Name: facial nerve surgery in the rat model to study axonal inhibition and regeneration
Uploaded: 2020-05-05T12:30:00
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A S.A.A. é financiada pela Academia Americana de Plástica Facial e Cirurgia Reconstrutiva Leslie Bernstein Grants Program.

Todas as intervenções foram realizadas de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH). O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucionais (IACUC) da Universidade de Michigan antes da implementação. Foram utilizados ratos sprague-dawley adultos de dez semanas de idade.
1. Antes do dia da operação
<ol><li>Garanta um estoque adequado de instrumentos cirúrgicos esterilizados, medicamentos analgésicos, medicamentos anestés...

O modelo de lesão do nervo facial de rato emergiu como o sistema mais versátil para a avaliação de fatores neurotróficos devido à sua acessibilidade cirúrgica, padrão de ramificação e significância fisiológica27,29,33,34,35,36. A combinação de demonstração de vídeo e aplicação de dados de animais transgêni...

A lesão do nervo craniano na região da cabeça e do pescoço pode ser secundária às etiologias congênitas, infecciosas, idiopáticas, iatrogênicas, traumáticas, neurológicas, oncológicas ou sistêmicas1. O nervo craniano VII, ou nervo facial, é comumente afetado. A incidência de disfunção do nervo facial pode ser significativa, pois afeta de 20 a 30 por 100.000 pessoas a cada ano2. Os principais ramos motores do nervo facial são os ramos temporal, zigomático, bucal, mandibular marginal e cervical; dependendo do ramo envolvido, as consequências podem incluir incompetência oral ou baba, secura da córnea, obstrução do campo visual secundária à ptose, disartria ou assimetria facial2,3. A morbidade a longo prazo inclui o fenômeno da sincinese, ou movimento involuntário de um grupo muscular facial, com tentativa de contração voluntária de um grupo muscular facial distinto. A sincinese ocular-oral é a mais comum da regeneração aberrante como sequela da lesão do nervo facial e causa comprometimento funcional, constrangimento, diminuição da autoestima e má qualidade de vida3. A lesão aos ramos individuais dita as funções que estão seletivamente comprometidas.
O tratamento clínico da lesão do nervo facial não é bem padronizado e está precisando de mais pesquisas para melhorar os resultados. Esteróides podem aliviar o inchaço agudo do nervo facial, enquanto o Botox é útil para os movimentos sincinéticos temporizados; mas, as principais opções reconstrutivas no armamentário do praticante envolvem intervenção cirúrgica através de reparação nervosa, substituição ou reanimação3,4,5,6. Dependendo do tipo de lesão do nervo facial sustentada, o cirurgião do nervo facial pode utilizar uma série de opções. Para uma transsecção simples, a reanastomose nervosa é útil, enquanto o reparo do cabo-enxerto é mais adequado para um defeito nervoso; para uma restauração da função, o cirurgião pode escolher procedimentos de reanimação facial estática ou dinâmica. Em muitos casos de lesão do nervo facial e posterior reparação, mesmo nas mãos de cirurgiões nervosos faciais experientes, o melhor resultado ainda resulta em assimetria facial persistente e comprometimento funcional7.
Esses resultados subótimos estimularam extensas pesquisas sobre a regeneração do nervo facial. Amplos tópicos de interesse incluem aperfeiçoar e inovar técnicas de reparação nervosa, determinar o efeito de vários fatores de regeneração nervosa e avaliar o potencial de inibidores neurais específicos para ajudar a combater o resultado a longo prazo da sincinese8,9,10,11. Embora os modelos in vitro possam ser usados para avaliar algumas características de fatores pró-crescimento ou inibidores, a verdadeira pesquisa translacional sobre este assunto é melhor realizada através de modelos animais traduzíveis.
A decisão de qual modelo animal utilizar pode ser desafiadora, pois os pesquisadores utilizaram tanto animais de grande porte, como ovinos e modelos de pequenos animais, como camundongos12,13. Embora modelos de animais de grande porte ofereçam visualização anatômica ideal, seu uso requer equipamentos especializados e pessoal não disponível facilmente ou facilmente. Além disso, impulsionar um estudo para demonstrar efeito pode ser altamente proibitivo de custos e potencialmente não dentro do escopo viável de muitos centros científicos. Assim, o modelo animal pequeno é mais utilizado. O modelo do camundongo pode ser utilizado para avaliar uma série de desfechos relacionados à cirurgia do nervo facial; no entanto, o comprimento limitado do nervo pode restringir a capacidade do cientista de modelar certos padrões, como lesões de grande lacuna14.
Assim, o protótipo de murina de rato emergiu como o modelo workhorse através do qual o cientista pode realizar procedimentos cirúrgicos inovadores ou utilizar fatores inibidores ou pró-crescimento e avaliar o efeito em uma ampla gama de parâmetros de desfecho. A anatomia do nervo facial do rato é previsível e facilmente abordada de forma reprodutível. Sua escala maior, em comparação com o modelo do mouse, permite a modelagem de uma ampla gama de defeitos cirúrgicos, variando de transsecção simples a lacunas de 5 mm15,16. Isso permite ainda a aplicação de intervenções complexas no local do defeito, incluindo a colocação tópica do fator, injeções intraneurais do fator e a colocação de isoenxertos ou pontes17,18,19,20,21,22,23.
A natureza dócil do rato, sua anatomia confiável e sua propensão à regeneração nervosa eficaz permitem a coleta de muitas medidas de desfecho em resposta aos padrões cirúrgicos acima mencionados da lesão24. Através do modelo de rato, o cientista do nervo facial é capaz de avaliar respostas eletrofisiológicas a lesões, desfechos histológicos nervosos e musculares através da imunohistoquímica, desfechos funcionais através do movimento de rastreamento da almofada vibrissal e avaliação do fechamento dos olhos, e alterações micro e macroscópicas por meio de microscopia fluorescente ou confocal, entre outras11,22,23,25,26,27,28,29. Assim, o protocolo a seguir irá delinear uma abordagem cirúrgica para o nervo facial do rato e os padrões de lesão que podem ser induzidos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:769px;" width="770">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">1.8% isoflurane</td>
			<td style="width:175px;">VetOne</td>
			<td style="width:182px;">13985-030-40</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">11-0 nylon microsutures</td>
			<td style="width:175px;">AROSuture</td>
			<td style="width:182px;">TK-117038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">4-0 monocryl suture</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:182px;">75982-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Buprenorphine SR</td>
			<td style="width:175px;">ZooPharm</td>
			<td>MIF 900-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Carprofen</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:182px;">MFCD00079028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Chlorhexidine</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:182px;">IC19135805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Jeweler forceps</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:182px;">21909-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Micro Weitlaner retractor</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:182px;">82030-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Micro-scissors</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:182px;">100492-348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Mini tenotomy scissors</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:182px;">89023-522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Number 15 scalpel blade</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:182px;">102097-834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Operating microscope</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:182px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Petrolatum eye gel</td>
			<td style="width:175px;">Pharmaderm</td>
			<td style="width:182px;">B002LUWBEK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sterile water</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:182px;">89125-834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Tissue adhesive</td>
			<td style="width:175px;">Vetbond, 3M</td>
			<td style="width:182px;">NC9259532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Water conductor pad</td>
			<td style="width:175px;">Aqua Relief System</td>
			<td style="width:182px;">ARS2000B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facial nerve surgery in the rat model to study axonal inhibition and regeneration

