Name: using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data
Uploaded: 2019-05-15T13:00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data at JoVE.com

Detta arbete stöddes av nationella institutet för allmän medicinsk vetenskap Grant R01 GM125943, National Geographic Grant CP-044R-17; Isländska forskningsfonden Grant 152336-051; och University of Illinois at Chicago Startup Funds. Dessutom tackar vi följande bidragsgivare: Dr Amanda Bulman för hjälp med MALDI-TOF MS protein förvärvs parametrar; Dr Terry Moore och Dr Atul Jain för recrystallizing alfa-cyano-4-hydroxycinnamic Acid Matrix (CHCA).

<ol>
	<li>Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+TOF+MS+profiling+of+bacteria+at+the+strain+level:+A+review.">MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review.</a> Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).</li><li>Cain, T. C., Lubman, D. M., Weber, W. J., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+bacteria+using+protein+profiles+from+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Differentiation of bacteria using protein profiles from matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8 (12), 1026-1030 (1994).</li><li>Holland, R. D., Wilkes, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+intact+whole+bacteria+based+on+spectral+patterns+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+with+time-of-flight+mass+spectrometry.">Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 10 (10), 1227-1232 (1996).</li><li>Rahi, P., Prakash, O., Shouche, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass-spectrometry+(MALDI-TOF+MS)+based+microbial+identifications:+challenges+and+scopes+for+microbial+ecologists.">Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass-spectrometry (MALDI-TOF MS) based microbial identifications: challenges and scopes for microbial ecologists.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1359 (2016).</li><li>Silva, R., Lopes, N. P., Silva, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+MALDI+mass+spectrometry+in+natural+products+analysis.">Application of MALDI mass spectrometry in natural products analysis.</a> Planta Medica. 82, 671-689 (2016).</li><li>Clark, C. M., Costa, M. S., Sanchez, L. M., Murphy, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+MALDI-TOF+mass+spectrometry+protein+and+specialized+metabolite+analyses+to+rapidly+discriminate+bacterial+function.">Coupling MALDI-TOF mass spectrometry protein and specialized metabolite analyses to rapidly discriminate bacterial function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4981-4986 (2018).</li><li>Freiwald, A., Sauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+classification+and+identification+of+bacteria+by+mass+spectrometry.">Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 4 (5), 732-742 (2009).</li><li>Schulthess, B., Bloemberg, G. V., Zbinden, R., B&#246;ttger, E. C., Hombach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Bruker+MALDI+Biotyper+for+identification+of+Gram-positive+rods:+development+of+a+diagnostic+algorithm+for+the+clinical+laboratory.">Evaluation of the Bruker MALDI Biotyper for identification of Gram-positive rods: development of a diagnostic algorithm for the clinical laboratory.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1089-1097 (2014).</li><li>Schumann, P., Maier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+mass+spectrometry+applied+to+classification+and+identification+of+bacteria.">MALDI-TOF mass spectrometry applied to classification and identification of bacteria.</a> Methods in Microbiology. 41, 275-306 (2014).</li><li>Chambers, M. C., Maclean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics.">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534 (2008).</li><li>Martens, L., Chambers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mzML-a+community+standard+for+mass+spectrometry+data.">mzML-a community standard for mass spectrometry data.