Name: using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data
Uploaded: 2019-05-15T13:00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales Grant R01 GM125943, National Geographic Grant CP-044R-17; Subvención 152336-051 del Fondo de Investigación de Islandia; y fondos de inicio de la Universidad de Illinois en Chicago. Además, agradecemos a los siguientes contribuyentes: la Dra. Amanda Bulman por la asistencia con los parámetros de adquisición de proteínas MALDI-TOF MS; Dr. Terry Moore y Dr. Atul Jain por recristalizar la matriz de ácido alfa-ciano-4-hidroxicinnamic (CHCA).

<ol>
	<li>Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+TOF+MS+profiling+of+bacteria+at+the+strain+level:+A+review.">MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review.</a> Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).</li><li>Cain, T. C., Lubman, D. M., Weber, W. J., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+bacteria+using+protein+profiles+from+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Differentiation of bacteria using protein profiles from matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8 (12), 1026-1030 (1994).</li><li>Holland, R. D., Wilkes, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+intact+whole+bacteria+based+on+spectral+patterns+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+with+time-of-flight+mass+spectrometry.">Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 10 (10), 1227-1232 (1996).</li><li>Rahi, P., Prakash, O., Shouche, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass-spectrometry+(MALDI-TOF+MS)+based+microbial+identifications:+challenges+and+scopes+for+microbial+ecologists.">Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass-spectrometry (MALDI-TOF MS) based microbial identifications: challenges and scopes for microbial ecologists.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1359 (2016).</li><li>Silva, R., Lopes, N. P., Silva, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+MALDI+mass+spectrometry+in+natural+products+analysis.">Application of MALDI mass spectrometry in natural products analysis.</a> Planta Medica. 82, 671-689 (2016).</li><li>Clark, C. M., Costa, M. S., Sanchez, L. M., Murphy, B. 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C., Maclean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics.">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534 (2008).</li><li>Martens, L., Chambers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mzML-a+community+standard+for+mass+spectrometry+data.">mzML-a community standard for mass spectrometry data.</a> Molecular &#38; Cellular Proteomics. 10 (1), (2011).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo IDBac detalla la adquisición y análisis de datos de proteínas bacterianas y metabolitos especializados de hasta 384 aislados bacterianos en 4 h por un solo investigador. Con IDBac no hay necesidad de extraer ADN de aislados bacterianos o generar extractos de metabolitos especializados de caldos de fermentación líquida y analizarlos utilizando métodos cromatográficos. En su lugar, los datos de proteínas y metabolitos especializados se recopilan simplemente esparciendo material de colonias bacterianas directamente en una placa diana maldi. Esto reduce en gran medida el tiempo y el costo asociados con técnicasalternativas como la secuenciación del gen 16S rRNA y LCMS 9.
