Name: a human blood-brain interface model to study barrier crossings by pathogens or medicines and their interactions with the brain
Uploaded: 2019-04-09T13:30:00
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本研究は、パスツール研究所にサノフィパス ツール社によって Incitative グラント (PTR 435) を含むパスツール研究所からの内部補助金、助成金「契・ ステンカラー併設ラ フランス」提供を支えられました。A. ダ コスタは、サノフィパス ツール社グラントとフロリアン Bakoa によって支持された、ANRT によって提供される博士の補助金の受信者 (協会ナシオナル デ ラ ルシェルシュ エ デ ラ テク)。役に立つ議論のため Pr ピエール オリビエ Couraud と Dr フィレンツェ ミラーにお世話になっております。

1 Ntera/CL2 の細胞培養作業。D1 ポスト mitotic の hNeurons と hAstrocytes (NT2 N/A) の混合培養を準備するには
注: これは Minibrain (図 1) のコンポーネントです。
<ol><li>養殖、Ntera/Cl2.D1<ol>
<li>液体窒素タンクから凍結細胞のバイアルを削除します。氷の上を保ちます。</li>
		<li>37 ° C の水浴で急速に細胞を解凍します。</li>
		<li>完全 F12 DMEM 培地 10 mL を含む 15 mL ?...

この記事での cellulo を構築する方法を行った血液/脳インターフェイス、BBB-Minibrain、BBB モデルとの文化を組み合わせた混合脳脳細胞 (Minibrain) 1 つのキットに。このシステムは生物学的に関連するを設定し、細胞培養でよく訓練された実験者のための処理しやすいです。
任意他の in vitro モデルとして BBB のバリアの気密性の抜本的な制御を適用した場合に信頼性の高い結?...