</a> Molecular &#38; Cellular Proteomics. 10 (1), (2011).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Den IDBac protokoll Detaljer bakteriella protein och specialiserade metabolit datainsamling och analys av upp till 384 bakteriella isolat i 4 h av en enda forskare. Med IDBac finns det ingen anledning att extrahera DNA från bakteriella isolat eller generera specialiserade metabolitextrakt från flytande fermenterings buljonger och analysera dem med hjälp av kromatografiska metoder. Istället, protein och specialiserade metabolit data samlas genom att helt enkelt sprida material från bakteriella kolonier direkt på en MALDI måltavla. Detta minskar kraftigt tiden och kostnaden i samband med alternativa tekniker såsom 16S rRNA Gene sekvensering och LCMS9.
Det är viktigt att lägga till en matris blank och kalibreringspunkter till MALDI plattan, och vi rekommenderar att du använder ett lämpligt antal replikat för att säkerställa reproducerbarhet och statistiskt förtroende. Antalet replikat kommer att vara experiment beroende. Till exempel, om en användare avser att skilja tusentals kolonier från en samling av miljö mångfald plattor, kan färre replikat vara nödvändigt (vårt labb samlar in tre tekniska replikat per koloni). Alternativt, om en användare vill skapa en anpassad databas av stammar från specifika bakteriella taxa för att snabbt fastställa underarter klassificeringar av okända isolat, då fler replikat är lämpliga (vårt labb samlar in åtta biologiska replikat per stam).
IDBac är ett verktyg för att snabbt differentiera mycket relaterade bakteriella isolat baserat på förmodade taxonomisk information och specialiserad metabolit produktion. Det kan komplettera eller fungera som en föregångare till ortogonala metoder såsom djupgående genetiska analyser, studier med metabolit produktion och funktion, eller karakterisering av specialiserad metabolit struktur med kärnmagnetisk resonans-spektroskopi och/eller LC-MS/MS.
Specialiserade metabolitproduktion (IDBac MANs) är mycket mottagliga för bakterietillväxt villkor, särskilt med hjälp av olika medier, vilket är en potentiell begränsning av metoden. Men dessa egenskaper kan utnyttjas av användaren, som IDBac kan lätt generera MANs visar skillnaderna i specialiserade metabolit produktion under en mängd olika tillväxtförhållanden. Det är viktigt att notera att medan specialiserade metabolit fingeravtryck kan variera beroende på tillväxt, har vi tidigare visat att protein fingeravtryck förblir relativt stabila över dessa variabler (se Clark et al.6). När man arbetar med miljö mångfald plattor, rekommenderar vi rening av bakteriella isolat före analys för att minska eventuella bidrag från angränsande bakteriell Cross-Talk.
Slutligen, avsaknaden av en sökbar offentlig databas med protein MS fingeravtryck är en stor brist i användningen av denna metod för att klassificera okända miljö bakterier. Vi skapade idbac med detta i åtanke, och inkluderade automatiserad omvandling av data till ett community-accepterat Open-Source format (mzml)10,11,12 och utformat programvaran för att möjliggöra sökning, delning och skapandet av anpassade databaser. Vi håller på att skapa en stor offentlig databas (> 10000 fullt karakteriserade stammar), som kommer att möjliggöra klassificering av vissa isolat på Art-nivå, inklusive länkar till GenBank anslutningsnummer när de är tillgängliga.
IDBac är öppen källkod och koden är tillgänglig för alla att anpassa sina dataanalys och visualisering behov. Vi rekommenderar att användare konsultera en omfattande litteratur (Sauer et al.7, Silva et al.5) för att hjälpa till att stödja och utforma sina experimentella mål. Vi är värd för ett diskussionsforum på: https://groups.Google.com/forum/#!forum/idbac och ett sätt att rapportera problem med programvaran på: https://github.com/chasemc/IDBacApp/Issues.