Este protocolo descreve métodos consistentes e reprodutíveis para estudar a regeneração e inibição axonal em um modelo de lesão do nervo facial de rato. O nervo facial pode ser manipulado ao longo de toda a sua extensão, desde seu segmento intracraniano até seu curso extratemporal. Existem três tipos primários de lesão nervosa utilizados para o estudo experimental de propriedades regenerativas: esmagamento nervoso, transsecção e abertura nervosa. A gama de possíveis intervenções é vasta, incluindo manipulação cirúrgica do nervo, parto de reagentes neuroativos ou células, e manipulações centrais ou de órgãos finais. As vantagens deste modelo para estudar a regeneração nervosa incluem simplicidade, reprodutibilidade, consistência entre espécies, taxas de sobrevivência confiáveis do rato e um tamanho anatômico aumentado em relação aos modelos murina. Suas limitações envolvem uma manipulação genética mais limitada versus o modelo do rato e a capacidade regenerativa superlativa do rato, de modo que o cientista do nervo facial deve avaliar cuidadosamente os pontos de tempo para recuperação e se traduzir resultados para animais superiores e estudos humanos. O modelo de rato para lesão do nervo facial permite parâmetros funcionais, eletrofisiológicos e histomorfométricos para a interpretação e comparação da regeneração nervosa. Assim, possui um enorme potencial para promover a compreensão e o tratamento das consequências devastadoras da lesão do nervo facial em pacientes humanos.

Após o procedimento cirúrgico inicial, existem dois tipos principais de medidas de desfecho: medidas seriais no animal vivo e medidas que requerem sacrifício do animal. Exemplos de medidas seriais incluem ensaios eletrofisiológicos, como uma medição potencial de ação muscular composta30, avaliações do movimento muscular facial através de laser assistido ou videografia significa9, ou mesmo imagens ao vivo repetitivas de recrescimen...

