Name: patient-derived orthotopic xenograft models for human urothelial cell carcinoma and colorectal cancer tumor growth and spontaneous metastasis
Uploaded: 2019-05-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis at JoVE.com

Gli autori ringraziano Brian Reuter, Danielle Bertoni, Peter Miller e Shannon McChesney che hanno contribuito ad avviare questi studi per il loro eccellente supporto tecnico. Gli autori ringraziano anche Heather Green Matrana, Margaret Variano, Sunil Talwar e Maria Latsis per l'assistenza nei pazienti consenzienti e nella fornitura di campioni di tumore.

Tutti i metodi descritti in questi studi sugli animali sono stati condotti secondo le linee guida approvate del Comitato istituzionale per la cura degli animali e l'uso del sistema sanitario di Ochsner e in conformità con le linee guida per la ricerca sugli animali. Tutti i tumori dei pazienti per questo studio sono stati raccolti da pazienti acconsentiti sottoposti a interventi chirurgici di resezione del cancro in conformità con l'Ochsner Health System Investigative Review Board e gli standard etici del Comitato Isti...

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	<li>Sundlisaeter, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis+in+colorectal+cancer--prognostic+and+therapeutic+aspects.">Lymphangiogenesis in colorectal cancer--prognostic and therapeutic aspects.</a> International Journal of Cancer. Journal international du cancer. 121, 1401-1409 (2007).</li><li>Gout, S., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cancer+microenvironment+in+metastasis:+focus+on+colon+cancer.">Role of cancer microenvironment in metastasis: focus on colon cancer.</a> Cancer Microenvironment. 1, 69-83 (2008).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: a Cancer Journal for Clinicians. 68, 7-30 (2018).</li><li>Hautmann, R. E., de Petriconi, R. C., Pfeiffer, C., Volkmer, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radical+cystectomy+for+urothelial+carcinoma+of+the+bladder+without+neoadjuvant+or+adjuvant+therapy:+long-term+results+in+1100+patients.">Radical cystectomy for urothelial carcinoma of the bladder without neoadjuvant or adjuvant therapy: long-term results in 1100 patients.</a> European Urology. 61, 1039-1047 (2012).</li><li>Stein, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radical+cystectomy+in+the+treatment+of+invasive+bladder+cancer:+long-term+results+in+1,054+patients.">Radical cystectomy in the treatment of invasive bladder cancer: long-term results in 1,054 patients.</a> Journal of Clinical Oncology. 19, 666-675 (2001).</li><li>Lerner, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rationale+for+en+bloc+pelvic+lymph+node+dissection+for+bladder+cancer+patients+with+nodal+metastases:+long-term+results.">The rationale for en bloc pelvic lymph node dissection for bladder cancer patients with nodal metastases: long-term results.</a> The Journal of Urology. 149, 758-764 (1993).</li><li>Poulsen, A. L., Horn, T., Steven, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radical+cystectomy:+extending+the+limits+of+pelvic+lymph+node+dissection+improves+survival+for+patients+with+bladder+cancer+confined+to+the+bladder+wall.">Radical cystectomy: extending the limits of pelvic lymph node dissection improves survival for patients with bladder cancer confined to the bladder wall.</a> The Journal of Urology. 160, 2015-2019 (2020).</li><li>Margolin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+stromal+cells+enhance+drug-resistant+colon+cancer+cell+tumor+formation+through+SDF-1alpha/CXCR4+paracrine+signaling.">Lymph node stromal cells enhance drug-resistant colon cancer cell tumor formation through SDF-1alpha/CXCR4 paracrine signaling.</a> Neoplasia. 13, 874-886 (2011).</li><li>Vermeulen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activity+defines+colon+cancer+stem+cells+and+is+regulated+by+the+microenvironment.">Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment.