Name: patient-derived orthotopic xenograft models for human urothelial cell carcinoma and colorectal cancer tumor growth and spontaneous metastasis
Uploaded: 2019-05-12T14:30:00
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Die Autoren danken Brian Reuter, Danielle Bertoni, Peter Miller und Shannon McChesney, die bei der Initiierung dieser Studien für ihre hervorragende technische Unterstützung geholfen haben. Die Autoren danken auch Heather Green Matrana, Margaret Variano, Sunil Talwar und Maria Latsis für die Unterstützung bei der Einwilligung von Patienten und der Bereitstellung von Tumorproben.

Alle in diesen Tierstudien beschriebenen Methoden wurden nach den genehmigten Richtlinien des Institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschusses des Ochsner Gesundheitssystems und in Übereinstimmung mit den Leitlinien für die Tierforschung durchgeführt. Alle Patiententumoren für diese Studie wurden von eingewilligten Patienten gesammelt, die sich in Übereinstimmung mit dem Ochsner Health System Investigative Review Board und den ethischen Standards des Institutionellen Ausschusses für Mensch und Gesundheitsschutz...

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	<li>Sundlisaeter, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis+in+colorectal+cancer--prognostic+and+therapeutic+aspects.">Lymphangiogenesis in colorectal cancer--prognostic and therapeutic aspects.</a> International Journal of Cancer. Journal international du cancer. 121, 1401-1409 (2007).</li><li>Gout, S., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cancer+microenvironment+in+metastasis:+focus+on+colon+cancer.">Role of cancer microenvironment in metastasis: focus on colon cancer.</a> Cancer Microenvironment. 1, 69-83 (2008).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: a Cancer Journal for Clinicians. 68, 7-30 (2018).</li><li>Hautmann, R. E., de Petriconi, R. C., Pfeiffer, C., Volkmer, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radical+cystectomy+for+urothelial+carcinoma+of+the+bladder+without+neoadjuvant+or+adjuvant+therapy:+long-term+results+in+1100+patients.">Radical cystectomy for urothelial carcinoma of the bladder without neoadjuvant or adjuvant therapy: long-term results in 1100 patients.</a> European Urology. 61, 1039-1047 (2012).</li><li>Stein, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radical+cystectomy+in+the+treatment+of+invasive+bladder+cancer:+long-term+results+in+1,054+patients.">Radical cystectomy in the treatment of invasive bladder cancer: long-term results in 1,054 patients.</a> Journal of Clinical Oncology. 19, 666-675 (2001).</li><li>Lerner, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rationale+for+en+bloc+pelvic+lymph+node+dissection+for+bladder+cancer+patients+with+nodal+metastases:+long-term+results.">The rationale for en bloc pelvic lymph node dissection for bladder cancer patients with nodal metastases: long-term results.</a> The Journal of Urology. 149, 758-764 (1993).</li><li>Poulsen, A. L., Horn, T., Steven, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radical+cystectomy:+extending+the+limits+of+pelvic+lymph+node+dissection+improves+survival+for+patients+with+bladder+cancer+confined+to+the+bladder+wall.">Radical cystectomy: extending the limits of pelvic lymph node dissection improves survival for patients with bladder cancer confined to the bladder wall.</a> The Journal of Urology. 160, 2015-2019 (2020).</li><li>Margolin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+stromal+cells+enhance+drug-resistant+colon+cancer+cell+tumor+formation+through+SDF-1alpha/CXCR4+paracrine+signaling.">Lymph node stromal cells enhance drug-resistant colon cancer cell tumor formation through SDF-1alpha/CXCR4 paracrine signaling.</a> Neoplasia. 13, 874-886 (2011).