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Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

Este protocolo descreve uma abordagem reprodutível para a cirurgia do nervo facial no modelo de rato, incluindo descrições de vários padrões induziveis de lesão.

Cirurgia do nervo facial no modelo de rato para estudar inibição e regeneração axonal

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...

Este protocolo pode ajudar os cientistas a estudar os resultados após lesões no nervo facial e métodos para melhorar a regeneração em muitos parâmetros diferentes. A principal vantagem dessa técnica é que a anatomia de ratos permite fácil acesso ao nervo facial, e sua grande escala nos permite estudar todos os padrões de lesões relevantes. As aplicações desta técnica se estendem para a reabilitação dos pacientes após lesão do nervo facial.Como potencial regenerativo, o rato fornece um modelo experimental reprodutível e conciso. E este método pode fornecer insights sobre terapias cirúrgicas e médicas para parese de nervos faciais ou paralisia. E é traduzível para outros modelos de cabeça e pescoço ou outros nervos periféricos.Operar sob um microscópio usando ambas as mãos pode ser um desafio. Recomendo praticar usando a versão binóculo sob o microscópio antes de tentar uma dissecção do nervo facial. Após confirmar a falta de resposta ao aperto do dedo do pé, aplique pomada nos olhos do rato e raspe a área cirúrgica.Estabeleça um método para identificação de ratos e coloque um rolo de gaze sob o pescoço. Desinfete a pele exposta com três clorexidinas alternadas e 70% de etanol e coloque o rato sob um microscópio estéreo. Manipule o ouvido ipsilateral em uma direção anterior-posterior para determinar a dobra natural da pele pós-uricular.Use uma lâmina número 15 para fazer uma incisão de dois a três milímetros no vinco pós-auricular. O planejamento e a colocação da incisão são os passos mais críticos para garantir a identificação confiável do nervo facial, minimizando o tamanho da ferida. Disseca sem rodeios através da fáscia subcutânea imediata e coloque um retrátil micro-Weitlaner para aumentar a exposição ao tecido.Identifique o músculo digastric anterior enquanto ele viaja em uma direção inferior a superior em direção à sua inserção ao longo da base do crânio. Espalhe suavemente pela barriga muscular ao longo do ponto de inserção muscular para revelar o tendão da barriga digastrica anterior. O tendão aparecerá como um processo branco filmado emanando do músculo com uma inserção sólida na base do crânio.Após a identificação do músculo digastric anterior e seu tendão, ajuste o retrátil weitlaner para retrair ainda mais a barriga muscular. A região exposta é o espaço tridimensional no qual está o tronco principal do nervo facial. Dissecar ao longo do nervo em uma direção inferior distally a partir da saída do foramen estilomastoide.Para induzir um padrão de lesão de esmagamento, use fórceps de joalheiro de superfície lisa para agarrar firmemente e comprimir o nervo aplicando pressão constante e reprodutível por 30 segundos para garantir uma lesão de esmagamento apropriada. Para uma simples transeção, segure o epineurium imediato sobredilhando o nervo com fórceps de dentes finos, e use microscissores afiados para transectar o nervo de forma limpa no ponto desejado com um único corte. Para um modelo de lacuna nervosa, use pinças ajustáveis para definir o comprimento da lacuna nervosa desejada para garantir padrões de lesão semelhantes entre os animais e transectar o nervo como apenas demonstrado.Após a ção experimental, irrigar a ferida com soro fisiológico e secar o tecido com gaze estéril. antes de fechar a incisão da pele de acordo com as diretrizes institucionais. Aqui, imagens ao vivo do tronco principal do nervo facial com uma lesão de esmagamento aproximadamente dois a três milímetros distal até o ponto de ramificação do primeiro PES em um rato adulto transgênico Thy1-GFP é mostrado.A avaliação do retorno gradual da fluorescência em uma, duas, três e quatro semanas após a lesão pode ser usada como marcador para monitorar a regeneração nervosa nesses animais transgênicos. A análise histomorfométrica pode ser usada para obter imagens transversais da divisão mandibular marginal permitindo quantificação do diâmetro axonal, quantidade de detritos, fibra nervosa, porcentagem de medidas nervosas e de densidade. É importante ajustar frequentemente a colocação do retrátil conforme necessário para garantir que os nervos anatômicos relevantes sejam visíveis ao identificar o nervo facial.Após este procedimento, os nervos e músculos relevantes podem ser colhidos para análise imunohistoquímica para avaliar o grau de regeneração em relação a outros grupos experimentais. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores no estudo dos desfechos funcionais após lesão do nervo facial. Especificamente, como realizar o fenômeno da sintetização.

Research

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Neurociência

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