Name: using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data
Uploaded: 2019-05-15T13:00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data at JoVE.com

Bu çalışma ulusal genel Tıp Bilimleri Enstitüsü Grant R01 GM125943, National Geographic Grant CP-044R-17 tarafından destekleniyordu; İzlanda araştırma fonu Grant 152336-051; ve University of Illinois Chicago başlangıç fonları. Ayrıca, aşağıdaki katılımcılar teşekkür: Dr Amanda bulman MALDı-TOF MS protein edinme parametreleri ile yardım için; Dr. Terry Moore ve Dr. Atul Jain rerystallizing Alfa-Cyano-4-hidroxycinnamic asit matris (CHCA) için.

<ol>
	<li>Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+TOF+MS+profiling+of+bacteria+at+the+strain+level:+A+review.">MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review.</a> Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).</li><li>Cain, T. C., Lubman, D. M., Weber, W. J., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+bacteria+using+protein+profiles+from+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Differentiation of bacteria using protein profiles from matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8 (12), 1026-1030 (1994).</li><li>Holland, R. D., Wilkes, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+identification+of+intact+whole+bacteria+based+on+spectral+patterns+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+with+time-of-flight+mass+spectrometry.">Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 10 (10), 1227-1232 (1996).</li><li>Rahi, P., Prakash, O., Shouche, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass-spectrometry+(MALDI-TOF+MS)+based+microbial+identifications:+challenges+and+scopes+for+microbial+ecologists.">Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass-spectrometry (MALDI-TOF MS) based microbial identifications: challenges and scopes for microbial ecologists.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1359 (2016).</li><li>Silva, R., Lopes, N. P., Silva, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+MALDI+mass+spectrometry+in+natural+products+analysis.">Application of MALDI mass spectrometry in natural products analysis.</a> Planta Medica. 82, 671-689 (2016).</li><li>Clark, C. M., Costa, M. S., Sanchez, L. M., Murphy, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+MALDI-TOF+mass+spectrometry+protein+and+specialized+metabolite+analyses+to+rapidly+discriminate+bacterial+function.">Coupling MALDI-TOF mass spectrometry protein and specialized metabolite analyses to rapidly discriminate bacterial function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4981-4986 (2018).</li><li>Freiwald, A., Sauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+classification+and+identification+of+bacteria+by+mass+spectrometry.">Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 4 (5), 732-742 (2009).</li><li>Schulthess, B., Bloemberg, G. V., Zbinden, R., B&#246;ttger, E. C., Hombach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Bruker+MALDI+Biotyper+for+identification+of+Gram-positive+rods:+development+of+a+diagnostic+algorithm+for+the+clinical+laboratory.">Evaluation of the Bruker MALDI Biotyper for identification of Gram-positive rods: development of a diagnostic algorithm for the clinical laboratory.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (4), 1089-1097 (2014).</li><li>Schumann, P., Maier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+mass+spectrometry+applied+to+classification+and+identification+of+bacteria.">MALDI-TOF mass spectrometry applied to classification and identification of bacteria.</a> Methods in Microbiology. 41, 275-306 (2014).</li><li>Chambers, M. C., Maclean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics.">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534 (2008).