%, Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target Plate</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-500</td>
			<td>Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any is ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC293810010</td>
			<td>99.5%, for biochemistry, ACROS Organics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>28166-41-8</td>
			<td>(C2020-25G) &#8805;98% (TLC), powder</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data

Для того, чтобы визуализировать связь между бактериальной филогенией и специализированным производством метаболитов бактериальных колоний, растущих на питательном агаре, мы разработали IDBac – недорогой и высокопроизводительный матричной матрицы при поддержке лазерной дезорпации/ионизации биоинформатика времен полета (MALDI-TOF MS). Программное обеспечение IDBac предназначено для неспециалистов, находится в свободном доступе и способно анализировать от нескольких до тысяч бактериальных колоний. Здесь мы представляем процедуры для подготовки бактериальных колоний для анализа MALDI-TOF MS, операции MS прибора, а также обработки и визуализации данных в IDBac. В частности, мы проинструктируем пользователей, как группировать бактерии в дендрограммы на основе отпечатков пальцев белка MS и интерактивно создавать метаболитассоциации сетей (MANs) из специализированных данных метаболита.

Мы проанализировали шесть штаммов Micromonospora chokoriensis и два штамма Bacillus subtilis, которые ранее были охарактеризованы6, используя данные, имеющиеся в DOI: 10.5281/zenodo.2574096. Следуя указаниям в вкладке «Начало с необработанными данными», мы выбрали опцию Нажмите здесь, чтобы преобразовать файлы Bruker, и следовали инструкциям, предоставленным IDBac для каждого набора данных (рисунок14).
После завершения автоматизированной конверсии и предварительной обработки/пик-пиковых шагов, мы приступили к созданию нового комбинированного эксперимента IDBac путем переноса образцов из двух экспериментов в один эксперимент, содержащий как Bacillus, так и Образцы микромоносопора (рисунок 15). Полученный анализ включал в себя сравнение белковых спектров с использованием зеркальных участков, как показано на рисунке 16, который был полезен для оценки качества спектров и корректировки параметров пикового выбора. На рисунке 17 отображается скриншот результатов кластеризации белков с выбранными настройками по умолчанию. Дендрограмма была окрашена путем регулировки порога на участке (появляется как пунктирная линия). Следует отметить четкое разделение между родами, с м. chokoriensis и B. subtilis изолирует кластеризации отдельно.
Рисунок 18, Рисунок 19, и Рисунок 20 выделить способность генерировать MANs выбранных пользователем регионов, нажав и перетаскивая через дендрограмму белка. При этом мы смогли быстро создать MANs сравнить только штаммов B. subtilis (рисунок18), только штаммы M. chokoriensis (рисунок19), и все штаммы одновременно (Рисунок 20). Основная функция этих сетей заключается в предоставлении исследователям широкого обзора степени специализированного перекрытия метаболита между бактериями. С этими данными в руках, исследователи теперь имеют возможность принимать обоснованные решения только из небольшого количества материала Царапины из бактериальной колонии.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2.jpg"> Рисунок 14: Спектробработка. Загруженные спектры Bruker autoFlex были преобразованы и обработаны с помощью IDBac. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2.jpg"> Рисунок 15: Комбинированный эксперимент IDBac. Поскольку спектры Micromonospora и Bacillus были собраны на различных целевых пластинах MALDI, эти два эксперимента были впоследствии объединены в один эксперимент - "Bacillus"Micromonsopora". Это было сделано в рамках вкладки "Работа с предыдущими экспериментами", следуя указаниям в меню "Передача образцов из предыдущих экспериментов в новые/другие эксперименты". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 16" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2.jpg"> Рисунок 16: Сравнение. Микромонспора и спектры Bacillus были сопоставлены с использованием зеркальных участков на странице "Анализ данных о белках". В конечном счете были выбраны пиковые настройки по умолчанию. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 17" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2.jpg"> Рисунок 17: Иерархическая кластеризация. Иерархическая кластеризация с использованием параметров по умолчанию правильно сгруппировала изоляты Bacillus и Micromonospora. Дендрограмма была окрашена путем "резки" дендрограммы на произвольной высоте (отображается как пунктирной линии) и 100 загрузок, используемых, чтобы показать уверенность в ветвянии. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 18" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2.jpg"> Рисунок 18: MAN, созданный путем выбора штаммов Bacillus sp. из белковой дендрограммы, показал дифференциальную выработку специализированных метаболитов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 19" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2.jpg"> Рисунок 19: MAN, созданный путем выбора шести штаммов Micromonospora sp. из белковой дендрограммы, показали дифференциальную выработку специализированных метаболитов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 20" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2.jpg"> Рисунок 20: MAN Bacillus sp. и Micromonospora sp. штаммы, показывающие дифференциальную выработку специализированных метаболитов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data at JoVE.com

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

IDBac является открытым исходным кодом масс-спектрометрии основе биоинформатики трубопровода, который объединяет данные из нетронутых белков и специализированных метаболитов спектра, собранные на клеточном материале Царапины из бактериальных колоний. Трубопровод позволяет исследователям быстро организовать сотни до тысячи бактериальных колоний в таксономические группы, и далее дифференцировать их на основе специализированного производства метаболита.