Es importante añadir una matriz en blanco y puntos de calibración a la placa MALDI, y recomendamos utilizar un número adecuado de réplicas para garantizar la reproducibilidad y la confianza estadística. El número de réplicas dependerá del experimento. Por ejemplo, si un usuario tiene la intención de diferenciar miles de colonias de una colección de placas de diversidad ambiental, pueden ser necesarias menos réplicas (nuestro laboratorio recoge tres réplicas técnicas por colonia). Alternativamente, si un usuario desea crear una base de datos personalizada de cepas de taxones bacterianos específicos para determinar rápidamente las clasificaciones de subespecies de aislados desconocidos, entonces más réplicas son apropiadas (nuestro laboratorio recoge ocho réplicas biológicas por tensión).
IDBac es una herramienta para diferenciar rápidamente aislados bacterianos altamente relacionados basados en información taxonómica putativa y la producción especializada de metabolitos. Puede complementar o servir como precursor de métodos ortogonales tales como análisis genéticos en profundidad, estudios que implican la producción y función de metabolitos, o la caracterización de la estructura de metabolitos especializados por espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear y/o LC-MS/MS.
La producción especializada de metabolitos (IDBac MANs) es altamente susceptible a las condiciones de crecimiento bacteriano, especialmente utilizando diferentes medios, que es una limitación potencial del método. Sin embargo, estos rasgos pueden ser explotados por el usuario, como IDBac puede generar fácilmente MANs mostrando las diferencias en la producción especializada de metabolitos bajo una variedad de condiciones de crecimiento. Es importante tener en cuenta que si bien las huellas dactilares de metabolitos especializados pueden variar según la condición de crecimiento, hemos demostrado previamente que las huellas dactilares de proteínas permanecen relativamente estables en estas variables (véase Clark et al.6). Cuando se trata de placas de diversidad ambiental, recomendamos purificar los aislados bacterianos antes del análisis con el fin de reducir las posibles contribuciones de la conversación cruzada bacteriana vecina.
Por último, la falta de una base de datos pública en la que se pueden realizar búsquedas de huellas dactilares de la proteína MS es una deficiencia importante en el uso de este método para clasificar bacterias ambientales desconocidas. Creamos IDBac con esto en mente, e incluimos la conversión automatizada de datos en un formato de código abierto aceptado por la comunidad (mzML)10,11,12 y diseñamos el software para permitir la búsqueda, el intercambio y la creación de bases de datos personalizadas. Estamos en proceso de crear una gran base de datos pública (>10.000 cepas plenamente caracterizadas), lo que permitirá la clasificación de algunos aislados a nivel de especie, incluyendo enlaces a números de adhesión de GenBank cuando estén disponibles.
IDBac es de código abierto y el código está disponible para que cualquiera pueda personalizar sus necesidades de análisis y visualización de datos. Recomendamos que los usuarios consulten un amplio cuerpo de literatura (Sauer et al.7, Silva et al.5) para ayudar a apoyar y diseñar sus objetivos experimentales. Organizamos un foro de discusión en: https://groups.google.com/forum/#!forum/idbac y un medio para informar de problemas con el software en: https://github.com/chasemc/IDBacApp/issues.