</li><li>Vermeulen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activity+defines+colon+cancer+stem+cells+and+is+regulated+by+the+microenvironment.">Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment.</a> Nature Cell Biology. 12, 468-476 (2010).</li><li>Margolin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+critical+roles+of+tumor-initiating+cells+and+the+lymph+node+stromal+microenvironment+in+human+colorectal+cancer+extranodal+metastasis+using+a+unique+humanized+orthotopic+mouse+model.">The critical roles of tumor-initiating cells and the lymph node stromal microenvironment in human colorectal cancer extranodal metastasis using a unique humanized orthotopic mouse model.</a> FASEB Journal. 29, 3571-3581 (2015).</li><li>Gills, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+patient-derived+orthotopic+xenograft+model+enabling+human+high-grade+urothelial+cell+carcinoma+of+the+bladder+tumor+implantation,+growth,+angiogenesis,+and+metastasis.">A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis.</a> Oncotarget. 9, 32718-32729 (2018).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).</li><li>Hiroshima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+mouse+models+of+cancer+need+to+be+orthotopic+in+order+to+evaluate+targeted+anti-metastatic+therapy.">Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy.</a> Oncotarget. 7, 71696-71702 (2016).</li><li>Kim, H. S., Zhang, X., Klyushnenkova, E., Choi, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+germinal+center+B+lymphocyte+proliferation+by+an+FDC-like+cell+line,+HK.">Stimulation of germinal center B lymphocyte proliferation by an FDC-like cell line, HK.</a> The Journal of Immunology. 155, 1101-1109 (1995).</li><li>Hite, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimal+Orthotopic+Mouse+Model+for+Human+Colorectal+Cancer+Primary+Tumor+Growth+and+Spontaneous+Metastasis.">An Optimal Orthotopic Mouse Model for Human Colorectal Cancer Primary Tumor Growth and Spontaneous Metastasis.</a> Diseases of the Colon and Rectum. 61, 698-705 (2018).</li><li>Jager, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-guided+intramural+inoculation+of+orthotopic+bladder+cancer+xenografts:+a+novel+high-precision+approach.">Ultrasound-guided intramural inoculation of orthotopic bladder cancer xenografts: a novel high-precision approach.</a> PloS One. 8, e59536 (2013).</li><li>Schirner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha5beta1:+a+potent+inhibitor+of+experimental+lung+metastasis.">Integrin alpha5beta1: a potent inhibitor of experimental lung metastasis.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 16, 427-435 (1998).</li><li>Ricci-Vitiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expansion+of+human+colon-cancer-initiating+cells.">Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells.</a> Nature. 445, 111-115 (2007).</li><li>Todaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colon+cancer+stem+cells+dictate+tumor+growth+and+resist+cell+death+by+production+of+interleukin-4.">Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4.</a> Cell Stem Cell. 1, 389-402 (2007).</li><li>Lee, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+establishment+features+of+orthotopic+murine+bladder+cancer+models.">Tumor establishment features of orthotopic murine bladder cancer models.</a> Korean Journal of Urology. 53, 396-400 (2012).</li><li>Hadaschik, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+validated+mouse+model+for+orthotopic+bladder+cancer+using+transurethral+tumour+inoculation+and+bioluminescence+imaging.">A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging.</a> BJU International. 100, 1377-1384 (2007).</li><li>Silinsky, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD+133++and+CXCR4++colon+cancer+cells+as+a+marker+for+lymph+node+metastasis.">CD 133+ and CXCR4+ colon cancer cells as a marker for lymph node metastasis.</a> The Journal of Surgical Research. 185, 113-118 (2013).</li></ol>

