Name: facial nerve surgery in the rat model to study axonal inhibition and regeneration
Uploaded: 2020-05-05T12:30:00
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S.A.A. è finanziato dall'American Academy of Facial Plastic and Reconstructive Surgery Leslie Bernstein Grants Program.

Tutti gli interventi sono stati eseguiti in stretta conformità con le linee guida dei National Institutes of Health (NIH). Il protocollo sperimentale è stato approvato dal Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC) dell'Università del Michigan prima dell'implementazione. Sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley di dieci settimane.
1. Prima del giorno operativo
<ol><li>Garantire uno stock adeguato di strumenti chirurgici sterilizzati, farmaci analgesici, farmaci anestetici e ossig...

Il modello di lesione del nervo facciale del ratto è emerso come il sistema più versatile per la valutazione di fattori neurotrofici grazie alla sua accessibilità chirurgica, al modello di ramificazione e al significato fisiologico27,29,33,34,35,36. La combinazione di dimostrazione video e applicazione di dati sugli animal...

Lesione del nervo cranico nella regione della testa e del collo possono essere secondarie a eziologia congenita, infettiva, idiopatica, iatrogena, traumatica, neurologica, oncologica o sistemica1. Nervo cranico VII, o il nervo facciale, è comunemente influenzato. L'incidenza della disfunzione del nervo facciale può essere significativa, in quanto colpisce 20 a 30 per 100.000 persone ogni anno2. I principali rami motori del nervo facciale sono i rami temporali, zigomatici, buccali, marginali e cervicali; a seconda del ramo coinvolto, le conseguenze possono includere incompetenza orale o sbavamento, secchezza corneale, ostruzione del campo visivo secondario alla ptosi, disartria, o asimmetria facciale2,3. La morbilità a lungo termine comprende il fenomeno della sicinesi, o movimento involontario di un gruppo muscolare facciale, con tentata contrazione volontaria di un gruppo muscolare facciale distinto. La sicinesi oculare-orale è la più comune della rigenerazione aberrante come sequela di lesioni facciali e provoca compromissione funzionale, imbarazzo, diminuzione dell'autostima e scarsa qualità della vita3. La lesione ai singoli rami determina le funzioni che vengono compromesse in modo selettivo.
Il trattamento clinico della lesione del nervo facciale non è ben standardizzato e ha bisogno di ulteriori ricerche per migliorare i risultati. Gli steroidi possono alleviare il gonfiore nervoso facciale acuto, mentre Botox è utile per temporizzare i movimenti sinanici; ma, le principali opzioni ricostruttive nell'armamentario del terapeuta comportano l'intervento chirurgico attraverso la riparazione del nervo, la sostituzione o la rianimazione3,4,5,6.6 A seconda del tipo di lesione del nervo facciale sostenuta, il chirurgo nervoso facciale può utilizzare una serie di opzioni. Per la transezione semplice, la reanastomosi nervosa è utile mentre la riparazione dell'innesto via cavo è più adatta per un difetto del nervo; per un ripristino della funzione, il chirurgo può scegliere procedure di rianimazione facciale statiche o dinamiche. In molti casi di lesioni nervose facciali e successiva riparazione, anche nelle mani di esperti chirurghi nervosi facciali, il miglior risultato si traduce ancora in asimmetria facciale persistente e compromesso funzionale7.
Questi risultati non ottimali hanno stimolato un'ampia ricerca sulla rigenerazione dei nervi facciali. Ampi argomenti di interesse includono il perfezionamento e l'innovazione delle tecniche di riparazione dei nervi, la determinazione dell'effetto di vari fattori di rigenerazione dei nervi e la valutazione del potenziale di specifici inibitori neurali per aiutare a combattere l'esito a lungo termine della sinocinesi8,9,10,11. Mentre i modelli in vitro possono essere utilizzati per valutare alcune caratteristiche dei fattori pro-crescita o inibitori, la vera ricerca traslazionale su questo argomento è meglio realizzata tramite modelli animali traducibili.
La decisione di quale modello animale utilizzare può essere difficile, in quanto i ricercatori hanno utilizzato sia animali di grandi dimensioni, come pecore e piccoli modelli animali, cometopi 12,13. Mentre i modelli animali di grandi dimensioni offrono una visualizzazione anatomica ideale, il loro uso richiede attrezzature e personale specializzati non facilmente o facilmente disponibili. Inoltre, potenziare uno studio per dimostrare l'effetto potrebbe essere altamente proibitivo e potenzialmente non nell'ambito fattibile di molti centri scientifici. Così, il modello animale di piccole dimensioni è più frequentemente utilizzato. Il modello di topo può essere utilizzato per valutare una serie di risultati relativi alla chirurgia del nervo facciale; tuttavia, la lunghezza limitata del nervo può limitare la capacità dello scienziato di modellare determinati modelli, come lesioni a grande spazio14.
Così, il prototipo di ratto murine è emerso come il modello di cavallo di battaglia attraverso il quale lo scienziato può eseguire procedure chirurgiche innovative o utilizzare fattori inibitori o pro-crescita e valutare l'effetto su una vasta gamma di parametri di risultato. L'anatomia del nervo facciale del ratto è prevedibile e facilmente avvicinata in modo riproducibile. La sua scala più grande, rispetto al modello del mouse, consente la modellazione di una vasta gamma di difetti chirurgici, che vanno da semplice transection a 5 mm lacune15,16. Questo permette ulteriormente l'applicazione di interventi complessi nel sito difettoso, tra cui il posizionamento topico del fattore, iniezioni intraneurali di fattore, e il posizionamento di isoini o ponti17,18,19,20,21,22,23.
La natura docile del ratto, la sua anatomia affidabile e la sua propensione per una rigenerazione efficace del nervo consentono la raccolta di molte misure esiti in risposta ai suddetti schemi chirurgici di lesioni24. Attraverso il modello di ratto, lo scienziato nervoso facciale è in grado di valutare le risposte elettrofisiologiche a lesioni, esiti istologici nervosi e muscolari tramite immunostochimica, esiti funzionali attraverso il monitoraggio del movimento del pad vibrissale e la valutazione della chiusura degli occhi, e micro- cambiamenti macro-scopici attraverso microorescente o microscopia confocale, tra gli altri11, 22,29,,23,23,25,26,28.28 Così, il seguente protocollo illustrerà un approccio chirurgico al nervo facciale del ratto e agli schemi di lesione che possono essere indotti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:769px;" width="770">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">1.8% isoflurane</td>
			<td style="width:175px;">VetOne</td>
			<td style="width:182px;">13985-030-40</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">11-0 nylon microsutures</td>
			<td style="width:175px;">AROSuture</td>
			<td style="width:182px;">TK-117038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">4-0 monocryl suture</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:182px;">75982-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Buprenorphine SR</td>
			<td style="width:175px;">ZooPharm</td>
			<td>MIF 900-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Carprofen</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:182px;">MFCD00079028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Chlorhexidine</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:182px;">IC19135805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Jeweler forceps</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:182px;">21909-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Micro Weitlaner retractor</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:182px;">82030-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Micro-scissors</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:182px;">100492-348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Mini tenotomy scissors</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:182px;">89023-522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Number 15 scalpel blade</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:182px;">102097-834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Operating microscope</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:182px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Petrolatum eye gel</td>
			<td style="width:175px;">Pharmaderm</td>
			<td style="width:182px;">B002LUWBEK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sterile water</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:182px;">89125-834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Tissue adhesive</td>
			<td style="width:175px;">Vetbond, 3M</td>
			<td style="width:182px;">NC9259532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Water conductor pad</td>
			<td style="width:175px;">Aqua Relief System</td>
			<td style="width:182px;">ARS2000B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facial nerve surgery in the rat model to study axonal inhibition and regeneration