Ett stort hinder för forskare som studerar bakteriell funktion är förmågan att snabbt och samtidigt bedöma den taxonomiska identiteten hos en mikroorganism och dess förmåga att producera specialiserade metaboliter. Detta har hindrat betydande framsteg i förståelsen av sambandet mellan bakteriell fylogeni och specialiserad metabolit produktion i de flesta bakterier isolerade från miljön. Även om MS-baserade metoder som använder protein fingeravtryck för att gruppera och identifiera bakterier är väl beskrivna1,2,3,4, dessa studier har i allmänhet utförts på små grupper av isolat, på ett artspecifikt sätt. Viktigt, information om specialiserad metabolit produktion, en stor drivrutin för mikrobiell funktion i miljön, har förblivit oinkorporerade i dessa studier. Silva et al.5 tillhandahöll nyligen en omfattande historia som beskriver underutnyttjandet av MALDI-TOF MS för att analysera specialiserade metaboliter och bristen på programvara för att lindra nuvarande flaskhalsar i bioinformatik. För att ta itu med dessa brister skapade vi IDBac, en pipeline för bioinformatik som integrerar både linjära och reflectron lägen av MALDI-TOF MS6. Detta gör det möjligt för användare att snabbt visualisera och differentiera bakteriella isolat baserat på både protein och specialiserade metaboliten MS fingeravtryck, respektive.
IDBac är kostnadseffektivt, högt dataflöde och utformat för den lekmanna användaren. Det är fritt tillgängligt (chasemc.github.io/IDBac), och endast kräver tillgång till en MALDI-TOF masspektrometer (reflectron läge kommer att krävas för specialiserad metabolit analys). Provberedning förlitar sig på den enkla "utökade direktöverföringen" metod7,8 och data samlas in med konsekutiva linjära och reflectron förvärv på en enda MALDI-Target spot. Med idbac, är det möjligt att analysera den förmodade fylogeni och specialiserade metabolit produktion av hundratals kolonier på under fyra timmar, inklusive provberedning, datainsamling, och datavisualisering. Detta ger en betydande tid och kostnadsfördel jämfört med traditionella metoder för att identifiera bakterier (såsom gensekvensering), och analysera metabolisk produktion (vätskekromatografi-masspektrometri [LCMS] och liknande kromatografiska metoder).
Med hjälp av data som erhållits i linjär lägesanalys använder IDBac hierarkisk klustring för att representera protein spektra. Eftersom spektra främst representerar joniserade ribosomala proteiner, ger de en representation av den fylogenetiska mångfalden som finns i ett prov. Dessutom innehåller IDBac reflectron läge data för att Visa specialiserade metabolit fingeravtryck som Metabolitassociation nätverk (MANs). MANs är tvåpartsnätverk som möjliggör enkel visualisering av delad och unik metabolit produktion mellan bakteriella isolat. IDBac-plattformen gör det möjligt för forskare att analysera både protein och specialiserade metabolitdata parallellt men också individuellt om endast en data typ förvärvas. Viktigare, IDBac processer rådata från Bruker och Xiamen instrument, samt txt, tab, CSV, mzXML, och mzML. Detta eliminerar behovet av manuell konvertering och formatering av datauppsättningar, och avsevärt minskar risken för användarfel eller misskötsel av MS-data.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>60-002-65</td>
			<td>LC-MS Ultra CHROMASOLV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex Speed LEF MALDI-TOF instrument</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics Bacterial test standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0884024</td>
			<td>Bruker Daltonics 8604530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Peptide Calibration standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9846988</td>
			<td>Bruker Daltonics 8206195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>99.5+%, Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target Plate</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-500</td>
			<td>Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any is ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC293810010</td>
			<td>99.5%, for biochemistry, ACROS Organics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>28166-41-8</td>
			<td>(C2020-25G) &#8805;98% (TLC), powder</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data