</li><li>Martens, L., Chambers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mzML-a+community+standard+for+mass+spectrometry+data.">mzML-a community standard for mass spectrometry data.</a> Molecular &#38; Cellular Proteomics. 10 (1), (2011).</li></ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Idbac protokol detayları bakteriyel protein ve özel metabolit veri edinme ve analiz kadar 384 bakteriyel izolatlar 4 h tek bir araştırmacı tarafından. Idbac ile bakteriyel izolatlar DNA ayıklamak veya sıvı fermantasyon et suyu özel metaboliti özler oluşturmak ve kromatografik yöntemleri kullanarak analiz etmek için gerek yoktur. Bunun yerine, protein ve özel metabolit verileri sadece bir MALDı hedef plaka üzerine doğrudan bakteriyel kolonilerden malzeme yayma tarafından toplanır. Bu, 16S rRNA gen sıralaması ve LCMS9gibi alternatif tekniklerle ilişkili zaman ve maliyeti büyük ölçüde azaltır.
MALDı plakasına bir matris boş ve kalibrasyon noktaları eklemek önemlidir ve yeniden üretilebilirliği ve istatistiksel güveni sağlamak için uygun sayıda çoğaltır kullanmanızı öneririz. Çoğaltır sayıları deneme bağımlı olacaktır. Örneğin, bir Kullanıcı çevresel çeşitlilik plakaları koleksiyonundan binlerce kolonileri ayırt etmek niyetinde ise, daha az çoğaltır gerekli olabilir (laboratuvarımız koloni başına üç teknik çoğaltır toplar). Alternatif olarak, bir Kullanıcı belirli bakteriyel takson 'dan gelen suşların özel bir veritabanı oluşturmak istiyorsa, bilinmeyen izolatların alt türler sınıflandırmalarını hızla belirlemek için daha fazla çoğaltır uygundur (laboratuvarımız her bir sekiz biyolojik çoğaltır toplar strain).
IDBac hızlı bir şekilde son derece ilgili bakteriyel izolatlar Putatif taksonom bilgi ve özel metabolit üretimi dayalı ayırt etmek için bir araçtır. Derinlemesine genetik analizler, metabolit üretimi ve fonksiyonuyla ilgili çalışmalar veya nükleer manyetik rezonans spektroskopisi ve/veya özel metabolit yapısının karakterize edilmesi gibi ortogonal yöntemlerle öncü olarak hizmet verebilir LC-MS/MS.
Özel metabolit üretimi (ıdbac MANs), özellikle yöntemin potansiyel bir sınırlama olan farklı medya kullanarak, bakteriyel büyüme koşullarına son derece duyarlıdır. Ancak bu özellikleri Kullanıcı tarafından istismar edilebilir, ıdbac kolayca büyüme koşulları çeşitli altında özel metaboliti üretiminde farklılıkları gösteren MANs üretebilir gibi. Özel metaboliti parmak izi büyüme durumuna göre değişebilir iken, daha önce protein parmak izleri bu değişkenler arasında nispeten kararlı kaldığını göstermiştir dikkat etmek önemlidir (bkz. Clark ve al.6). Çevresel çeşitlilik plakaları ile uğraşırken, komşu bakteriyel çapraz konuşma olası katkıları azaltmak için analiz öncesinde bakteriyel izolatlar arındırmak öneririz.
Son olarak, protein MS parmak izleri aranabilir bir genel veritabanı eksikliği bilinmeyen çevresel bakterileri sınıflandırmak için bu yöntemin kullanımı büyük bir eksiklik olduğunu. Biz bu akılda ıdbac oluşturuldu ve bir topluluk kabul açık kaynak formatı (mzml)10,11,12 içine veri otomatik dönüşüm dahil ve arama, paylaşım ve oluşturulması izin vermek için yazılım tasarlanmış özel veritabanları. Biz büyük bir kamu veritabanı oluşturma sürecinde (> 10000 tam olarak karakterize suşları), hangi türler için bazı izolatlar sınıflandırılması için izin verecektir düzeyi, GenBank üyelik numaraları kullanılabilir olduğunda bağlantılar da dahil olmak üzere.
Idbac açık kaynak ve kod herkes kendi veri analizi ve görselleştirme ihtiyaçlarını özelleştirmek için kullanılabilir. Kullanıcıların deneysel hedeflerini desteklemesine ve tasarlamalarına yardımcı olmak için geniş bir literatür gövdesine (Sauer vd.7, Silva ve al.5) danışmanızı öneririz. Biz tartışma için bir forum barındırıyoruz: https://groups.Google.com/forum/#!forum/idbac ve yazılım ile ilgili sorunları bildirmek için bir araç: https://github.com/chasemc/IDBacApp/issues.