</a> Nature Cell Biology. 12, 468-476 (2010).</li><li>Margolin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+critical+roles+of+tumor-initiating+cells+and+the+lymph+node+stromal+microenvironment+in+human+colorectal+cancer+extranodal+metastasis+using+a+unique+humanized+orthotopic+mouse+model.">The critical roles of tumor-initiating cells and the lymph node stromal microenvironment in human colorectal cancer extranodal metastasis using a unique humanized orthotopic mouse model.</a> FASEB Journal. 29, 3571-3581 (2015).</li><li>Gills, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+patient-derived+orthotopic+xenograft+model+enabling+human+high-grade+urothelial+cell+carcinoma+of+the+bladder+tumor+implantation,+growth,+angiogenesis,+and+metastasis.">A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis.</a> Oncotarget. 9, 32718-32729 (2018).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).</li><li>Hiroshima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+mouse+models+of+cancer+need+to+be+orthotopic+in+order+to+evaluate+targeted+anti-metastatic+therapy.">Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy.</a> Oncotarget. 7, 71696-71702 (2016).</li><li>Kim, H. S., Zhang, X., Klyushnenkova, E., Choi, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+germinal+center+B+lymphocyte+proliferation+by+an+FDC-like+cell+line,+HK.">Stimulation of germinal center B lymphocyte proliferation by an FDC-like cell line, HK.</a> The Journal of Immunology. 155, 1101-1109 (1995).</li><li>Hite, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimal+Orthotopic+Mouse+Model+for+Human+Colorectal+Cancer+Primary+Tumor+Growth+and+Spontaneous+Metastasis.">An Optimal Orthotopic Mouse Model for Human Colorectal Cancer Primary Tumor Growth and Spontaneous Metastasis.</a> Diseases of the Colon and Rectum. 61, 698-705 (2018).</li><li>Jager, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-guided+intramural+inoculation+of+orthotopic+bladder+cancer+xenografts:+a+novel+high-precision+approach.">Ultrasound-guided intramural inoculation of orthotopic bladder cancer xenografts: a novel high-precision approach.</a> PloS One. 8, e59536 (2013).</li><li>Schirner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha5beta1:+a+potent+inhibitor+of+experimental+lung+metastasis.">Integrin alpha5beta1: a potent inhibitor of experimental lung metastasis.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 16, 427-435 (1998).</li><li>Ricci-Vitiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expansion+of+human+colon-cancer-initiating+cells.">Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells.</a> Nature. 445, 111-115 (2007).</li><li>Todaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colon+cancer+stem+cells+dictate+tumor+growth+and+resist+cell+death+by+production+of+interleukin-4.">Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4.</a> Cell Stem Cell. 1, 389-402 (2007).</li><li>Lee, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+establishment+features+of+orthotopic+murine+bladder+cancer+models.">Tumor establishment features of orthotopic murine bladder cancer models.</a> Korean Journal of Urology. 53, 396-400 (2012).</li><li>Hadaschik, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+validated+mouse+model+for+orthotopic+bladder+cancer+using+transurethral+tumour+inoculation+and+bioluminescence+imaging.">A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging.</a> BJU International. 100, 1377-1384 (2007).</li><li>Silinsky, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD+133++and+CXCR4++colon+cancer+cells+as+a+marker+for+lymph+node+metastasis.">CD 133+ and CXCR4+ colon cancer cells as a marker for lymph node metastasis.</a> The Journal of Surgical Research. 185, 113-118 (2013).</li></ol>