Questo protocollo descrive metodi coerenti e riproducibili per studiare la rigenerazione assonale e l'inibizione in un modello di lesione del nervo facciale del ratto. Il nervo facciale può essere manipolato lungo tutta la sua lunghezza, dal suo segmento intracranico al suo corso extratemporale. Ci sono tre tipi principali di lesioni nervose utilizzati per lo studio sperimentale delle proprietà rigenerative: schiacciamento del nervo, transezione e divario nervoso. La gamma di possibili interventi è vasta, compresa la manipolazione chirurgica del nervo, la consegna di reagenti neuroattivi o cellule, e manipolazioni centrali o dell'organo finale. I vantaggi di questo modello per lo studio della rigenerazione dei nervi includono semplicità, riproducibilità, coerenza interspecie, tassi di sopravvivenza affidabili del ratto e un aumento delle dimensioni anatomiche rispetto ai modelli murini. I suoi limiti riguardano una manipolazione genetica più limitata rispetto al modello murino e la capacità rigenerativa superlativa del ratto, in modo che lo scienziato del nervo facciale debba valutare attentamente i punti di tempo per il recupero e se tradurre i risultati in animali e studi umani superiori. Il modello di ratto per la lesione del nervo facciale consente parametri funzionali, elettrofisiologici e itomorfometrici per l'interpretazione e il confronto della rigenerazione del nervo. Vanta quindi un enorme potenziale per promuovere la comprensione e il trattamento delle conseguenze devastanti delle lesioni nervose facciali nei pazienti umani.

Dopo la procedura chirurgica iniziale, ci sono due tipi principali di misure di esito: misurazioni seriali nell'animale vivo e misurazioni che richiedono il sacrificio dell'animale. Esempi di misurazioni seriali includono saggi elettrofisiologici, come una misura potenziale di azione muscolare composta30, valutazioni del movimento del muscolo facciale tramite laser-assistito o videografia significa9, o anche ripetitivo imaging dal vivo di ri...