Una barrera importante para los investigadores que estudian la función bacteriana es la capacidad de evaluar rápida y simultáneamente la identidad taxonómica de un microorganismo y su capacidad para producir metabolitos especializados. Esto ha evitado avances significativos en la comprensión de la relación entre la filogenia bacteriana y la producción especializada de metabolitos en la mayoría de las bacterias aisladas del medio ambiente. Aunque los métodos basados en MS que utilizan huellas dactilares de proteínas para agrupar e identificar bacterias están bien descritos1,2,3,4, estos estudios se han realizado generalmente en pequeños grupos de aislados, de una manera específica de cada especie. Es importante destacar que la información sobre la producción especializada de metabolitos, un importante impulsor de la función microbiana en el medio ambiente, ha permanecido sin incorporarse en estos estudios. 5 recientemente proporcionaron una historia completa que detalla el uso bajo de MALDI-TOF MS para analizar metabolitos especializados y la escasez de software para aliviar los cuellos de botella bioinformáticos actuales. Para abordar estas deficiencias, creamos IDBac, una canalización bioinformática que integra los modos linealy reflectron de MALDI-TOF MS 6. Esto permite a los usuarios visualizar y diferenciar rápidamente los aislados bacterianos basados en las huellas dactilares de la BIÓ de proteínas y metabolitos especializados, respectivamente.
IDBac es rentable, de alto rendimiento y está diseñado para el usuario laico. Está disponible libremente (chasemc.github.io/IDBac), y sólo requiere acceso a un espectrómetro de masas MALDI-TOF (se requerirá el modo de reflejo para el análisis especializado de metabolitos). La preparación de la muestra se basa en el método simple de "transferencia directa extendida"7,8 y los datos se recopilan con adquisiciones lineales y de reflectron consecutivas en un único punto de destino maldiva. Con IDBac, es posible analizar la filogenia putativa y la producción especializada de metabolitos de cientos de colonias en menos de cuatro horas, incluyendo la preparación de muestras, la adquisición de datos y la visualización de datos. Esto presenta una ventaja significativa de tiempo y costo sobre los métodos tradicionales de identificación de bacterias (como la secuenciación de genes) y el análisis de la producción metabólica (cromatografía líquida-espectrometría de masas [LCMS] y métodos cromatográficos similares).
Utilizando datos obtenidos en el análisis en modo lineal, IDBac emplea clustering jerárquico para representar la relación de los espectros de proteínas. Dado que los espectros representan principalmente proteínas ribosomales ionizadas, proporcionan una representación de la diversidad filogenética presente en una muestra. Además, IDBac incorpora datos de modo reflectron para mostrar huellas dactilares de metabolitos especializados como redes de asociación de metabolitos (MÁN). Las MAN son redes bipartitas que permiten una fácil visualización de la producción de metabolitos compartidos y únicos entre aislados bacterianos. La plataforma IDBac permite a los investigadores analizar los datos de proteínas y metabolitos especializados en tándem, pero también individualmente si solo se adquiere un tipo de datos. Es importante destacar que IDBac procesa datos sin procesar de instrumentos Bruker y Xiamen, así como txt, tab, csv, mzXML y mzML. Esto elimina la necesidad de conversión manual y formato de conjuntos de datos, y reduce significativamente el riesgo de error del usuario o mal manejo de los datos de MS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>60-002-65</td>
			<td>LC-MS Ultra CHROMASOLV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex Speed LEF MALDI-TOF instrument</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics Bacterial test standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0884024</td>
			<td>Bruker Daltonics 8604530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Peptide Calibration standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9846988</td>
			<td>Bruker Daltonics 8206195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>99.5+%, Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target Plate</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-500</td>
			<td>Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any is ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC293810010</td>
			<td>99.5%, for biochemistry, ACROS Organics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>28166-41-8</td>
			<td>(C2020-25G) &#8805;98% (TLC), powder</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data