Metastasierende Erkrankungen sind für die meisten Krebspatientensterblichkeit verantwortlich. In präklinischen therapeutischen Tests ist es entscheidend, Mausmodelle zu etablieren, die das menschliche Tumorwachstum mit spontanen entfernten Organmetastasen am ehesten emulieren. Die Verwendung von murinen Modellen mit implantierten Patiententumor abgeleiteten Krebszellen (Xenografts) ermöglicht ein besseres Verständnis der Tumorbiologie und prädiktiver Biomarker sowie Tests und Vorhersagen antineoplastischer Wirkungen...

Es hat sich gezeigt, dass Lymphknoten (LN) Metastasierung ein schlechter prognostischer Indikator in vielen soliden Organ-Malignitäten ist, einschließlich hochgradiges urothelialer Zellkarzinom (UCC) der Blase und Dickdarmkrebs (CRC)1,2. Mehr als die Hälfte der Patienten mit muskelinvasivem UCC (MIUCC) wird trotz kurativer Therapie bei klinisch lokalisierten Erkrankungen Metastasen entwickeln und innerhalb von 5 Jahren sterben. Metastasierende CRC ist eine der Hauptursachen für krebsbedingte Todesfälle in den USA.
Schätzungsweise 81.190 neue Patienten und 17.240 krebsspezifische Todesfälle werden 2018 in den Vereinigten Staaten aufgrund von UCC der Blase3,4erwartet. Während die Patienten überwiegend (70%) bei nicht-muskelinvasiven Erkrankungen vorhanden sind, haben 30% MIUCC5. Trotz der kurativen Therapie (radikale Zystektomie [RC] mit oder ohne systemische Chemotherapie) bei klinisch lokalisierten Erkrankungen wird die Hälfte der Patienten mit MIUCC der Blase noch Metastasen entwickeln und innerhalb von 5 Jahren sterben3. Die Beteiligung von Lymphknoten findet sich bei ca. 20% bis 25% der Patienten, die RC6,7,8. Die 5-Jahres-Überlebensrate bei LN-positiven Patienten liegt selbst nach RC unter 35 %, was auf eine Beteiligung der LN als entscheidenden negativen Prädiktor für die Prognose bei UCC-Patienten hindeutet.
Darmkrebs ist die dritthäufigste Krebserkrankung bei Männern und Frauen in den Vereinigten Staaten. Die Patientenergebnisse hängen weitgehend von Tumoreigenschaften und Tumormikroumgebung ab, wie z. B. Invasionstiefe, LN-Beteiligung und entfernte Organmetastasen. Obwohl die Sterblichkeitsrate in CRC in den letzten zehn Jahren aufgrund von Screening und effektiven Operationen gesunken ist, wird geschätzt, dass fast 50% der CRC-Patienten Metastasen oder wiederkehrende Krankheiten entwickeln werden9.
Kleine Tiermodelle bieten eine schnelle, reproduzierbare und veränderbare Plattform, um die Tumorprogression und verschiedene metastasierende Muster zu untersuchen. Es gibt derzeit keine beschriebenen Xenograft-Modelle, die CRC- und UCC-Metastasen bei Patienten konsequent imitieren. Der primäre Weg der krebsfernen Metastasierung ist über lymphatische Ausbreitung. Neue Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass die LNs Tumoren eine einzigartige Mikroumgebung bieten und nicht nur nur stationäre Ziele sind, bei denen Krebszellen vorübergehend passieren, sondern auch eine integrale Rolle spielen, indem sie mit Krebszellen im metastasierenden Prozess interagieren. Tatsächlich haben unsere Studien herausgefunden, dass neben der Aufklärung und Förderung der Tumorprogression und Metastasen auch die stromale Mikroumgebung von LN für die Arzneimittelresistenz in SCR10,11verantwortlich ist. Unser Labor hat vor kurzem die tumorgene Wirkung von LN-Stromalzellen (LNSCs) auf CRC und UCCs mit patientenabgeleiteten orthotopischen Xenograft (PDOX) Mausmodellen12,13bestätigt.