För att visualisera sambandet mellan bakteriell fylogeni och specialiserade metabolit produktion av bakteriella kolonier som växer på näringsagar, utvecklade vi IDBac-en låg kostnad och hög genomströmning Matrix-Assisted laserdesorption/jonisering masspektrometri (MALDI-TOF MS) för bioinformatik vid tiden för flygning. IDBac programvara är utformad för icke-experter, är fritt tillgänglig, och kan analysera några till tusentals bakteriella kolonier. Här presenterar vi procedurer för beredning av bakteriekolonier för MALDI-TOF MS-analys, MS-instrumentdrift och databehandling och visualisering i IDBac. I synnerhet, vi instruera användare hur man kluster bakterier i dendrogram baserat på protein MS fingeravtryck och interaktivt skapa metabolit Association nätverk (MANs) från specialiserade metabolit data.

Vi analyserade sex stammar av Micromonospora chokoriensis och två stammar av Bacillus subtilis, som tidigare karakteriserades6, med hjälp av data som finns på Doi: 10.5281/zenodo. 2574096. Följande riktningar i början med RAW-data fliken, vi valde alternativet Klicka här för att konvertera Bruker filer och följde idbac-förutsatt instruktioner för varje dataset (figur 14).
Efter automatiserad omvandling och förbehandling/Peak-Peaking steg slutfördes, vi fortsatte att skapa en ny kombinerad IDBac experiment genom att överföra prover från de två experimenten till ett enda experiment som innehåller både Bacillus och Prover från micromonosopora (figur 15). Den resulterande analysen innebar att man jämförde protein spektra med spegel tomter, som bilden i figur 16, vilket var användbart för att utvärdera spektra kvalitet och justera inställningar för topp plockning. Figur 17 visar en skärmbild av resultaten av proteinklustring med standardinställningarna valda. Den dendrogram färgas genom att justera tröskeln på tomten (visas som en prickad linje). Notera är den tydliga separationen mellan släkten, med både M. chokoriensis och B. subtilis isolat klustring separat.
Figur 18, figur 19, och figur 20 Markera förmågan att generera mans av användarvalda regioner genom att klicka och dra över proteinet dendrogram. Med detta kunde vi snabbt skapa MANs att jämföra endast B. subtilis stammar (figur 18), endast M. chokoriensis stammar (figur 19), och alla stammar samtidigt (figur 20). Den primära funktionen hos dessa nätverk är att ge forskarna en bred överblick av graden av specialiserad metabolit överlappning mellan bakterier. Med dessa data i handen, har forskarna nu kapacitet att fatta välgrundade beslut från endast en liten mängd material skrapats från en bakteriell koloni.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2.jpg"> Figur 14: Spectra-bearbetning. Hämtade Bruker autoFlex Spectra konverterades och bearbetades med hjälp av IDBac. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2.jpg"> Figur 15: kombinerat IDBac-experiment. Eftersom Micromonospora och Bacillus Spectra samlades på olika MALDI mål plattor, var de två experiment därefter kombineras till ett enda experiment-"Bacillus_Micromonsopora". Detta gjordes inom "arbeta med tidigare experiment" fliken, följande riktningar i menyn "överföra prover från tidigare experiment till nya/andra experiment". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 16" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2.jpg"> Figur 16: jämförelse. Micromonspora och Bacillus Spectra jämfördes med spegeln tomter inom "protein data analys" sida. I slutändan valdes förvalda topp inställningar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 17" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2.jpg"> Figur 17: hierarkisk klustring. Hierarkisk klustring, med standardinställningarna, korrekt grupperade Bacillus och Micromonospora isolat. Den dendrogram var färgad av "skära" den dendrogram på en godtycklig höjd (visas som en streckad linje) och 100 Bootstraps används för att visa förtroende för förgrening. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 18" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2.jpg"> Figur 18: man som skapats genom att välja Bacillus SP. stammar från proteinet dendrogram visade differentiell produktion av specialiserade metaboliter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 19" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2.jpg"> Figur 19: man som skapats genom att välja de sex Micromonospora SP. stammar från proteinet dendrogram visade differentiell produktion av specialiserade metaboliter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 20" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2.jpg"> Figur 20: man av Bacillus SP. och Micromonospora SP. stammar som visar en differentiell produktion av specialiserade metaboliter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data at JoVE.com

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

IDBac är en öppen källkod masspektrometri-baserad bioinformatik pipeline som integrerar data från både intakt protein och specialiserade metabolitspektra, som samlats in på cell material skrapats från bakteriella kolonier. Pipelinen gör det möjligt för forskare att snabbt organisera hundratals till tusentals bakteriella kolonier till förmodade taxonomiska grupper, och ytterligare differentiera dem baserat på specialiserad metabolit produktion.

Med öppen källkod MALDI TOF-MS IDBac pipeline för analys av mikrobiellt protein och specialiserade Metabolitdata