Con el fin de visualizar la relación entre la filogenia bacteriana y la producción especializada de metabolitos de colonias bacterianas que crecen en agar nutritivo, desarrollamos IDBac, una desorción/ionización asistida por matriz de bajo costo y alto rendimiento bioinformática de espectrometría de masas de tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS). El software IDBac está diseñado para no expertos, está disponible libremente y es capaz de analizar algunas o miles de colonias bacterianas. Aquí, presentamos procedimientos para la preparación de colonias bacterianas para el análisis de MS MALDI-TOF, operación de instrumentos MS y procesamiento y visualización de datos en IDBac. En particular, instruimos a los usuarios cómo agrupar bacterias en dendrogramas basados en huellas dactilares de LA proteína MS y crear interactivamente redes de asociación de metabolitos (MAN) a partir de datos de metabolitos especializados.

Analizamos seis cepas de Micromonospora chokoriensis y dos cepas de Bacillus subtilis,que anteriormente se caracterizaron6,utilizando los datos disponibles en DOI: 10.5281/zenodo.2574096. Siguiendo las instrucciones en la pestaña Comenzando con datos sin procesar, seleccionamos la opción Haga clic aquí para convertir archivos Bruker y seguimos las instrucciones proporcionadas por IDBac para cada conjunto de datos (Figura14).
Después de que se completaron los pasos automatizados de conversión y preprocesamiento/pico, procedimos a crear un nuevo experimento combinado de IDBac transfiriendo muestras de los dos experimentos a un solo experimento que contiene tanto Bacillus como Muestras de micromonosoporas (Figura15). El análisis resultante implicó comparar espectros de proteínas utilizando gráficas de espejo, como se muestra en la Figura 16,que fue útil para evaluar la calidad de los espectros y ajustar la configuración de selección de picos. La Figura 17 muestra una captura de pantalla de los resultados de agrupación en clústeres de proteínas con la configuración predeterminada seleccionada. El dendrograma se coloreó ajustando el umbral en el trazado (aparece como una línea punteada). Cabe destacar la clara separación entre géneros, con M. chokoriensis y B. subtilis aíslan clustering por separado.
La Figura 18, la Figura 19y la Figura 20 resaltan la capacidad de generar MAN de regiones seleccionadas por el usuario haciendo clic y arrastrando a través del dendrograma de proteínas. Con esto pudimos crear rápidamente MANs para comparar sólo las cepas B. subtilis (Figura18), sólo las cepas M. chokoriensis (Figura19),y todas las cepas simultáneamente (Figura20). La función principal de estas redes es proporcionar a los investigadores una amplia visión general del grado de superposición de metabolitos especializados entre bacterias. Con estos datos en la mano, los investigadores ahora tienen la capacidad de tomar decisiones informadas a partir de sólo una pequeña cantidad de material raspado de una colonia bacteriana.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2.jpg"> Figura 14: Procesamiento de espectros. Los espectros de Bruker autoFlex descargados se convirtieron y procesaron con IDBac. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2.jpg"> Figura 15: Experimento IDBac combinado. Debido a que los espectros Micromonospora y Bacillus fueron recogidos en diferentes placas de destino MALDI, los dos experimentos se combinaron posteriormente en un solo experimento: "Bacillus_Micromonsopora". Esto se hizo dentro de la pestaña "Trabajar con experimentos anteriores", siguiendo las instrucciones dentro del menú "Transferir muestras de experimentos anteriores a experimentos nuevos /otros". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 16" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2.jpg"> Figura 16: Comparación. Micromonspora y Bacillus spectra se compararon utilizando las gráficas de espejo dentro de la página "Análisis de datos de proteínas". En última instancia, se eligieron los ajustes de pico predeterminados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 17" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2.jpg"> Figura 17: Agrupación jerárquica. La agrupación jerárquica, utilizando la configuración predeterminada, agrupa correctamente bacillus y micromonospora se aísla. El dendrograma fue coloreado por "cortar" el dendrograma a una altura arbitraria (mostrada como una línea discontinua) y 100 bootstraps utilizados para mostrar confianza en la ramificación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 18" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2.jpg"> Figura 18: EL HOMBRE creado mediante la selección de las cepas de Bacillus sp. del dendrograma proteico mostró la producción diferencial de metabolitos especializados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 19" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2.jpg"> Figura 19: MAN creado mediante la selección de las seis cepas Micromonospora sp. del dendrograma proteico mostró la producción diferencial de metabolitos especializados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 20" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2.jpg"> Figura 20: MAN de Bacillus sp. y Micromonospora sp. cepas que muestran una producción diferencial de metabolitos especializados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

IDBac es una tubería bioinformática basada en espectrometría de masas de código abierto que integra datos de espectros de proteínas intactos y metabolitos especializados, recogidos en material celular raspado de colonias bacterianas. La tubería permite a los investigadores organizar rápidamente cientos a miles de colonias bacterianas en grupos taxonómicos putativos, y diferenciarlos aún más en función de la producción especializada de metabolitos.

Uso de la tubería de código abierto MALDI TOF-MS IDBac para el análisis de datos de proteínas microbianas y metabolitos especializados