Die Entwicklung von PDOX-Modellen bietet eine wichtige Plattform für die translationale Krebsforschung14,15. Durch die Aufrechterhaltung der wichtigsten histologischen und genetischen Eigenschaften ihres Spendertumors bleiben PDOX-Modelle über Passagen hinweg stabil und bilden gute Plattformen für die translationale Krebsforschung12,15. PDOX-Modelle werden für die präklinische Arzneimittelbewertung, Biomarker-Identifikation und präklinische Bewertung personalisierter Arzneimittelstrategien verwendet, die eine Vorhersage klinischer Ergebnisse ermöglichen. Derzeit gibt es keine beschriebenen Xenograft-Modelle, die die Bedeutung der LN-Beteiligung berücksichtigen und in der Lage sind, primärtumor und entfernte Organmetastasen in CRC und UCC konsequent zu reproduzieren. In dieser Studie beschreiben wir die Entwicklung von PDOX-Modellen bei NOD/SCID-Mäusen mit Reproduktion von metastasierenden CRC- und UCC-Erkrankungen unter Beteiligung von LNSC.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Avidin-biotin-peroxidase</td>
			<td>Vector Labs Inc</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated secondary antibody</td>
			<td>Vector Labs Inc</td>
			<td>BA-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV (1.5 mg/mL)</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin (150 mg/kg)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin (10% neutral buffered)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>46129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine (2 nM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Removal Cream</td>
			<td>Church &#38; Dwight Co., Inc</td>
			<td>1 (800) 248-8820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH30016.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase (20 mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>108333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luc/RFP-lentivirus</td>
			<td>From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#8217;s medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>110862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>110636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Oxygen</td>
			<td>Airgas Inc</td>
			<td>OX USP200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% CO2</td>
			<td>Airgas Inc</td>
			<td>CD USPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-8 week old NOD/SCID Mice (male)</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>001303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-8 week old NOD/SCID Mice (female)</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>001303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GHS232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>RM-9106-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>11799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>15762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm Tissue Culture Dish</td>
			<td>USA Scientific Inc</td>
			<td>CC7682-3614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well plate</td>
			<td>USA Scientific Inc</td>
			<td>CC7682-7596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Symmetry Surgical Inc</td>
			<td>06-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Symmetry Surgical Inc</td>
			<td>02-2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 humidified incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescent (BLI) Imaging Machine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLI Imaging Machine Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>366830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deconvoluting Microscope</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td>Marianas</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deconvoluting Microscope Imaging Software</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td>+1 (303) 607-9429 x1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital caliper</td>
			<td>Fowler Tools and Instruments</td>
			<td>54-115-330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Precision Instruments LLC</td>
			<td>(504) 228-0076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrosurgical generator</td>
			<td>ValleyLab</td>
			<td>FORCE1C20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Induction Chamber</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>119038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>American Optical Corporation</td>
			<td>829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Aid</td>
			<td>Fisher Healthcare</td>
			<td>13-681-15E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet (10 mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

patient-derived orthotopic xenograft models for human urothelial cell carcinoma and colorectal cancer tumor growth and spontaneous metastasis

Krebspatienten haben schlechte Prognosen, wenn Lymphknoten (LN) Beteiligung sowohl in hochgradigen urotheliale Zellkarzinom (HG-UCC) der Blase und Dickdarmkrebs (CRC) vorhanden ist. Mehr als 50% der Patienten mit muskelinvasivem UCC werden trotz kurativer Therapie für klinisch lokalisierte Krankheiten metastasen und innerhalb von 5 Jahren sterben, und metastasierendes CRC ist eine der Hauptursachen für krebsbedingte Todesfälle in den USA. Xenograft-Modelle, die UCC- und CRC-Metastasen bei Patienten konsequent imitieren, werden benötigt. Diese Studie zielt darauf ab, patientenabgeleitete orthotopische Xenograft (PDOX)-Modelle von UCC und CRC für primäres Tumorwachstum und spontane Metastasen unter dem Einfluss von LN-Stromalzellen zu generieren, die das Fortschreiten menschlicher metastasierender Erkrankungen für das Arzneimittelscreening imitieren. Frische UCC- und CRC-Tumoren wurden von einvernehmlichen Patienten gewonnen, die sich einer Resektion für HG-UCC bzw. kolorektales Adenokarzinom unterziehen. Ko-inokuliert mit LN-Stromalzellen (LNSC) analogen HK-Zellen wurden luziferase-markierte UCC-Zellen intravesisch (IB) in weibliche nicht-fettleibige diabetische/schwere kombinierte Immundefizienz (NOD/SCID)-Mäuse eingeflößt, und CRC-Zellen wurden intrarektifal (IR) in nod/SCID-Mäusen. Tumorwachstum und Metastasen wurden wöchentlich mit Hilfe der Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) überwacht. Nach dem Opfer wurden Primärtumoren und Mausorgane geerntet, gewogen und formal für Hämatoxylin und Eosin und Immunhistochemie Färbung fixiert. In unseren einzigartigen PDOX-Modellen ähneln Xenograft-Tumoren Patienten-Präimplantationstumoren. In Gegenwart von HK-Zellen weisen beide Modelle hohe Tumorimplantationsraten auf, die mit BLI und Tumorgewichten gemessen werden, 83,3 % für UCC und 96,9 % für CRC und hohe Metastasenraten des entfernten Organs (33,3 % nachgewiesene Leber- oder Lungenmetastasierung für UCC und 53,1 % für CRC). Darüber hinaus haben beide Modelle null Sterblichkeit aus dem Verfahren. Wir haben einzigartige, reproduzierbare PDOX-Modelle für menschliche sHG-UCC und CRC etabliert, die Tumorbildung, Wachstum und Metastasierungsstudien ermöglichen. Mit diesen Modellen können Tests neuartiger therapeutischer Medikamente effizient und klinisch mimetisch durchgeführt werden.