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Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

Questo protocollo descrive un approccio riproducibile alla chirurgia del nervo facciale nel modello del ratto, comprese le descrizioni di vari modelli inducibili di lesioni.

Chirurgia del nervo facciale nel modello di ratto per studiare l'inibizione assonale e la rigenerazione

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...

Questo protocollo può aiutare gli scienziati a studiare i risultati dopo la lesione del nervo facciale e i metodi per migliorare la rigenerazione in molti parametri diversi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'anatomia del ratto consente un facile accesso al nervo facciale e la sua larga scala ci consente di studiare tutti i modelli di lesioni pertinenti. Le applicazioni di questa tecnica si estendono verso la riabilitazione dei pazienti dopo la lesione del nervo facciale.Come potenziale rigenerativo il ratto fornisce un modello sperimentale riproducibile e conciso. E questo metodo può fornire informazioni sulle terapie chirurgiche e mediche per la paresi o la paralisi del nervo facciale. Ed è traducibile ad altri modelli di testa e collo o ad altri nervi periferici.Operare al microscopio usando entrambe le mani può essere impegnativo. Consiglio di esercitarmi usando la versione binoculare al microscopio prima di tentare una dissezione del nervo facciale. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del dito, applicare un unguento agli occhi del topo e radere l'area chirurgica.Stabilire un metodo per l'identificazione del ratto e posizionare un rotolo di garza sotto il collo. Disinfettare la pelle esposta con tre clorexidina alternata e scrub al 70% di etanolo e posizionare il topo al microscopio stereo. Manipolare l'orecchio ipsilaterale in direzione anteriore-posteriore per determinare la piegatura naturale della pelle postauricolare.Utilizzare una lama numero 15 per fare un'incisione da due a tre millimetri nella piega postauricolare. La pianificazione e il posizionamento dell'incisione sono i passaggi più critici per garantire un'identificazione affidabile del nervo facciale riducendo al minimo le dimensioni della ferita. Sezionare senza mezzi termini attraverso l'immediata fascia sottocutanea e posizionare un retrattore micro-Weitlaner per migliorare l'esposizione dei tessuti.Identificare il muscolo digastrico anteriore mentre viaggia in una direzione inferiore a superiore verso il suo inserimento lungo la base del cranio. Stendere delicatamente attraverso la pancia muscolare lungo il punto di inserimento muscolare per rivelare il tendine della pancia digastrica anteriore. Il tendine apparirà come un processo bianco filmoso che emana dal muscolo con un solido inserimento sulla base del cranio.Dopo l'identificazione del muscolo digastrico anteriore e del tendine, regolare il riavvolgitore Weitlaner per ritrarre ulteriormente la pancia muscolare. La regione esposta è lo spazio tridimensionale in cui si trova il tronco principale del nervo facciale. Sezionare lungo il nervo in una direzione inferiore distally dall'uscita del forame stilomastoide.Per indurre un modello di lesione da schiacciamento, utilizzare le forcep del gioielliere a superficie liscia per afferrare e comprimere saldamente il nervo applicando una pressione costante e riproducibile per 30 secondi per garantire un'adeguata lesione da schiacciamento. Per una semplice trasezione, afferrare l'epineurium immediato sovrascrivere il nervo con forcep a denti fini e utilizzare microscissori affilati per traslizionare cleanmente il nervo nel punto desiderato con un singolo taglio. Per un modello di gap nervoso, utilizzare pinze regolabili per impostare la lunghezza dello spazio nervoso desiderata per garantire modelli di lesioni simili tra gli animali e trasenare il nervo come appena dimostrato.Dopo che la lesione sperimentale è stata consegnata, irrigare la ferita con soluzione salina sterile e asciugare il tessuto con garza sterile. prima di chiudere l'incisione cutanea secondo le linee guida istituzionali. Qui, viene mostrata l'imaging dal vivo del tronco principale del nervo facciale con una lesione da schiacciamento di circa due o tre millimetri distale al punto di ramo del primo PES in un ratto Transgenico 1-GFP adulto.La valutazione del ritorno graduale della fluorescenza a una, due, tre e quattro settimane dopo la lesione può essere utilizzata come marcatore per monitorare la rigenerazione nervosa in questi animali transgenici. L'analisi istomorfometrica può essere usata per ottenere immagini della sezione trasversale della divisione mandibolare marginale permettendo la quantificazione del diametro assonale, della quantità di detriti, della fibra nervosa, della percentuale di nervo e delle misurazioni della densità. È importante regolare frequentemente il posizionamento del riavvolgitore in base alle esigenze per garantire che i nervi anatomici pertinenti siano visibili quando si identifica il nervo facciale.Seguendo questa procedura i nervi e i muscoli rilevanti possono essere raccolti per l'analisi immunoistochimica per valutare il grado di rigenerazione rispetto ad altri gruppi sperimentali. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nello studio dei risultati funzionali dopo la lesione del nervo facciale. Nello specifico, come effettuare il fenomeno della sintasi.

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