Использование трубопровода MALDI TOF-MS IDBac с открытым исходным кодом для анализа микробного белка и специализированных метаболитных данных

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

IDBac пары массового спецификации данных из белка и специализированных метаболита регионов неизвестных бактериальных изолятов быстро различать изоляты на основе их идентичности и их потенциальной экологической функции. Наше программное обеспечение для источников в офисе расширяет возможности существующих стратегий идентификации микробов на основе MALDI TOF. Это расширение включает в себя анализ специализированного метаболизма в качестве дополнительного способа дифференцировать между колониями с аналогичными фенотипами.Одной из основных проблем в характеристике неизвестных микроорганизмов является различие тесно связанных изолятов. IDBac предоставляет исследователям простой и быстрый способ характеристики изолятов через белок и небольшое профилирование молекул. IDBac обеспечивает визуальное сравнение специализированного производства метаболита в бактериальной выборке и может дать представление о широком спектре тем исследований от экологических исследований до открытия свинца препарата.Существует множество способов, с помощью которых данные MALDI могут быть сохранены между инструментами и между ними. Если у вас возникли проблемы с получением файлов для работы с IDBac, отправьте вопрос на GitHub IDBac. Используя стерильную зубочистку, перенесите небольшую часть бактериальной колонии в соответствующее место на чистой пластине MALDI.Распространение бактериальной колонии равномерно над пятном, чтобы пятно появляется как плоский, как это возможно. Наложить один микролитер 70%массы спектрометрии класса formic кислоты на образец и матрицы контрольных точек и позволяют кислоты высохнуть в химическом капоте дыма. Далее добавьте один микролитер ранее подготовленного матричного решения MALDI в выборку и матричные точки управления мультимедиа и дайте воздуху высохнуть полностью.После установки масс-спектрометра MALDI TOF приобретем спектры. Сохраните белковые спектры в одной папке и специализированные метаболитные спектры во второй отдельной папке. Чтобы начать эту процедуру, загрузите программное обеспечение IDBac.Дважды щелкните загруженный install_idbac чтобы инициировать установку. Следующий двойной щелчок IDBac ярлык рабочего стола для запуска IDBac, который откроется на вкладке введения по умолчанию. Нажмите на вкладку «Начиная с необработанных данных» и выберите из меню эксперимента IDBac тип данных, которые будут использоваться с IDBac.При настройке преобразования и обработки файлов данных ввемите описательное имя для эксперимента, где предложено и нажмите на папку необработанных данных и выберите соответствующую папку. Затем нажмите на process Data. После преобразования файлов и обработки их с ПОМОЩЬю IDBac перейдите на страницу работы с предыдущими экспериментами и выберите эксперимент для работы.Добавьте информацию о образцах, использующих меню, нажмите здесь, чтобы изменить выбранный эксперимент. Ввод информации в аутопопулярную электронную таблицу и нажмите Сохранить. Когда готовы начать анализ, убедитесь, что эксперимент для работы с выбран.Затем выберите анализ данных о белках. На странице анализа данных белка выберите пиковые параметры пика и оцените белковые спектры образцов с помощью отображаемых зеркальных участков. Отрегулируйте процент репликаций, в которых должен присутствовать пик, чтобы он был включен для анализа.Используя зеркальные участки в качестве визуального наведения, отрегулируйте сигнал к шумовому вырезу, который сохраняет самые подлинные пики и наименьшее количество шума, унося, что больше репликаций в более высоком процентном пиковом значении присутствия позволит получить более низкий сигнал для отсечения шума. После этого укажите нижнюю и верхнюю массу для зарядки отсечения, диктуя диапазон массовых значений в каждом спектре, который будет использоваться в дальнейшем анализе IDBac. На странице анализа данных белка выберите вкладку Dendrogram для группирования образцов в дендрограмму в соответствии с выбранными пользователем мерами расстояния и алгоритмами кластеризации.Нажмите на отдельные образцы в меню и следуйте инструкциям по выбору образцов для включения в анализ. Только образцы, содержащие белковые спектры, будут отображаться в доступной коробке образцов. Используйте значения по умолчанию для алгоритмов расстояния и кластеризации и выберите интенсивности в качестве ввода.Чтобы отобразить значения загрузки на дендрограмме, введите число от двух до 1000 под загрузок. Чтобы начать настройку дендрограммы, откройте меню дендрограммы. Чтобы раскрасить линии дендрограммы, выберите нажмите, чтобы изменить линии и выбрать нужные варианты.Для построения информации из электронной таблицы рядом с дендрограммой, выберите кнопку включить информацию о образцах. Это откроет панель, где категория будет самостоятельной заполнения на основе введенных значений. Чтобы вставить образцы из другого эксперимента, выберите кнопку меню вставки образцов из другого эксперимента и следуйте указаниям в недавно открытой панели.