Bakteriyel fonksiyon Etüdü araştırmacılar için büyük bir engel hızlı ve eşzamanlı bir mikroorganizma ve özel metabolitleri üretmek için kapasitesini taksononomik kimliğini değerlendirmek yeteneğidir. Bu, ortamdan izole edilen bakterilerin çoğunda bakteriyel Phylogeny ve özel metabolit üretimi arasındaki ilişkiyi anlamada önemli gelişmeler önledi. Protein parmak izlerini grup olarak tanımlamak ve bakterileri belirlemek için kullanılan MS tabanlı yöntemler1,2,3,4, bu çalışmalar genellikle küçük izolatlar gruplarında gerçekleştirilmesine karşın, bir türe özgü şekilde. Önemlisi, özel metabolit üretimi hakkında bilgi, çevresel mikrobiyal fonksiyonun büyük bir sürücü, bu çalışmalarda dahil edilmemiş kaldı. Silva ve ark.5 son zamanlarda özel metabolitleri ve yazılım eksikliği mevcut Biyoinformatik darboğazları rahatlatmak için analiz etmek MALDI-TOF MS altkullanımı ayrıntılarıyla kapsamlı bir tarih sağladı. Bu eksiklikleri gidermek amacıyla, MALDı-TOF MS6' nın hem doğrusal hem de reflectron modlarını birleştiren bir Biyoinformatik boru hattı olan ıdbac 'i oluşturduk. Bu kullanıcıların hızla görselleştirmek ve bakteri izolatlar hem protein ve özel metaboliti MS parmak izleri, sırasıyla dayalı ayırt sağlar.
Idbac uygun maliyetli, yüksek verimlilik ve Kullanıcı yatıyordu için tasarlanmıştır. Serbestçe kullanılabilir (chasemc.github.io/IDBac), ve sadece bir MALDı-TOF Kütle spektrometresi erişim gerektirir (reflectron modu özel metabolit analizi için gerekli olacaktır). Numune hazırlama basit "genişletilmiş doğrudan transfer" yöntemine dayanır7,8 ve veri tek bir Maldi-hedef noktada ardışık doğrusal ve reflectron alımları ile toplanır. Idbac ile, örnek hazırlama, veri edinme ve veri görselleştirme dahil olmak üzere dört saat içinde kolonilerin yüzlerce sözde Phylogeny ve özel metaboliti üretimini analiz etmek mümkündür. Bu, bakteri tanımlama (gen sıralaması gibi) ve metabolik çıktıyı analiz etme (sıvı kromatografi-kütle spektrometresi [LCMS] ve benzer kromatografik yöntemler) ile ilgili geleneksel yöntemlerle önemli bir zaman ve maliyet avantajı sunar.
Doğrusal mod analizinde elde edilen verileri kullanarak, ıdbac protein spektrumunun relatedness temsil etmek için hiyerarşik kümeleme kullanır. Spektrum çoğunlukla iyonize ribozomal proteinleri temsil ettiğinden, bir örnekteki fitogenetik çeşitliliğin bir gösterimini sağlar. Buna ek olarak, idbac metaboliti Derneği Networks (MANs) olarak özel metabolit parmak izleri görüntülemek için reflectron modu verileri içerir. MANs, bakteriyel izolatlar arasında ortak ve benzersiz metabolit üretiminin kolay görselleştirilmesini sağlayan iki taraflı ağlardan biridir. IDBac platformu, araştırmacılar hem protein hem de özel metabolit veri tandem aynı zamanda tek bir veri türü elde edilir, aynı şekilde analiz etmek için izin verir. Önemlisi, ıdbac Bruker ve Xiamen enstrümanların yanı sıra txt, sekme, CSV, mzXML ve mzML ham verileri işler. Bu, el ile dönüştürme ve veri kümeleri biçimlendirme gereksinimini ortadan kaldırır ve önemli ölçüde Kullanıcı hatası veya MS veri yanlış işleme riskini azaltır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>60-002-65</td>
			<td>LC-MS Ultra CHROMASOLV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex Speed LEF MALDI-TOF instrument</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics Bacterial test standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0884024</td>
			<td>Bruker Daltonics 8604530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Peptide Calibration standard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9846988</td>
			<td>Bruker Daltonics 8206195</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>99.5+%, Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target Plate</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A456-500</td>
			<td>Optima LC/MS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any is ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC293810010</td>
			<td>99.5%, for biochemistry, ACROS Organics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>28166-41-8</td>
			<td>(C2020-25G) &#8805;98% (TLC), powder</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the open-source maldi tof-ms idbac pipeline for analysis of microbial protein and specialized metabolite data