La malattia metastatica è responsabile della maggior parte dei decessi dei pazienti affetti da cancro. Nei test terapeutici pre-clinici, è fondamentale stabilire modelli murini che emulano più da vicino la crescita del tumore umano con metastasi spontanee di organi distanti. L'utilizzo di modelli murini con cellule tumorali derivate dal tumore del paziente impiantato (xenografi) consente una migliore comprensione della biologia tumorale e dei biomarcatori predittivi, nonché test e previsioni degli effetti antineoplas...

È stato dimostrato che la metastasi dei linfonodi (LN) è un indicatore prognostico incattive in molte neoplasie dell'organo solido, tra cui il carcinoma a cellule uroteliali di alto grado (UCC) della vescica e del cancro colorettale (CRC)1,2. Oltre la metà dei pazienti con UCC muscolo-invasivo (MIUCC), nonostante la terapia curativa per la malattia clinicamente localizzata, svilupperà metastasi e morirà entro 5 anni. Il CRC metastatico è una delle principali cause di morte legata al cancro negli Stati Uniti.
Si stima che 81.190 nuovi pazienti e 17.240 decessi specifici per il cancro si verifichino nel 2018 negli Stati Uniti a causa dell'UCC della vescica3,4. Mentre i pazienti saranno prevalentemente (70%) presente con malattia invasiva non muscolare, il 30% avrà MIUCC5. Nonostante la terapia curativa (cistectomia radicale [RC] con o senza chemioterapia sistemica) per la malattia localizzata clinicamente, la metà dei pazienti con MIUCC della vescica svilupperà ancora metastasi e morirà entro 5 anni3. Il coinvolgimento dei linfonodi si trova in circa il 20%-25% dei pazienti che hanno subito RC6,7,8. Il tasso di sopravvivenza a cinque anni nei pazienti positivi a LN è inferiore al 35% anche dopo RC, suggerendo il coinvolgimento di LN come predittore negativo cruciale per la prognosi nei pazienti ucc.
Il cancro colorettale è il terzo cancro più comune diagnosticato sia negli uomini che nelle donne negli Stati Uniti. Gli esiti del paziente dipendono in gran parte dalle caratteristiche tumorali e dal microambiente tumorale, come la profondità di invasione, il coinvolgimento di LN e le metastasi di organi distanti. Anche se il tasso di mortalità nel CRC è diminuito nell'ultimo decennio a causa di screening e interventi chirurgici efficaci, si stima che quasi il 50% dei pazienti crC svilupperà metastasi o malattie ricorrenti9.
I piccoli modelli animali forniscono una piattaforma rapida, riproducibile e modificabile per studiare la progressione del tumore e diversi modelli metastatici. Attualmente non esistono modelli di xenotrapianto descritti che imitano costantemente la metastasi CRC e UCC osservata nei pazienti. La via primaria della metastasi a distanza di cancro è attraverso la diffusione linfatica. Una nuova ricerca suggerisce che le LN forniscono ai tumori un microambiente unico, e non sono solo bersagli fissi in cui le cellule tumorali passano transitoriamente, ma svolgono anche un ruolo fondamentale interagendo con le cellule tumorali nel processo metastatico. Infatti, i nostri studi hanno scoperto che, oltre a educare e promuovere la progressione e le metastasi del tumore, il microambiente stromale LN è anche responsabile della resistenza ai farmaci in CRC10,11. Il nostro laboratorio ha recentemente confermato gli effetti tumorigeni delle cellule stromali LN (LNSC) su CRC e UCC utilizzando modelli murini ortotopici (PDOX) derivati dal paziente12,13.

Lo sviluppo di modelli DoDOX fornisce un'importante piattaforma per la ricerca traslazionale sul cancro14,15. Mantenendo le principali caratteristiche istologiche e genetiche del tumore del donatore, i modelli PDOX rimangono stabili tra i passaggi e rendono buone piattaforme per la ricerca traslazionale sul cancro12,15. I modelli DODoX vengono utilizzati per la valutazione preclinica dei farmaci, l'identificazione dei biomarcatori e la valutazione preclinica di strategie di medicina personalizzate che consentono la previsione degli esiti clinici. Attualmente, non esistono modelli di xenotrapianto descritti che considerino l'importanza del coinvolgimento di LN e siano in grado di riprodurre costantemente il tumore primario e la metastasi dell'organo distante nel CRC e nell'UCC. In questo studio, descriviamo lo sviluppo di modelli PDOX in topi NOD/SCID con riproduzione di malattie metastatiche CRC e UCC con coinvolgimento LNSC.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Avidin-biotin-peroxidase</td>
			<td>Vector Labs Inc</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated secondary antibody</td>
			<td>Vector Labs Inc</td>
			<td>BA-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV (1.5 mg/mL)</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin (150 mg/kg)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin (10% neutral buffered)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>46129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine (2 nM)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Removal Cream</td>
			<td>Church &#38; Dwight Co., Inc</td>
			<td>1 (800) 248-8820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH30016.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase (20 mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>108333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luc/RFP-lentivirus</td>
			<td>From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#8217;s medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>110862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 Medium</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>110636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Oxygen</td>
			<td>Airgas Inc</td>
			<td>OX USP200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% CO2</td>
			<td>Airgas Inc</td>
			<td>CD USPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-8 week old NOD/SCID Mice (male)</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>001303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-8 week old NOD/SCID Mice (female)</td>
			<td>Jackson Lab</td>
			<td>001303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GHS232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>RM-9106-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>11799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>15762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm Tissue Culture Dish</td>
			<td>USA Scientific Inc</td>
			<td>CC7682-3614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well plate</td>
			<td>USA Scientific Inc</td>
			<td>CC7682-7596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Symmetry Surgical Inc</td>
			<td>06-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Symmetry Surgical Inc</td>
			<td>02-2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 humidified incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescent (BLI) Imaging Machine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLI Imaging Machine Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>366830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deconvoluting Microscope</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td>Marianas</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deconvoluting Microscope Imaging Software</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td>+1 (303) 607-9429 x1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital caliper</td>
			<td>Fowler Tools and Instruments</td>
			<td>54-115-330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Precision Instruments LLC</td>
			<td>(504) 228-0076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrosurgical generator</td>
			<td>ValleyLab</td>
			<td>FORCE1C20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Induction Chamber</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>119038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>American Optical Corporation</td>
			<td>829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Aid</td>
			<td>Fisher Healthcare</td>
			<td>13-681-15E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipet (10 mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