Im UCC PDOX-Modell wurden die BlCaPt15- oder BlCaPt37-Zellen von UCC-Patienten intravesisch (IB) in Gegenwart von HK-Zellen in die weibliche NOD/SCID-Mausblase eingeflößt (Abbildung 1A). 25 von 30 (83,3%) Tiere erzeugten primäre Tumoren und zeigten zeitabhängiges primäres Tumorwachstum basierend auf wöchentlichem BLI (Abbildung 1B, C und Tabelle 1). Ebenso sind im CRC PDOX-Modell 31 von 32 ...

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Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von orthotopischen Xenograft-Modellen durch intravesische Instillation hochwertiger urotheliaaler Zellkarzinomzellen oder intrarekt injizierende Darmkrebszellen in nicht-fettleibige diabetische/schwere kombinierte Immundefizienz (NOD/SCID) Mäuse für primäres Tumorwachstum und spontane Metastasen unter dem Einfluss von Lymphknoten-Stromalzellen, die das Fortschreiten menschlicher metastasierender Erkrankungen imitieren.

Patientenabgeleitete orthotopische Xenograft-Modelle für humanes Urotheliale Zellkarzinom und Kolorektalkrebs-Tumorwachstum und spontane Metastasierung

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Modelle werden benötigt, um Krebsmetastasen durch die Interaktion mit Lymphknoten konsequent nachzuahmen. Bei Patienten mit Dickdarm- und Urothelzellkrebs der Blase. Unsere in diesem Beitrag beschriebenen orthotopischen xenographischen Modelle können helfen, diese wichtigen biologischen Fragen zu beantworten und neue Therapien effizient und klinisch relevant zu testen.Unsere orthotopischen Xenograft-Tumoren, die bei Mäusen produziert werden, ähneln dem Tumor der Patienten. In Gegenwart von Lymphknoten-Stromalzellen haben beide Modelle eine höhere Tumorimplantation und entfernte Organmetastasierungsraten und -stellen, die menschliche metastasierende Muster imitieren. Außerdem haben beide Tiermodelle keine verfahrensbedingte Sterblichkeit.Nach der Entfernung von Patienten-Tumoren von eingeschläferten Mäusen, verwenden Sie sterile chirurgische Schere, um Luziferase positive Tumorstücke so klein wie möglich in einer Petrischale unter einer laminaren Strömungshaube zu hacken. Übertragen Sie die Tumorstücke in ein steriles 50 ml konisches Rohr. Zur Herstellung der Verdauungslösung 10 ml Kollagenase Typ 4, 80 Mikroliter Hyaluronidase und 160 Mikroliter Desoxyribonuklease Typ 1 bis 40 ml HBSS hinzufügen und durch Invertieren mischen.Fügen Sie 35-40 ml der Verdauungslösung zu gehackten Tumor und inkubieren bei 37 Grad Celsius mit kontinuierlicher Rotation für 2 Stunden mit periodischem kräftigen Schütteln. Um Die Trümmer nach der Verdauung zu entfernen, filtern Sie den verdauten Tumor durch steriles 100-Mikrometer-Zellsieb, gefolgt von einer Filtration durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb, das den Durchfluss in einem 50 ml-Rohr jedes Mal rettet und die Trümmer entsorgt. Um freie Zellen zu waschen, fügen Sie 20 ml HBSS in den Durchfluss und Zentrifuge bei 329-facher Schwerkraft für 5 Minuten.Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 30 ml HBSS wieder auf. Übertragen Sie 100.000 Tumorzellen in ein steriles 15 ml konisches Rohr und fügen Sie 300.000 zuvor vorbereitete frische HK-Zellen hinzu. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 329-facher Schwerkraft für 5 Minuten und entsorgen Sie den Überstand durch Aspiration.Setzen Sie die Zellen in komplettem RPMI-Medium wieder aus und halten Sie auf Eis, bis sie einsatzbereit sind. Um das Tier für die UCC-Zellinjektion vorzubereiten, verwenden Sie Haarentfernungscreme, um den unteren Rücken einer 6-8 Wochen alten weiblichen NOD-SCID-Maus zu rasieren. Um UCC-Zellen in eine Blase zu verabreichen, richten Sie zunächst eine monopolare Elektrokauter-Maschine mit einer Leistung von 4 Watt ein.Nach der Anästhesisierung der Maus, legen Sie sie in Supine-Position mit seiner Schnarbe in einem Isofluran-Nasenkegel und nackten Rücken fest geerdet auf einer dispergierten Elektrode. Schmieren Sie einen 24 Gauge Angiokatheter mit Schmiergelee und legen Sie den Angiokatheter sanft, aber fest durch die Harnröhre der Maus ein. Wenn sich der Katheter beim Einstieg biegt, legen Sie den Führungsdraht auf halbem Weg in den Katheter ein, um Stabilität zu gewährleisten.Dann legen Sie den 0,64 Millimeter festen Kern-Geradendraht 1 Millimeter hinter dem Ende des Angiokatheters vollständig ein. Halten Sie den Monopolstift eine Sekunde lang an den Führungsdraht, was eine elektrische Reizung der Blasenschleimhaut ermöglicht. Befestigen Sie eine frische, sterile Angiokatheter an 1 ml leur Schlossspritze und