Bakteri Phylogeny ve besin agar üzerinde büyüyen bakteriyel kolonilerin özel metaboliti üretimi arasındaki ilişkiyi görselleştirmek için, biz IDBac geliştirilen-düşük maliyetli ve yüksek verim Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon Uçuş süresi kitle spektrometresi (MALDı-TOF MS) Biyoinformatik boru hattı. Idbac yazılımı olmayan uzmanlar için tasarlanmıştır, serbestçe kullanılabilir ve bakteriyel kolonilerin birkaç binlerce analiz yeteneğine sahiptir. Burada, MALDı-TOF MS analizi, MS enstrüman operasyonu ve ıdbac 'de veri işleme ve görselleştirme için bakteriyel kolonilerin hazırlanması için prosedürler sunuyoruz. Özellikle, biz nasıl dendrograms içine protein MS parmak izleri dayalı ve interaktif metabolit Derneği Networks (MANs) özel metabolit verilerden oluşturmak bakteri küme kullanıcılara talimat.

Biz Micromonospora chokoriensis altı suşları ve Bacillus subtilis, daha önce6, veri DOI: 10.5281/zenodo. 2574096 kullanılabilir kullanarak karakterize iki suzlar analiz etti. Ham veri sekmesi Ile başlayarak talimatların ardından, Bruker dosyalarını dönüştürmek için burayı tıklatın seçeneğini seçtiniz ve her veri kümesi için ıdbac tarafından sağlanan yönergeleri izledi (Şekil 14).
Otomatik dönüşüm ve ön işlem/Peak-peaking adımları tamamlandıktan sonra, iki denemeden gelen örnekleri hem Bacillus hem de içeren tek bir denemede aktararak yeni bir kombine idbac deneyi oluşturmaya devam ettik Micromonosopora örnekleri (Şekil 15). Sonuç analizi, spektrum kalitesini değerlendirmek ve tepe çekme ayarlarını ayarlamak için yararlı olan Şekil 16' da resimde gösterildiği gibi, ayna grafiklerini kullanarak protein Spektrumları karşılaştırarak yer alıyor. Şekil 17 seçilen varsayılan ayarlarla protein kümeleme sonuçlarının bir ekran görüntüsünü görüntüler. Dendrogram arsa üzerinde eşik ayarlayarak renklidir (noktalı bir çizgi olarak görünür). Not, her iki M. chokoriensis ve B. subtilis ayrı olarak kümeleme yalıtır ile, Genera arasındaki net ayrım.
Şekil 18, Şekil 19ve Şekil 20 , protein dendrogram arasında tıklayarak ve sürükleyerek Kullanıcı tarafından seçilen bölgelerin MANs oluşturmak için yeteneğini vurgulayın. Bu biz hızlı bir şekilde sadece B. subtilis suşları karşılaştırmak için MANs oluşturmak başardık (Şekil 18), sadece M. chokoriensis suşları (Şekil 19), ve aynı anda tüm suşları (Şekil 20). Bu ağlar birincil işlevi, bakteriler arasında özel metabolit çakışmasını derecesi geniş bir genel bakış ile araştırmacılar sağlamaktır. Bu veriler el ile, araştırmacılar şimdi bir bakteriyel koloniden kazınmış malzeme sadece küçük bir miktar bilinçli kararlar almak için kapasitesine sahip.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2.jpg"> Şekil 14: Spectra işleme. İndirilen Bruker autoFlex Spectra ıdbac kullanılarak dönüştürülmüş ve işlenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig14v2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2.jpg"> Şekil 15: kombine ıdbac deneyi. Micromonospora ve Bacillus Spectra farklı Maldi hedef plakaları üzerinde toplanan çünkü, iki deney daha sonra tek bir deney Içine birleştirilir-"Bacillus_Micromonsopora". Bu "önceki deneylerle çalışma" sekmesinde, "önceki deneylerden örnekleri yeni/diğer deneylere aktar" menüsündeki yönergeleri izleyerek yapıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig15v2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 16" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2.jpg"> Şekil 16: karşılaştırma. Micromonspora ve Bacillus Spectra, "protein veri analizi" sayfasındaki ayna grafiklerini kullanarak karşılaştırıldı. Sonuçta, varsayılan tepe ayarları seçildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig16v2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 17" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2.jpg"> Şekil 17: hiyerarşik kümeleme. Hiyerarşik kümeleme, varsayılan ayarları kullanarak, doğru gruplandırılmış Bacillus ve Micromonospora yalıtır. Dendrogram (bir kesikli çizgi olarak görüntülenir) bir keyfi yükseklikte dendrogram "kesme" ile renkli ve 100 dallanma güven göstermek için kullanılan Boot,. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig17v2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 18" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2.jpg"> Şekil 18: Man protein dendrogram gelen Bacillus Sp. suşları seçerek oluşturulan özel metabolitlerin diferansiyel üretimi gösterdi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig18v2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 19" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2.jpg"> Şekil 19: Man protein dendrogram altı Micromonospora Sp. suşları seçerek oluşturulan özel metabolitlerin diferansiyel üretimi gösterdi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig19v2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 20" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2.jpg"> Şekil 20: Bacillus Sp. ve micromonospora Sp. suşların özel metabolitlerin diferansiyel üretimini gösteren Man . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59219/59219fig20v2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data at JoVE.com