patient-derived orthotopic xenograft models for human urothelial cell carcinoma and colorectal cancer tumor growth and spontaneous metastasis

I pazienti oncologici hanno una prognosi scarsa quando il coinvolgimento dei linfonodi (LN) è presente sia nel carcinoma a cellule uroteliali di alto grado (HG-UCC) della vescica e del cancro del colon-retto (CRC). Più del 50% dei pazienti con UCC invasivo muscolare, nonostante la terapia curativa per malattie clinicamente localizzate, svilupperà metastasi e morirà entro 5 anni, e il CRC metastatico è una delle principali cause di decessi correlati al cancro negli Stati Uniti. Sono necessari modelli Xenograft che imitano costantemente la metastasi di UCC e CRC osservati nei pazienti. Questo studio ha lo scopo di generare modelli di xenotrapianto ortotopico (DOX) derivati dal paziente di UCC e CRC per la crescita primaria del tumore e metastasi spontanee sotto l'influenza di cellule stromali LN che imitano la progressione delle malattie metastatiche umane per lo screening farmacologico. I tumori freschi di UCC e CRC sono stati ottenuti da pazienti conacchiti sottoposti a resezione rispettivamente per HG-UCC e adenocarcinoma colorettale. Co-inoculate con cellule HK analogiche con cellule nt-lmusali LN (LNSC), cellule UCC con tag luciferasi sono state intra-veseticamente (IB) instillate in topi da parentedeficisi diabetici/gravi (NOD/SCID) inebiti inominati in obliamente (IR) topi maschi NOD/SCID. La crescita tumorale e la metastasi sono state monitorate settimanalmente utilizzando l'imaging della bioluminescenza (BLI). Dopo il sacrificio, i tumori primari e gli organi murini furono raccolti, pesati e fissati in formalina per l'ematossiae e l'eosina e la colorazione immunoistochimica. Nei nostri modelli PDOX unici, i tumori dello xenotrapianto assomigliano ai tumori preimpianto del paziente. In presenza di cellule HK, entrambi i modelli hanno alti tassi di impianto tumorale misurato da PESI BLI e tumorali, 83,3% per UCC e 96,9% per il CRC, e alti tassi di metastasi dell'organo distante (33,3% rilevato metastasi epatica o polmonare per UCC e 53,1% per CRC). Inoltre, entrambi i modelli hanno mortalità zero dalla procedura. Abbiamo stabilito modelli PDOX unici e riproducibili per gli studi umani HG-UCC e CRC, che consentono la formazione di tumori, la crescita e gli studi sulle metastasi. Con questi modelli, il test di nuovi farmaci terapeutici può essere eseguito in modo efficiente e clinicamente mimetico.

Nel modello UCC PDOX, le cellule BlCaPt15 o BlCaPt37 dei pazienti UCC sono state instillate inmodo-vesicalmente (IB) in presenza di cellule HK nella vescica muraria NOD/SCID femminile (Figura 1A). Venticinque su trenta (83,3%) gli animali hanno generato tumori primari e hanno mostrato una crescita tumorale primaria dipendente dal tempo in base al BLI settimanale (Figura1B, C e Tabella 1). Analoga...