脳は、脳実質と血液脳関門 (BBB) と呼ばれる血液の交流を制限する非透水性構造で全身循環から区切られます。BBB 脳血管内皮細胞から成る主、アストロ サイト、ミクログリア血管周囲近隣の脳実質の神経細胞と動的に対話します。BBB の 3 つの主要な関数が作成および栄養素、および有毒な傷害からの保護と脳の供給や病原体1、2に貢献する神経機能のイオンの恒常性の維持脳のホメオスタシスとその機能3のメンテナンス。この障壁はのみいくつかの薬が BBB4,5を越えることができるので効率的です。現時点では、分子が BBB を通過し、脳に拡散かどうかを予測する利用可能な方法は MRI (磁気共鳴画像) またはペット (位置排出によって人間のボランティアの脳の剖検材料、画像追跡に関する ex 成ってください。断層レントゲン写真撮影) 薬理学や薬物動態学的臨床研究動物6,7,8。これらの技術とモデル ペットの限られた解像度と MRI6,8、その悪い分子 (すなわち、例えば基づく抗体分子) を定量化する難しさの低感度など制限があります。7脳に浸透し、臨床の研究、高コストと動物実験のリゾート。
最後の点は重要なので、3 r の規則、(代替・削減・動物実験の改良) によると規制行政を求めている動物に科学的に正確な代替緊急開発実験9,10、11,12,13,14,15。
最後の十年にわたって BBB のいくつかの生体外モデルが提案されている16,17,18フィルターで栽培によって膜内皮細胞をマウス、ラット、ウシ、ブタなどの異なる種から挿入します。一次電池の不足と困難の可用性が不死化脳血管内皮細胞およびひと由来幹細胞19,20に基づく人体モデルを開発する研究者を求め人間の種に関する限り、 21。これらの障壁は、BBB の適切な in vitro におけるサロゲート血管内皮細胞マーカー、タイト結合マーカー、排出トランスポーター、溶質のキャリア、受容体、表現される内皮刺激20に対応。血管内皮細胞と他の細胞型 (すなわち、アストロ サイト、ニューロンまたはペリサイト22,23,24) コーティング フィルター膜挿入を使用していくつかの BBB モデルを評価した.これらの共培養の目標は、アストロ サイト/ニューロンまたはペリサイトによって可溶性因子の分泌を利用して BBB の物理的特性を上げることでした。
それにもかかわらず、これらのモデルのどれも研究し、バリアを通過したら医薬品候補の運命を予測する脳実質が含まれていません。したがって、私たちの目標で cellulo を構築することでした血液/脳インターフェイス、BBB-Minibrain、1 つのキットに BBB モデルと混合脳細胞の培養を組み合わせることで。BBB Minibrain multiwell 細胞培養プレートのウェルに挿入された多孔質フィルターから成る文化システムを使用します。フィルターは、BBB を形成する BBB 薬物25,26,27, 信頼性の高い証明されている人間の脳血管内皮細胞ライン hCMEC/D3 セルでコーティングされています。Minibrain と NTera/Cl2.D1 セル行28,29由来アストロ サイト混ぜて人間小グリア細胞系に対応した比 CHME/Cl530人間ニューロンの分化共同文化である、31脳のニューロン アストロ サイト比対ミクログリアは、プレートの底にも栽培されています。
BBB と実質内に彼らの運命の間で薬の通路を勉強以外 cellulo モデルにおける血液脳インターフェイスは、脳 (neuroinvasiveness)、(neurotropism) 脳への分散に病原体のエントリに対処するための強力なツール毒性 (神経毒性) 脳実質細胞を出すことができます。神経毒性と neuroinvasiveness の研究は、効率的な cellulo モデルでの開発のメリットし、動物モデルを置き換えるに有利であります。BBB Minibrain キット32を使用すると、準備するために使用黄熱病ウイルス (すなわち、FNV YFV33,34) のフランス語神経親和性ウイルス株に蓄積された珍しいのウイルス変異体のなる神経侵入型表現型デモンストレーションを行った、YFV 生ワクチンと (呼ばれるネバダ州として今後原稿で) Neurovita35と呼ばれる発信と神経生体分子の通過を中止しました。NV どちらも当然のことながら細胞膜を交差させるも、BBB、ネバダ州は BBB を含む生体膜を交差し貫通分子 (CPM)36セルとして機能するラマの一本鎖抗体の可変部分 (VHH) と融合しました。VHH の CPM プロパティは、等電点と VHH37の長さに依存するようです。
Cellulo テストでこれは実施薬物動態と薬効動態解析、動物と理想的に神経系での挙動を予測することができる同時に前に BBB のクロスが潜在的分子をソートできますください。実質。このシステムは生物学的関連を設定および細胞培養26,29,30,38のよく訓練された専門家によって処理する簡単です。Cellulo テストのような関心は 2 倍になる: 一方で前臨床テストのコストを削減し、その一方で動物実験の使用を減らします。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-fluoro-2&#8217;deoxyuridine</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>85mm Petri Dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-3902-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nf200</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>N4142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercapto-ethanol</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHME/Cl5</td>
			<td>Unit&#233; de Neuroimmunologie Virale</td>
			<td>On request to Dr Lafon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMC</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>217274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark 96 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>31330-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endogro IV</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCME004</td>
			<td>endothelial cell medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>529121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30015-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GIEMSA</td>
			<td>RAL Diagnostic</td>
			<td>320310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-Anti Mouse</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>115-545-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-Anti Rabbit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>R37117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with Ca2+-Mg2+</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14025-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCMEC/D3</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CLU512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes 1M</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15630-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>33263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminine</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>L6274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lucifer Yellow</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>L0259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM 10X</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>21430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM 1X</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>42360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ntera/Cl2D.1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Ca2+-Mg2+</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-Ca2+-Mg2+</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CXXPES00-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-d-Lysine</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>P1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiashredder</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>79656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Collagen I</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3443-100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid All-Trans</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate 5.6%</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CXXBIC00-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Cell+ Flask</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83-1813-302</td>
			<td>Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3460</td>
			<td>polyester porous membrane culture inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Water</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Merck-Sigma Aldrich</td>
			<td>U3750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15040-033</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YFV-FNV</td>
			<td>IP Dakar</td>
			<td>Vaccine vial</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a human blood-brain interface model to study barrier crossings by pathogens or medicines and their interactions with the brain