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

IDBac, bakteriyel kolonilerden kazınmış hücre malzemesinde toplanan, hem bozulmamış protein hem de özel metabolit spektrumlu verileri birleştiren açık kaynaklı Kütle Spektrometrisi bazlı Biyoinformatik boru hattıdır. Boru hattı araştırmacılar hızlı bir şekilde on binlerce bakteriyel koloniler Putatif taksonom gruplara düzenlemek için izin verir ve daha fazla özel metaboliti üretimi dayalı ayırt.

Mikrobiyal protein ve özel metabolit verilerinin analizi için açık kaynak MALDı TOF-MS ıdbac Pipeline kullanma

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

IDBac çiftler protein ve bilinmeyen bakteriyel özel metabolit bölgelerinden kitle spec veri hızla hem kimlikleri ve potansiyel çevresel işlevine göre izole arasında ayrım yapmak için izole. Ofis kaynak yazılımımız mevcut MALDI TOF tabanlı mikrobiyal tanımlama stratejilerinin yararını genişletir. Bu uzantı, benzer fenotiplere sahip kolonileri ayırt etmenin ek bir yolu olarak özelleştirilmiş metabolizmanın analizini içerir.Bilinmeyen mikroorganizmaların karakterizasyonunda önemli bir sorun yakından ilişkili izole ayırt etmektir. IDBac araştırmacılar protein ve küçük molekül profilleme yoluyla izole karakterize etmek için kolay ve hızlı bir yol sağlar. IDBac, bakterisel bir örneklem içinde özel metabolit üretiminin görsel bir karşılaştırmasını sağlar ve ekolojik çalışmalardan uyuşturucu kurşununun keşfine kadar çok çeşitli araştırma konularına ışık verebilir.MALDI verilerinin araçlar arasında ve araçlar arasında kaydedilmesinin birçok yolu vardır. Dosyaları IDBac ile çalışmakta sorun yaşıyorsanız, IDBac'ın GitHub'ına bir sorun gönderin. Steril bir kürdan kullanarak, temiz bir MALDI plaka üzerinde uygun noktaya bir bakteri kolonisinin küçük bir kısmını aktarın.Bakteri kolonisini noktanın üzerine eşit olarak yayın, böylece nokta mümkün olduğunca düz görünür. Numune ve matris kontrol noktaları üzerine% 70 kütle spektrometre sınıf formik asit bir mikrolitre yer ve asit kimyasal bir duman kaputunda kuru hava sağlar. Daha sonra, numune ve matris medya kontrol noktalarına önceden hazırlanmış MALDI matris çözeltisinin bir mikrolitresini ekleyin ve tamamen kurumasını bekleyin.MALDI TOF kütle spektrometresini kurduktan sonra spektrayı edinin. Protein spektrumlarını tek bir klasöre, özel metabolit spektrumlarını ise ikinci bir ayrı klasöre kaydedin. Bu yordamı başlatmak için IDBac yazılımını indirin.Yükleyicisi başlatmak için indirilen install_idbac çift tıklatın. Sonraki çift tıklayın IDBac masaüstü kısayolu varsayılan olarak giriş sekmesinde açılacak IDBac başlatmak için. Ham Verilerle Başlangıç sekmesine tıklayın ve IDBac ile kullanılacak veri türünü bir IDBac deneme menüsü oluşturma seçeneğini belirleyin.Veri dosyalarının dönüştürülmesini ve işlenmesini ayarlarken, istendiği deneme için açıklayıcı bir ad giriş inve ham veri klasörünü tıklatın ve uygun klasörü seçin. Ardından İşlem Verileri'ni tıklatın. Dosyaları dönüştürdükten ve IDBac ile işledikten sonra, önceki denemeler sayfasıyla işe gidin ve çalışmak için bir deneme seçin.Seçili denemeyi değiştirmek için menüyü kullanarak örnekler hakkında bilgi ekleyin buraya tıklayın. Otomatik doldurulmuş elektronik tabloya bilgi girve