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

IDBac par mass spec data från protein och specialiserade metabolit regioner av okända bakterieisoter för att snabbt diskriminera mellan isolat baserat på både deras identitet och deras potentiella miljöfunktion. Vår programvara kontorskälla utökar nyttan av befintliga MALDI TOF baserade mikrobiell identifiering strategier. Denna förlängning omfattar analys av specialiserad metabolism som ytterligare ett sätt att skilja mellan kolonier med liknande fenotyper.En stor utmaning i att karakterisera okända mikroorganismer är att skilja nära besläktade isolat. IDBac ger forskare ett enkelt och snabbt sätt att karakterisera isolat genom protein och små molekyler profilering. IDBac ger en visuell jämförelse av specialiserad metabolit produktion inom ett bakterieprov och kan ge insikt i ett brett spektrum av forskningsämnen från ekologiska studier till drug lead upptäckt.Det finns många sätt att MALDI data kan sparas mellan och bland instrument. Om du har problem med att få filer att fungera med IDBac skickar du in ett problem till IDBacs GitHub. Med hjälp av en steril tandpetare, överföra en liten del av en bakteriekoloni till lämplig plats på en ren MALDI-platta.Sprid bakteriekolonin jämnt över platsen så att platsen verkar så platt som möjligt. Överlagra en mikroliter av 70%masspektrometri grade myrsyra på provet och matris kontroll fläckar och låta syran lufttorka i en kemisk rök huva. Därefter lägger till en mikroliter av tidigare beredd MALDI matrislösning till provet och matris media kontroll fläckar och låt lufttorka helt.Efter att ha satt upp MALDI TOF masspektrometer, förvärva spektra. Spara proteinspektra i en mapp och den specialiserade metabolitspektra i en andra separat mapp. För att påbörja denna procedur, ladda ner IDBac programvara.Dubbelklicka på den hämtade install_idbac för att initiera installationsprogrammet. Nästa dubbelklicka på IDBac skrivbord genväg för att starta IDBac som kommer att öppnas på fliken introduktion som standard. Klicka på fliken Från och med Rådata och välj från menyn skapa ett IDBac-experiment den typ av data som ska användas med IDBac.När du ställer in konvertering och bearbetning av datafiler, mata in ett beskrivande namn för experimentet där uppmanas och klicka på rådata mapp och välj lämplig mapp. Klicka sedan på Processdata. När du har konverterat filerna och bearbetat dem med IDBac navigerar du till sidan med tidigare experiment och väljer ett experiment att arbeta med.Lägg till information om samplingar med hjälp av menyn klicka här för att ändra det valda experimentet. Mata in information i det autobefolkade kalkylarket och tryck på Spara. När du är redo att påbörja analysen, se till att experimentet att arbeta med är markerat.Välj sedan proteindataanalys. I proteindataanalyssidan väljer du topptoppinställningarna och utvärderar proteinspektra av prover via de visade spegeltäpporna. Justera procenten replikat i vilken en topp måste finnas för att den ska kunna inkluderas för analys.Använda spegeln tomter som visuell vägledning, justera signalen till buller cutoff som behåller de mest äkta toppar och minst buller att se att fler replikerar i en högre procent topp närvaro värde kommer att tillåta val av en lägre signal till buller cutoff. Efter detta, ange den nedre och övre massan för att ladda cutoffs dikterar intervallet av massa värden inom varje spektrum som ska användas i ytterligare analys av IDBac. Inom proteindataanalyssidan väljer du fliken Dendrogram för att möjliggöra gruppering av prover i ett dendrogram enligt användarvalda avståndsmått och klustringsalgoritmer.Klicka på välj prov på menyn och följ instruktionerna för att välja prover som ska inkluderas i analysen. Endast prover som innehåller proteinspektra kommer att visas inom den tillgängliga samples-rutan. Använd standardvärdena för algoritmerna för avstånd och klustring och välj intensiteter som indata.Om du vill visa bootstrap-värden på dendrogrammet anger du ett tal mellan två och 1, 000 under bootstraps. För att börja anpassa dendrogrammet öppnar du justera dendrogrammenyn. Om du vill färglägga dendrogrammets linjer väljer du klicka för att ändra rader och väljer önskade alternativ.För att rita information från kalkylbladet bredvid dendrogrammet väljer du knappen införliva info om prover. Då öppnas en panel där en kategori kommer att självbefolka baserat på de instö nerade värdena. Om du vill infoga samplingar från ett annat experiment väljer du menyknappen infoga samplingar från ett annat experiment och följer anvisningarna i den nyöppnade panelen.Gå vidare till den lilla molekyldataanalyssidan för