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

IDBac empareja datos de especificaciones de masa de regiones proteicas y de metabolitos especializados de aislados bacterianos desconocidos para discriminar rápidamente entre los aislados en función tanto de su identidad como de su función ambiental potencial. Nuestro software de origen de oficina amplía la utilidad de las estrategias de identificación microbiana basadas en MALDI TOF existentes. Esta extensión incluye el análisis del metabolismo especializado como una forma adicional de diferenciar entre colonias con fenotipos similares.Un desafío importante en la caracterización de microorganismos desconocidos es distinguir los aislados estrechamente relacionados. IDBac proporciona a los investigadores una manera fácil y rápida de caracterizar los aislados a través del perfil de proteínas y moléculas pequeñas. IDBac proporciona una comparación visual de la producción especializada de metabolitos dentro de una muestra bacteriana y puede proporcionar información sobre una amplia gama de temas de investigación, desde estudios ecológicos hasta el descubrimiento de plomo de fármacos.Hay muchas maneras en que los datos MALDI se pueden guardar entre y entre los instrumentos. Si tiene problemas para conseguir que los archivos funcionen con IDBac, envíe un problema a GitHub de IDBac. Usando un palillo de dientes estéril, transfiera una pequeña porción de una colonia bacteriana al lugar apropiado en una placa MALDI limpia.Esparce la colonia bacteriana uniformemente sobre el punto para que el punto aparezca lo más plano posible. Superponga un microlitro de 70%ácido fórmico grado de espectrometría de masas en los puntos de control de la muestra y la matriz y permita que el ácido se seque al aire en una campana de humo química. A continuación, agregue un microlitro de solución de matriz MALDI previamente preparada a los puntos de control de medios de muestra y matriz y deje secar completamente al aire.Después de configurar el espectrómetro de masas MALDI TOF, adquiera los espectros. Guarde los espectros de proteínas en una carpeta y los espectros de metabolitos especializados en una segunda carpeta separada. Para comenzar este procedimiento, descargue el software IDBac.Haga doble clic en el install_idbac descargado para iniciar el instalador. A continuación, haga doble clic en el acceso directo del escritorio IDBac para iniciar IDBac que se abrirá en la pestaña de introducción de forma predeterminada. Haga clic en la pestaña Inicio con datos sin procesar y elija en el menú Crear un experimento IDBac el tipo de datos que se utilizarán con IDBac.Al configurar la conversión y el procesamiento de archivos de datos, introduzca un nombre descriptivo para el experimento en el que se le solicite y haga clic en la carpeta de datos sin procesar y seleccione la carpeta adecuada. A continuación, haga clic en Procesar datos. Después de convertir los archivos y procesarlos con IDBac, vaya a la página de trabajo con experimentos anteriores y seleccione un experimento con el que trabajar.Agregue información sobre ejemplos utilizando el menú, haga clic aquí para modificar el experimento seleccionado. Introduzca información en la hoja de cálculo rellenada automáticamente y pulse Guardar. Cuando esté listo para comenzar el análisis, asegúrese de que el experimento con el que trabajar está seleccionado.A continuación, seleccione el análisis de datos de proteínas. En la página de análisis de datos de proteínas, elija la configuración de pico máximo y evalúe los espectros de proteínas de las muestras a través de las gráficas de espejo mostradas. Ajuste el porcentaje de réplicas en las que debe estar presente un pico para que se incluya para el análisis.Usando las gráficas de espejo como guía visual, ajuste la señal al corte de ruido que conserva los picos más genuinos y el menor ruido teniendo en cuenta que más réplicas en un valor de presencia pico de mayor porcentaje permitirán la selección de una señal más baja al corte de ruido. Después de esto, especifique la masa inferior y superior para cargar los límites que dictan el rango de valores de masa dentro de cada espectro que IDBac utilizará en el análisis posterior. En la página de análisis de datos de proteínas, seleccione la pestaña Dendrograma para permitir agrupar muestras en un dendrograma según las medidas de distancia seleccionadas por el usuario y los algoritmos de agrupación en clústeres.Haga clic en Seleccionar muestras en el menú y siga las instrucciones para seleccionar las muestras que desea incluir en el análisis. Solo se mostrarán las muestras que contengan espectros de proteínas en la caja de muestras disponibles. Utilice los valores predeterminados para los algoritmos de distancia y agrupación en clústeres y seleccione las intensidades como entrada.Para mostrar los valores de arranque en el dendrograma, escriba un número entre dos y 1.000 en bootstraps. Para comenzar a personalizar el dendrograma, abra el menú ajustar el dendrograma. Para colorear las líneas del dendrograma, seleccione haga clic para modificar las líneas y seleccione las opciones deseadas.Para trazar información de la hoja de cálculo junto al dendrograma, seleccione el botón incorporar información sobre muestras. Esto abrirá un panel donde una categoría se autore rellenará en función de los valores introducidos. Para insertar muestras de otro experimento, seleccione el botón de menú para insertar muestras de otro experimento