Kaydet'e basın. Çözümleme başladığınızda, çalışmak için deneme nin seçildiğinden emin olun.Sonra protein veri analizini seçin. Protein veri analizi sayfasında, tepe ayarları seçin ve görüntülenen ayna çizimleri aracılığıyla örneklerin protein spektrumlarını değerlendirin. Analize dahil edilebilmesi için bir tepenin bulunması gereken çoğaltmayüzdesini ayarlayın.Ayna çizimlerini görsel kılavuz olarak kullanarak, sinyali en orijinal zirveleri koruyan gürültü kesmeye ayarlayın ve daha yüksek bir yüzde tepe durum değerinde daha fazla çoğaltmanın gürültü kesmeye daha düşük bir sinyal in seçimine olanak sağlayacağını belirterek en az gürültüyü ayarlayın. Bunu takiben, IDBac tarafından daha fazla analizde kullanılacak her spektrumdaki kütle değerlerinin aralığını dikte eden kesmeleri şarj etmek için alt ve üst kütleyi belirtin. Protein veri analizi sayfasında, örnekleri kullanıcı nın seçtiği mesafe ölçüleri ve kümeleme algoritmalarına göre dendrogramda gruplandırmak için Dendrogram sekmesini seçin.Menüdeki örnekleri seçin ve analize dahil etmek üzere örnekleri seçmek için yönergeleri izleyin. Kullanılabilir numune kutusunda yalnızca protein spektrumları içeren numuneler görüntülenir. Uzaklık ve kümeleme algoritmaları için varsayılan değerleri kullanın ve giriş olarak yoğunlukları seçin.Dendrogramda bootstrap değerlerini görüntülemek için, bootstraps altında iki ile 1,000 arasında bir sayı girin. Dendrogramı özelleştirmeye başlamak için dendrogram menüsünü ayarlayın. Dendrogramın satırlarını renklendirmek için satırları değiştirmek ve istediğiniz seçenekleri seçmek için tıklatın'ı seçin.Dendrogramın yanındaki elektronik tablodaki bilgileri çizmek için, örnekler le ilgili bilgileri içeren düğmeyi seçin. Bu, bir kategorinin girilen değerlere göre kendi kendine doldurulacağı bir panel açar. Başka bir denemeden örnek eklemek için menü düğmesini seçin başka bir denemeden örnekler ekleyin ve yeni açılan paneldeki yönergeleri izleyin.Küçük molekül kütlesinin örneklerle yüklenmesi için küçük molekül kütlesinin korelasyonunu görüntülemek için iki partili ağları kullanan ilke bileşenleri analizi ve metabolik çağrışım ağları ile veri görselleştirmesini sağlamak için küçük molekül veri analizi sayfasına geçin. Analiz edilecek belirli ilgi çekici örnekleri vurgulamak için dendrogramı tıklatın ve sürükleyin. Hiçbir örnek vurgulanmadıysa veya protein dendrogramı oluşturulmazsa, sırasıyla rasgele bir alt kümeden veya tüm örneklerden oluşan bir metabolit ilişkilendirme ağı görünür.Metabolit ilişkilendirme ağındaki bir matris ortamını boş çıkarmak için menüyü açın ve boş olarak kullanmak üzere uygun örneği seçin. En yüksek durum ve çoğaltma yüzdesi için istenen değerleri seçmek, gürültüsinyali ve üst ve alt kütle kesintileri için istenen değerleri seçmek için MENÜ gösterisi/gizleme MAN ayarlarını açın. Bu ayarların seçimine rehberlik etmek için küçük molekül ayna çizimlerini kullanın.Sonuçları raporlamak için, oluşturulan metabolik ilişkilendirme ağı oluşturmak için kullanılan kullanıcı tanımlı ayarları sağlamak için MAN çözümleme paragrafını raporlama önerileri içindeki metni kopyalayın. Mikromonospora chokoriensis altı suşları ve Bacillus subtilis iki lekeler IDBac yazılımında veri kullanılarak