初期に、適切な神経系薬のスクリーニングと cellulo BBB モデル彼らの浸透とバリアと脳実質との相互作用のための信頼性の高い、まだ満たされていない必要があります。このギャップを埋めるためには、人間の脳細胞 (ニューロン、アストロ サイト、ミクログリア細胞) のトリ文化によって形成される多孔質膜文化挿入人間 BBB モデル、Minibrain ポリエステルを組み合わせることにより BBB-Minibrain、cellulo モデルで 2 D を考案しました。BBB Minibrain ニューロンにこの分子の特定の目標を決定して後薬の神経保護プロパティが保持されることを示すため、BBB 通過神経保護薬候補者 (例えば、Neurovita) の輸送をテストします。薬は、BBB を越えていた。我々 はまた、BBB Minibrain が血管内皮細胞の境界を越えたウイルス粒子の通過を検出するなる神経侵入型ウイルス粒子によって、Minibrain の感染を監視するための興味深いモデルを構成することを実証しました。BBB Minibrain は、信頼性の高いシステム、治療または侮辱後細胞培養技術で訓練を受けたと脳細胞の表現型の予測は研究者の扱いやすいです。2 倍になる cellulo テストにそのような関心: 医薬品開発の早い段階で手順を一方で derisking とその一方でテストの動物の使用を減らすことを紹介します。

BBB Minibrain は、の cellulo 実験血液脳インターフェイスのモデル。
BBB Minibrain は、上階の血物入れと血液脳インターフェイス (図 2 a、B) のより低いレベルで脳を模倣するポリエステル膜文化挿入システムに設定されます。BBB を成形フィルター hCMEC/D3 の内皮細胞と内腔コンパー?...

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A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain

Cellulo BBB (血液脳関門) の設定を記述したプロトコルをご紹介-Minibrain ポリエステル多孔性膜の文化は人間の BBB にわたって生体分子又は感染性病原体の運搬を評価するためにシステムを挿入、近隣の脳細胞の生理学的な影響は。

病原体や医薬品との相互作用、脳によって障壁の交差を勉強する人間の血-脳インターフェイス モデル

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the ...