ziehen Sie bis zu 200 Mikroliter UCC-Zellen, die in früheren Schritten hergestellt wurden.Entfernen Sie Führungsdraht und Angiokatheter aus der Harnröhre und setzen Sie dann Angiocatheter mit einer Spritze von Zellen ein, die daran befestigt sind. Injizieren Sie 50 Mikroliter der Zellen in die Mausblase und damit die Zellen an der Blasenwand haften, warten Sie einige Sekunden, bevor Sie den Angiokatheter entfernen. Schließlich entfernen Sie die Maus von Isofluran Nasenkegel und Erdungpad und beobachten Sie es für 1 Stunde nach dem Verfahren für Anzeichen von Not.Um crC-Mausmodell zu erstellen, legen Sie eine anästhesierte 6-8 Wochen alte männliche NOD-SCID-Maus in Supine-Position unter einem Sezierendes Mikroskop, das die Schnaue und IsofluranNasenkegel und die vorderen Gliedmaßen mit Klebeband für Stabilität sichert. Platzieren Sie ein kleines Objekt wie einen kleinen Gazeabschnitt unter der Basis des Schwanzes, der den Anus erhöht, um die Visability und den Winkel zu verbessern. Verwenden Sie gekrümmte geschmierte stumpf gekippte Zangen, um den Analkanal zu verdünnen und die distale anale und rektale Schleimhaut freizulegen und Kot zu entfernen.Schließen Sie eine sterile abnehmbare 30-Spur-Nadel an eine 50-Mikroliter-Glasspritze an. Zeichnen Sie 10 Mikroliter Tumor- und HK-Zellzellsuspension, die in früheren Schritten hergestellt wurden, in die Spritze. Injizieren Sie die 10 Mikroliter in die distale hintere rektale Submucosa 1-2 Millimeter über dem Analkanal, um sicherzustellen, dass sie nicht in die Beckenhöhle gelangen.Schließlich entfernen Sie die Maus von Isofluran Nasenkegel und beobachten Sie es für eine Stunde nach dem Verfahren für Anzeichen von Not. Um wöchentlich die primäre Tumor-, Leber- und Lungenmetastasatheatheur in beiden Mausmodell zu überwachen, zuerst, wiegen Sie die Maus. Injizieren Sie 150 mg/kg Luziferin intraperitoneal und warten Sie 5 Minuten, bis das Substrat im Körper zirkuliert.Legen Sie die anästhesierte Maus in ein biolumineszierendes Bildgebungssystem mit nase fixiert in Nasenkegel, um sicherzustellen, dass der Interessenbereich, die die ventrale Seite des Tieres ist, für jedes Bild der Kamera zugewandt ist. Bildmaus in supine Position wöchentlich für Luziferase-Aktivität. Nach dem Schneiden und Färben von paraffineingebetteten isolierten Geweben, beobachten Sie sie mit einem hochleistungsstarken Mikroskop.Im UCC-Mausmodell erzeugten 83,3 Prozent der Tiere Primärtumoren und zeigten auf der Grundlage wöchentlicher Biolumineszenzmessungen ein zeitabhängiges primäres Tumorwachstum. Im CRC-Mausmodell wuchsen 96,9 % der Mäuse primär tumoren. Je nach Patiententumor hatte das Wachstum des Maustumors eine andere Latenzzeit, die den Unterschied in den klinischen Eigenschaften der Patienten widerspiegelt.Sowohl in intravesikelals als auch in intrarektalen Modellen erzeugte die Tumorzellinjektion orthotopische Primärtumoren. Darüber hinaus entwickelten 33,3 % bzw. 53,1 % der Mäuse, die mit UCC-Zellen und CRC-Zellen mit HK-Zellen eingeflößt wurden, eine entfernte Organmetastasierung. Die Histopathologie von Xenografts im UCC-Modell wurde mit dem primären Blasenkarzinom des Primärpatienten verglichen.Die Färbeergebnisse von Xenografts ähnelten denen in den ursprünglichen chirurgischen Biopsien und bestätigten eine ähnliche Gewebemorphologie. Antikörper gegen Ki67, einen menschlichen Zellproliferationsmarker, zeigt eine positive Kernfärbung, die auf hoch vermehrende, schnell wachsende menschliche Tumorzellen hinweist. In ähnlicher Weise zeigt h&E-Färbung im CRC-Modell die Ähnlichkeit der Architektur zwischen Xenografts und Patiententumoren an.Antikörperfärbung gegen Cytokeratin 20 zeigte auch ähnliche Tumorwachstumsmuster in beiden CRC-Modellen. Der Schlüssel zu diesen Verfahren ist es, die Tiere sanft, aber fest zu behandeln. Üben mit einer ruhigen Hand ist der beste Weg, um diese Techniken sicher durchzuführen und die besten Ergebnisse zu erzielen.Sobald diese Modelle hergestellt sind, können mehrere verschiedene Formen von Krebstherapien getestet werden, einschließlich Kombinationen von aktuellen Medikamenten sowie neu entwickelte Therapien vor klinischen Studien bei Patienten. Es ist wichtig, daran zu denken, dass der Umgang mit Krebszellen und nadeln von erfahrenem Personal zu ihrer Sicherheit sowie um optimale Ergebnisse zu erzielen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine experimentellen Modell der ursprünglichen Tumor-Entwicklung und Peritoneal Metastasierung<em&gt; über</em&gt; Orthotopische Inokulation mit Ovarialkarzinomzellen