analiz edildi. Ham veri sekmesi ile başlayan yönergeleri izleyerek, Bruker dosyalarını dönüştürmek için buraya tıklayın ve IDBac her veri kümesi için verilen yönergeleri sağladı.Otomatik dönüştürme ve ön işleme tepe basamakları için, bacillus ve Micromonospora örneklerinin iki deneyden tek bir deneye aktarılmasıyla birleşik bir IDBac deneyi oluşturuldu. Elde edilen analiz, spektrum kalitesini değerlendirmek ve tepe ayarlarını ayarlamak için yararlı olan ayna çizimleri kullanarak protein spektrumlarının karşılaştırılmasını içeriyordu. Varsayılan ayarları seçilen protein kümeleme sonuçlarının ekran görüntüsü burada gösterilmiştir.Dendrogram, çizimdeki eşik ayarlayarak renklendi. Not hem M.chokoriensis ve B.subtilis ile cins arasındaki açık ayrım ayrı ayrı kümelenme izole edilir. Protein dendrogramı tıklayarak ve sürükleyerek, hızla sadece B.subtilis suşları karşılaştırmak için metabolik çağrışım ağları oluşturmak mümkün oldu, sadece M.chokoriensis suşları, ve aynı anda tüm suşları.Bu ağların birincil işlevi, araştırmacılara bakteriler arasındaki özel metabolit örtüşme derecesine geniş bir genel bakış sağlamaktır. Yeni verilerle çalışırken, verilerinizin anlamlı ve spektrumların yüksek kalitede olduğundan emin olmak için IDBac'ın ayna çizimlerini kullanın. Deneysel tasarımınızı ve sonuçlarınızı her adımda eleştirel bir şekilde değerlendirin.IDBac araştırmacılar Daha fazla araştırma için mikroorganizmaların küçük ve çeşitli kütüphaneler inşa sağlar. Bu, geleneksel olarak büyük ve gereksiz mikrobik kitaplıklarla ilişkili maliyetleri büyük ölçüde azaltır. IDBac, son derece benzer filogenetik gruplar içinde özelleştirilmiş metabolit örtüşmelerini görselleştirmenize olanak sağladığından, genellikle bağlantısı kesilen iki alanı birbirine bağlayan araştırma soruları ve hipotezler oluşturmak için kullanılabilir.Formik asit kostik ve kimyasal bir duman başlık ele alınmalıdır. Bazı çevresel izolasyonlar potansiyel sağlık tehlikeleri oluşturabilir ve tüm suşlar biyogüvenlik seviyesi iki olarak ele alınmalıdır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Yöntem HCN1 ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Sentetik bir bakteriyel konsorsiyum Vitro Gut ana bilgisayar-mikrop arabirimde canlılık değerlendirilmesi

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Proofreading ve DNA onarım tahlil tek nükleotid uzama ve MALDI-TOF Kütle spektrometresi analizi ile

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

VMXm Beamline'da Mikrokristaller için Örnek Hazırlama Boru Hattı

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

Açık Kaynaklı smfBox kullanarak Hassas ve Doğru Tek Moleküllü FRET Ölçümleri Yapma

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Shotgun Proteomics Sample Processing Automated by an Open-Source Lab Robot

Açık Kaynaklı Bir Laboratuvar Robotu Tarafından Otomatikleştirilmiş Av Tüfeği Proteomik Numune İşleme

Mass spectrometry-based shotgun proteomics experiments require multiple sample preparation steps, including enzymatic protein digestion and clean-up, ...

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Leginon kullanarak Stage Tilt ile Tek Parçacıklı Cryo-EM Veri Toplama

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...