この人間の血液脳インタフェースモデルは、神経系への分子の伝達を研究するのに有用である。微生物の研究だけでなく、感染した脳痛腫瘍に達する。この血液脳関門またはBBBモデルへのミニ脳の追加は、BBBが脳内で動作する原因となる病原体および分子の研究を可能にする。手順を破壊することはフロリアンバカオになります, 私の研究室のための博士課程の学生.BBBミニ脳ポリエステル膜培養挿入装置を設定するには、不完全な内皮細胞培地を挿入する1回の4番目の細胞に5倍10倍に細胞を希釈し、各ポリエステル膜培養液に適切な量の細胞を12ウェルプレートに添加する。次に、細胞が100%合流するまで挿入物と細胞培養インキュベーターを置く。1ミリリットルのポリDリジンを室温で4時間持つ12ウェルプレートを保持します。その後、一晩で1回のラミニン1回当たり。ラミニンを5%のウシ胎児血清、またはFBSで補った内皮細胞培地の1ミリリットルに置き換えます。1時間保育器に場所を置きます。ミニグレインを調製するために、ヒトニューロンのアストロサイトを5細胞のCHMEクローンに穏やかにトリプシン化する。細胞ペレットを完全な内皮細胞培地と関連付けます。3.6回で数えた後、5番目のニューロンとアストロサイトに0.4倍に10倍に5細胞当たり5細胞は12ウェルプレートを有する。そして、12ウェルプレートを播種します。播種後24時間にBBBミニ脳を構築し、使用済み培地を新鮮な完全な内皮細胞培地に置き換え、脳内血管内皮細胞をマイクロ脳細胞に塗布したポリエステル膜培養液をミニ脳細胞に移す。次に、BBB多くの脳デバイスをインキュベーターに入れる。BBBミニ脳内皮透過性を検証するには、新しい12ウェルプレートにウェルあたり1.5ミリリットルの輸送バッファーを追加します。そして、内皮細胞の障壁に影響を与えることなく慎重に媒体を除去するために、各フィルタを逆さまに反転させます。各フィルターを輸送バッファー充填プレートの 1 つのウェルに入れ、各ウェルに 0.5 ミリリットルのルシファーイエローを加えます。その後、プレートをインキュベーターに10分間入れてから、フィルターを新しい輸送バッファーに移し、12ウェルプレートを充填した。実証されたBBB多くの脳装置を設定した後、黄熱病ウイルス希釈のフランスの神経栄養ウイルス株の3500プラットホームユニットと2%FPS内皮細胞培地の50マイクロリットルを、非常に慎重に、明るいコンパートメントの上に加える。コントロール BBB ミニ脳をウイルスを含まない 2%FBS 内皮細胞培地の 50 マイクロリットルで接種します。その後、ウイルスは24時間インキュベーターにBBB多くの脳装置を暴露する。翌日、挿入物を取り除いて、内皮細胞透過性とコンパニオンを決定し、同様に実証した。各ウェルからサンプルの1ミリリットルを保存し、真ん中のコンパートメントでウイルスのチターを決定します。照明コンパートメントがアブラルコンパートメントに漏れないように、挿入してください。血液脳関門を越えて生体分子を標的とするニューロンの輸送を研究するには、目的の生体分子をインサートに加え、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。24時間後に遠隔から挿入し、内皮透過性を決定する。次に、ミニ脳内の目的とする生体分子の存在を検出するための適切な抗体で多くの脳細胞を染色する。ヒトの脳マイクロ血管内皮細胞は、その生物学的機能に関連する重要なタンパク質である受取器、エフラックストランスポーターまたはトランスポーターのすべてのサブセットを発現します。黄熱病ウイルスのいくつかのフランスの神経熱帯ウイルス株は、24時間で血液脳関門を越えることができます。ウイルスは、脳細胞内のウイルスの増殖によって次の2日間増幅します。さらに、この神経浸潤性ウイルス集団がミニ脳細胞上で連続的に通過し、ウイルス負荷に厳密に相関する場合、特異的ウイルスバイオマーカーの発現が刺激される。コンパートメント細胞貫通分子神経タグ神経ビタの限界に追加された後、神経タグ神経ビタは、血液脳関門を通過し、人間のニューロンを標的にすることができる。細胞貫通分子神経タグデルタニューロビタは内皮細胞の障壁を横切るが、ヒトニューロンをあまり効率的に標的としない。小さな中間コンパートメントに追加された後、細胞貫通分子ニューロタグNeurovitaは血液脳関門を横切り、傷ついた後、ヒトニューロンの軸索を再生することができます。細胞貫通分子ニューロタグニューロヴィータデルタとは対照的に、ニューロヴィータの非アクティブな形態。軸索掻き細胞貫通分子神経タグNeurovitaの後に適用すると、負傷したニューロンの神経保護とxゾナリの再生を引き起こす。厳密には、練習のために。I細胞の通路を過剰に使用しないでください。培地や領域の一部を維持し、マイコプラズマの存在を確認してみてください。ミニ脳と薬物の相互作用は、このまたは古典的な生物学を化学するトランスクリプトによってさらに研究することができる目的の微生物である技術と呼ばれる。

Research

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Neuroscience

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