y siga las instrucciones del panel recién abierto.Proceda a la página de análisis de datos de moléculas pequeñas para permitir la visualización de datos por análisis de componentes principales y redes de asociación metabólica que utilizan redes bipartitos para mostrar la correlación de masa de moléculas pequeñas para cargar valores con muestras. Haga clic y arrastre el dendrograma para resaltar las muestras seleccionadas de interés que se analizarán. Si no se resalta ninguna muestra o no se ha creado ningún dendrograma de proteínas, aparecerá una red de asociación de metabolitos de un subconjunto aleatorio o de todas las muestras, respectivamente.Para restar un espacio en blanco de medios de matriz en la red de asociación de metabolitos, abra el menú seleccione una muestra para restar y elija la muestra adecuada para utilizarla como espacio en blanco. Abra el menú mostrar/ocultar la configuración de MAN para seleccionar los valores deseados para un porcentaje de presencia y réplica de pico, señal a ruido y cortes de masa superior e inferior. Utilice las gráficas de espejo de molécula pequeña para guiar la selección de estos ajustes.Para informar de los resultados, copie el texto dentro de las sugerencias para informar del párrafo de análisis DE MAN para proporcionar la configuración definida por el usuario utilizada para generar la red de asociación metabólica creada. Seis cepas de Micromonospora chokoriensis y dos manchas de Bacillus subtilis fueron analizadas utilizando datos en el software IDBac. Siguiendo las instrucciones en la pestaña de inicio con datos sin procesar, se seleccionó la opción haga clic aquí para convertir archivos Bruker y se siguieron las instrucciones proporcionadas por IDBac para cada conjunto de datos.Para los pasos de pico de recuperación y preprocesamiento automatizados, se creó un experimento IDBac combinado mediante la transferencia de muestras de Bacillus y Micromonospora de los dos experimentos a un solo experimento. El análisis resultante implicó comparar espectros de proteínas utilizando gráficas de espejo que fueron útiles para evaluar la calidad de los espectros y ajustar los ajustes de pico de pico. Aquí se muestra una captura de pantalla de los resultados de agrupación de proteínas con la configuración predeterminada seleccionada.El dendrograma se coloreó ajustando el umbral en la gráfica. Cabe destacar la clara separación entre géneros con M.chokoriensis y B.subtilis aislados agrupados por separado. Al hacer clic y arrastrar a través del dendrograma de proteínas, fue posible crear rápidamente redes de asociación metabólica para comparar sólo las cepas de B.subtilis, sólo las cepas M.chokoriensis, y todas las cepas simultáneamente.La función principal de estas redes es proporcionar a los investigadores una visión general del grado de superposición de metabolitos especializados entre bacterias. Cuando trabaje con nuevos datos, utilice las gráficas de espejo de IDBac para asegurarse de que sus datos tengan sentido y que los espectros sean de alta calidad. Evalúe críticamente su diseño experimental y sus resultados en cada paso.IDBac permite a los investigadores construir pequeñas y diversas bibliotecas de microorganismos para una investigación posterior. Esto reduce en gran medida los costos asociados con bibliotecas microbianas tradicionalmente grandes y redundantes. Dado que IDBac le permite visualizar la superposición de metabolitos especializados dentro de grupos filogenéticos muy similares, se puede utilizar para generar preguntas de investigación e hipótesis que vinculan dos campos típicamente desconectados.El ácido fórmico es cáustico y debe manipularse en una campana química. Algunos aislados ambientales pueden suponer riesgos potenciales para la salud y todas las cepas deben tratarse como niveles de bioseguridad dos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Método para la identificación de inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción proteína-proteína entre HCN1 y TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Investigación

Bioquímica

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Evaluar la viabilidad de un consorcio bacteriano sintético en la interfaz de Host-microbio In Vitro Gut

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 en 1: purificación de la afinidad para el análisis paralelo de proteínas y complejos de proteína-metabolito de un solo paso

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Revisión y análisis de la reparación de ADN usando análisis de extensión de un solo nucleótido y MALDI-TOF espectrometría de masa

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibración-libre In Vitro cuantificación de proteína Homo-Oligomerización utilizando instrumentación comercial y Software de análisis de brillo libre de código abierto

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Una tubería de preparación de muestras para microcristales en vmXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Realización de mediciones FRET precisas y precisas de una sola molécula utilizando el smfBox de código abierto

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Procesamiento de muestras de proteómica de escopeta automatizado por un robot de laboratorio de código abierto

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Recopilación de datos crio-EM de una sola partícula con inclinación de la etapa utilizando Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...