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Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Questo protocollo descrive la generazione di modelli di xenotrapianto ortotopico derivati dal paziente infondendo inmodo vesicalmente cellule carcinoma a cellule urotemaliali o cellule di cancro colorettale intra-rettale in diabete/grave non obesi immunodeficienza (NOD/SCID) per la crescita primaria del tumore e metastasi spontanee sotto l'influenza delle cellule stromali del linfonodo, che imitano la progressione delle malattie metastatiche umane.

Modelli di Xenotrapianto ortotopico derivati dal paziente per carcinoma a cellule uroteliali umane e crescita del tumore del tumore colorettale e metastasi spontanea

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Sono necessari modelli per imitare costantemente la metastasi tumorale attraverso l'interazione con i linfonodi. Nei pazienti con cancro del colon-retto e cancro delle cellule uroteliali della vescica. I nostri modelli xenografici ortotopici descritti in questo articolo possono aiutare a rispondere a queste importanti domande biologiche e testare nuove terapie in modo efficiente e clinicamente rilevante.I nostri tumori xenograft ortotopici prodotti nei topi assomigliano al tumore dei pazienti. In presenza di cellule stromali linfonodo entrambi i modelli hanno un impianto tumorale più elevato e tassi di metastasi di organi distanti e posizioni che imitano i modelli metastatici umani. Inoltre, entrambi i modelli animali hanno zero mortalità procedurale.Dopo aver rimosso i tumori derivati dal paziente dai topi eutanasiati, utilizzare forbici chirurgiche steril per tritare i pezzi di tumore positivi alla luciferasi il più piccolo possibile in una piastra di Petri sotto un cappuccio a flusso laminare. Trasferire i pezzi tumorali in un tubo conico sterile da 50 ml. Per preparare la soluzione digerimento, aggiungere 10 mL di collagenasi di tipo 4, 80 microlitri di ialuronidasi e 160 microlitri di deossiribonucleasi di tipo da 1 a 40 mL di HBSS e mescolare invertendo.Aggiungere 35-40 mL della soluzione digeribile per tritare il tumore e incubare a 37 gradi Celsius con rotazione continua per 2 ore con scuotimento periodico vigoroso. Per rimuovere i detriti dopo la digestione, filtrare il tumore digerito attraverso un filtro cellulare sterile da 100 micrometri seguito dalla filtrazione attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri salvando il flusso attraverso un tubo da 50 ml ogni volta e scartando i detriti. Per lavare le cellule libere, aggiungere 20 mL di HBSS al flusso attraverso e centrifugare a 329 volte la gravità per 5 minuti.Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet in 30 mL di HBSS. Trasferire 100.000 cellule tumorali in un tubo conico sterile da 15 ml e aggiungere 300.000 cellule HK fresche precedentemente preparate. Centrifugare le cellule a 329 volte la gravità per 5 minuti e scartare il supernatante per aspirazione.Rimospend le cellule in mezzo RPMI completo e tenere sul ghiaccio fino a quando non sono pronte per l'uso. Per preparare l'animale per l'iniezione cellulare UCC utilizzare la crema per la depilazione per radere la parte bassa della schiena di un topo NOD-SCID femmina di 6-8 settimane. Per somministrare le cellule UCC in una vescica, impostare prima una macchina elettrocauteria monopolare a una potenza di 4 watt.Dopo aver anestetizzato il topo, posizionarlo in posizione supina con il muso in un cono nasale isoflurane e schiena nuda saldamente messa a terra su un elettrodo disperso. Lubrificare un angiocatetere calibro 24 con gelatina lubrificante e quindi inserire l'angiocatetere delicatamente ma saldamente attraverso l'uretra del topo. Se il catetere si piega all'ingresso, inserire il filo guida a metà strada nel catetere per fornire stabilità.Quindi, inserire completamente il filo di guida dritto a nucleo fisso da 0,64 millimetri 1 millimetro dopo l'estremità dell'angiocatetere. Tenere il perno monopolare al filo guida per un secondo consentendo un'irritazione elettrica della mucosa vescica. Attaccare un angiocatetere fresco e sterile a una siringa a leur lock da 1 ml e redigere fino a 200 microlitri di cellule UCC preparati nelle fasi precedenti.Rimuovere il filo guida e l'angiocatetere dall'uretra e quindi inserire l'angiocatetere con siringa