att möjliggöra datavisualisering genom principkomponenter analys och metaboliska association nätverk som använder tvåpartite nätverk för att visa korrelationen av små molekyler massa att ladda värden med prover. Klicka och dra på dendrogrammet för att markera välj prover av intresse som ska analyseras. Om inga prover markeras eller inget protein dendrogram skapades, kommer ett metabolitassocieringsnätverk av antingen en slumpmässig delmängd eller alla prover att visas respektive.Om du vill subtrahera ett matrismedietom i metabolitassociationsnätverket öppnar du menyn väljer ett prov för att subtrahera och väljer lämpligt prov att använda som ett tomt. Öppna menyn visa / dölja MAN inställningar för att välja de önskade värdena för en procentandel av topp närvaro och replikera, signal till buller och övre och nedre massa cutoffs. Använd den lilla molekylen spegel tomter för att styra valet av dessa inställningar.För rapportering resultat, kopiera texten inom förslagen för rapportering MAN analys stycke för att ge användaren definierade inställningar som används för att generera skapade metabola association nätverk. Sex stammar av Micromonospora chokoriensis och två fläckar av Bacillus subtilis analyserades med hjälp av data i IDBac programvara. Efter anvisningar i början med raw data fliken, alternativet klicka här för att konvertera Bruker filer valdes och IDBac som instruktioner följdes för varje datauppsättning.Till den automatiserade konverteringen och förbearbetningen topp topp steg, skapades en kombinerad IDBac experiment genom att överföra Bacillus och Micromonospora prover från de två experimenten till ett enda experiment. Den resulterande analysen innebar att jämföra proteinspektra med hjälp av spegelritningar som var användbara för att utvärdera spektrakvalitet och justera topptoppinställningar. En skärmdump av proteinet klustring resultat med standardinställningar valt visas här.Dendrogrammet färgades genom att justera tröskeln på tomten. Notera är den klara avskiljandet mellan släkten med både M.chokoriensis och B.subtilis isolates som klustrerar separat. Genom att klicka och dra över proteinet dendrogram, var det möjligt att snabbt skapa metaboliska association nätverk för att jämföra endast B.subtilis stammar, endast M.chokoriensis stammar, och alla stammar samtidigt.Den primära funktionen av dessa nätverk är att ge forskare med en bred översikt över graden av specialiserade metabolit överlappning mellan bakterier. När du arbetar med nya data, använd IDBac spegel tomter för att säkerställa dina data är vettigt och spektra är hög kvalitet. Kritiskt utvärdera din experimentella design och resultat vid varje steg.IDBac gör det möjligt för forskare att bygga små och olika bibliotek av mikroorganismer för vidare utredning. Detta minskar i hög grad kostnader i samband med traditionellt stora och överflödiga mikrobiella bibliotek. Eftersom IDBac låter dig visualisera specialiserad metabolitöverlappning inom mycket likafylogenetiska grupper, kan den användas för att generera forskningsfrågor och hypoteser som länkar två typiskt frånkopplade fält.Myrsyra är kaustik och bör hanteras i en kemisk rökhuva. Vissa miljöisoter kan utgöra potentiella hälsofaror och alla stammar bör behandlas som biosäkerhetsnivå två.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metod för att identifiera små molekylhämmare av protein-proteininteraktion Mellan HCN1 och TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Bedömningen av lönsamheten för ett syntetiskt bakteriell konsortium för värd-mikrob In Vitro Gut gränssnittet

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: enstegs affinitet rening för parallell analys av Protein-Protein och Protein-metaboliten komplex

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturläsning och DNA reparation Assay använder Single Nucleotide förlängning och MALDI-TOF-masspektrometri.

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-gratis In Vitro kvantifiering av Protein Homo-oligomerisering använder kommersiella instrumentering och fri, öppen källkod ljusstyrka analys programvara

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En provförberedande pipeline för mikrokritaler vid VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Göra exakta och exakta enmolekyliga FRET-mätningar med hjälp av SmfBox med öppen källkod

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Hagelgevär Proteomics provbehandling automatiserad av en labbrobot med öppen källkod

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Single-Particle Cryo-EM-datainsamling med steglutning med Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...