Перейти к небольшой странице анализа данных молекулы, чтобы визуализация данных по принципу анализа компонентов и метаболических сетей ассоциации, которые используют двухпартийные сети для отображения корреляции малой массы молекулы для зарядки значений с образцами. Нажмите и перетащите дендрограмму, чтобы выделить отдельные образцы, представляющие интерес для анализа. Если не выделены образцы или не было создано протеиновой дендрограммы, то появится сеть метаболита либо случайного подмножества, либо всех образцов соответственно.Чтобы вычесть матричный пробел в сети ассоциации метаболита, откройте меню, выберите образец для вычитания и выберите подходящий образец для использования в качестве пробела. Откройте настройки меню show/hide MAN, чтобы выбрать нужные значения для процента пикового присутствия и репликации, сигнала к шуму и верхних и нижних отрубов массы. Используйте небольшие зеркальные участки молекулы, чтобы направлять выбор этих параметров.Для получения результатов отчетности скопировать текст в предложениях по представлению пункта анализа MAN для предоставления пользователям определенных настроек, используемых для создания созданной сети метаболических ассоциаций. Шесть штаммов Micromonospora chokoriensis и два пятна Bacillus subtilis были проанализированы с использованием данных в программном обеспечении IDBac. Следуя указаниям в начале вкладки необработанных данных, была выбрана опция нажмите здесь, чтобы преобразовать файлы Bruker, и IDBac предоставил инструкции для каждого набора данных.Для автоматизированной конверсии и предварительной обработки пиковых этапов был создан комбинированный эксперимент IDBac путем переноса образцов Bacillus и Micromonospora из двух экспериментов в один эксперимент. Полученный анализ включает сравнение белковых спектров с использованием зеркальных участков, которые были полезны для оценки качества спектра и корректировки пиковых пиковых параметров. Скриншот результатов кластеризации белка с выбранными настройками по умолчанию показан здесь.Дендрограмма была окрашена путем корректировки порога на участке. Следует отметить четкое разделение между родами с M.chokoriensis и B.subtilis изолирует кластеризации отдельно. Нажав и перетащив белок дендрограммы, можно было быстро создать метаболические сети ассоциации, чтобы сравнить только штаммы B.subtilis, только штаммы M.chokoriensis, и все штаммы одновременно.Основная функция этих сетей заключается в том, чтобы предоставить исследователям широкий обзор степени специализированного метаболита перекрытия между бактериями. Работая с новыми данными, используйте зеркальные графики IDBac, чтобы убедиться, что ваши данные имеют смысл и спектры высокого качества. Критически оцените свой экспериментальный дизайн и результаты на каждом шагу.IDBac позволяет исследователям создавать небольшие и разнообразные библиотеки микроорганизмов для дальнейшего исследования. Это значительно снижает затраты, связанные с традиционно крупными и избыточными микробными библиотеками. Поскольку IDBac позволяет визуализировать специализированное метаболитное перекрытие в очень похожих филогенетических группах, он может быть использован для генерации исследовательских вопросов и гипотез, которые связывают два обычно отключенных поля.Formic кислота является едким и должны быть обработаны в химическом капоте дыма. Некоторые экологические изоляты могут представлять потенциальную опасность для здоровья, и все штаммы следует рассматривать как уровень биобезопасности два.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Способ идентификации низкомолекулярных соединений ингибиторов белок-белкового взаимодействия между HCN1 и TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Оценка жизнеспособности синтетических бактерий консорциума на интерфейсе в Vitro хост микробов кишечника

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 в 1: один шаг очищение сродства для параллельного анализа протеин протеина и белка метаболит комплексов

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Корректура и ДНК ремонт пробирного анализа единичных нуклеотидных расширение и MALDI-TOF масс-спектрометрии с помощью

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Калибровка бесплатно в Vitro количественная оценка белка гомо олигомеризации с использованием коммерческих приборов и свободным, открытым исходным кодом программное обеспечение для анализа яркости

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Конвейер пробоподготовки микрокристаллов на лучевой линии VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Проведение точных и точных одномолекулярных измерений FRET с помощью smfBox с открытым исходным кодом

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Обработка образцов протеомики дробовика автоматизирована лабораторным роботом с открытым исходным кодом

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Сбор данных о крио-ЭМ с одной частицей с наклоном ступени с помощью Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...