di cellule attaccate ad esso. Iniettare 50 microlitri delle cellule alla vescica del mouse e per consentire alle cellule di aderire alla parete della vescica, attendere alcuni secondi prima di rimuovere l'angiocatetere. Infine, rimuovere il mouse dal cono nasale isoflurane e dal cuscinetto di messa a terra e osservarlo per 1 ora seguendo la procedura per i segni di angoscia.Per creare il modello di mouse CRC, posizionare un mouse NOD-SCID maschio di 6-8 settimane anestetizzato in posizione supina sotto un microscopio sezionante che fissa il muso e il cono nasale isoflurane e gli arti anteriori con nastro adesivo per la stabilità. Posizionare un piccolo oggetto come una piccola sezione di garza sotto la base della coda elevando l'ano per migliorare la visibilità e l'angolo. Utilizzare forcep con punta smussata lubrificata curva per dilatare il canale anale ed esporre la mucosa anale e rettale distale e rimuovere le feci.Collegare un ago rimovibile sterile calibro 30 a una siringa in vetro da 50 microliter. Disegnare 10 microlitri di sospensione cellulare tumorale e delle cellule HK preparati nei passaggi precedenti nella siringa. Iniettare i 10 microlitri nella submucosa rettale posteriore distale 1-2 millimetri sopra il canale anale assicurandosi di non passare nella cavità pelvica.Infine, rimuovere il topo dal cono nasale isoflurane e osservarlo per un'ora dopo la procedura per i segni di angoscia. Per monitorare settimanalmente il peso metastatico primario del tumore, del fegato e del polmone in entrambi i modelli di topo, prima, pesare il topo. Iniettare 150 mg/kg di luciferina per via intra-peritoneale e attendere 5 minuti che il substrato circoli nel corpo.Posizionare il mouse anestetizzato in un sistema di imaging bioluminescente con il naso fissato nel cono del naso assicurandosi che l'area di interesse, che è il lato ventrale dell'animale, sia rivolta verso la fotocamera per ogni immagine. Mouse immagine in posizione supina settimanalmente per l'attività della luciferasi. Dopo aver affettato e macchiato tessuti isolati incorporati nella paraffina, osservali usando un microscopio ad alta potenza.Nel modello di topo UCC, l'83,3% degli animali ha generato tumori primari e ha mostrato una crescita del tumore primario dipendente dal tempo basata su misurazioni settimanali della bioluminescenza. Nel modello di topo CRC, il 96,9% dei topi coltivava tumori primari. A seconda del tumore del paziente, la crescita del tumore del topo ha avuto un periodo di latenza diverso, che riflette la differenza nelle caratteristiche cliniche dei pazienti.Sia nei modelli intra-vescicolari che intra-rettali, l'iniezione di cellule tumorali ha generato tumori primari ortotopici. Inoltre, il 33,3% e il 53,1% dei topi instillati con cellule UCC e cellule CRC con cellule HK, rispettivamente, hanno sviluppato metastasi d'organo distante. L'istopatologia degli xenoinnesti nel modello UCC è stata confrontata con il carcinoma della vescica del paziente primario.I risultati di colorazione degli xenoinnesti erano simili a quelli delle biopsie chirurgiche originali, confermando una morfologia dei tessuti simile. L'anticorpo contro Ki67, un marcatore di proliferazione cellulare umana, mostra una colorazione nucleare positiva che indica cellule tumorali umane altamente proliferare e in rapida crescita. Allo stesso modo, nel modello CRC, la colorazione H&E indica la somiglianza dell'architettura tra xenografti e tumori del paziente.La colorazione degli anticorpi contro la citocheratina 20 ha anche mostrato un modello di crescita tumorale simile in entrambi i modelli CRC. La chiave di queste procedure è trattare gli animali con delicatezza, ma con fermezza. La pratica con una mano ferma è il modo migliore per eseguire queste tecniche in sicurezza e ottenere i migliori risultati.Una volta realizzati questi modelli, è possibile testare più diverse forme di terapie oncologiche, tra cui combinazioni di farmaci attuali e terapie di nuova sviluppo prima degli studi clinici nei pazienti. È importante ricordare che la manipolazione sia delle cellule tumorali che degli aghi dovrebbe essere eseguita da personale esperto per la loro sicurezza e per ottenere risultati ottimali.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Ricerca

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