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

Forschung

Krebsforschung

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Entwicklung und Wartung eines Präklinische Patienten gewonnen Tumorxenotransplantates Modell für die Untersuchung von neuartigen Anti-Krebs-Therapien

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Die Markierung von Brustkrebs-Patienten stamm Xenografts mit Nachvollziehbare Reporter für Tumorwachstum und Metastasierung Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen in einem orthotopischen Mausmodell des Darmkrebses

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Tumor Engraftment in einem Xenograft-Maus-Modell der menschlichen Mantel-Zell-Lymphom

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patientenabgeleitetes heterogenes Xenograft-Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs mit Zebrafischlarven als Wirte für vergleichende Arzneimittelbewertung

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Ein melanompatientenabgeleitetes Xenograft-Modell

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablierung von vom Magenkrebs abgeleiteten Xenograft-Modellen und Primärzelllinien

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

Die Etablierung und Nutzung von patientenabgeleiteten Xenograft-Modellen der Metastasierung des Zentralnervensystems

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Intratibial Osteosarcoma Cell Injection to Generate Orthotopic Osteosarcoma and Lung Metastasis Mouse Models

Intratibiale Osteosarkom-Zellinjektion zur Erzeugung orthotoper Osteosarkom- und Lungenmetastasen-Mausmodelle

Osteosarcoma is the most common primary bone cancer in children and adolescents, with lungs as the most common metastatic site. The five-year survival ...