Name: 3d analysis of multi-cellular responses to chemoattractant gradients
Uploaded: 2019-05-24T14:00:00
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这项工作得到了向 AJE (NSF PD-11-7246、乳腺癌研究基金会 (BCRF-17-048) 和 NCI U54 CA210173) 和 AL (U54CA209992) 的赠款的支持。

所有动物工作都是根据约翰·霍普金斯大学医学院动物护理和使用机构委员会审查和批准的协议进行的。
1. 中流体装置的制造
<ol><li>利用三维 CAD 软件设计 PDMS 设备模具的掩模。</li>
	<li>使用带有耐热性树脂的立体平版印刷设备打印模具。 注: 此处描述的过程是由商业3D 打印机构执行的。</li>
	<li>以10:1 的比例将 PDMS 单体溶液与固化剂彻底混合。制造该装置需要3毫升的 PDMS ?...

<ol>
	<li>Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+and+extracellular+matrix+homeostasis.">Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).</li><li>Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins:+emerging+paradigms+of+signal+transduction.">Integrins: emerging paradigms of signal transduction.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).</li><li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Stem+Cell+Organoids.">Engineering Stem Cell Organoids.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).</li><li>Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+3D+matrix+microenvironment+regulates+cell+migration+through+spatiotemporal+dynamics+of+contractility-dependent+adhesions.">Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions.</a> Nature Communications. 6, 8720 (2015).</li><li>Meyvantsson, I., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+models+in+microfluidic+systems.">Cell culture models in microfluidic systems.</a> Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li><li>Zervantonakis, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+microfluidic+model+for+tumor+cell+intravasation+and+endothelial+barrier+function.">Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).</li><li>Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluidic+device+to+study+directional+angiogenesis+in+complex+tissue+and+organ+culture+models.">A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models.</a> Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+lapse+investigation+of+antibiotic+susceptibility+using+a+microfluidic+linear+gradient+3D+culture+device.">Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).</li><li>Ellison, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+communication+enhances+the+capacity+of+cell+ensembles+to+sense+shallow+gradients+during+morphogenesis.">Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+assays+of+murine+mammary+branching+morphogenesis+and+epithelial+invasion.">3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).</li></ol>

PDMS 模具的制造是使用商业3D 打印服务进行的, 但也可以通过内部高端3D 打印机来完成。在各种3D 制造方法中, 建议采用立体平版印刷来生成高分辨率模具。由于 PDMS 固化是在高温 (80°c) 下进行的, 因此如果将打印外包, 材料应具有足够的耐热性, 应明确指定。可以与印刷服务公司讨论热后固化问题, 以提高零件的耐热性。印刷服务和材料的细节在材料表中规定。
固?...

在生理环境中, 细胞被嵌入细胞外基质 (ECM) 中, 并暴露在大量的生物分子中。细胞与周围微环境之间的相互作用调节控制多种表型的细胞内过程, 包括迁移、生长、分化和存活1,2。在传统的2D 细胞培养中, 人们已经对细胞行为有了很多了解。然而, 随着血管内成像和3D 水凝胶中嵌入细胞实验的出现, 在简化的二维体外培养物与三维组织样环境中已经认识到细胞行为的重要差异。当细胞与 ECM 纤维相互作用并在三维矩阵中感知其机械性能时, 凝胶的材料刚度在2D 体外系统中并不是一个完全独立的变量。尺寸改变了焦点粘附的形成, 导致细胞形态和行为不同。此外, 与在3D 中打开向所有方向开放的细胞相比, 2D 表面上的细胞接触到的信号线索更少。
这些限制增加了对代表活组织的空间和化学复杂性的三维系统的兴趣, 并更好地预测体内组织功能。它们以多种形式发育, 从自组装细胞微结构到随机穿插在 ecm3,4中的细胞。最近在微细加工技术方面的进展促进了各种类型的3d 培养系统5、6、7、8、9的出现 , 用于研究表型变化和细胞对可溶性信号的反应;然而, 技术障碍限制了研究实验室的广泛使用。在许多情况下, 制造过程需要光刻技术和软光刻的背景知识。此外, 必须控制各种因素, 才能成功构建设备, 并在很长一段时间内实现设备的最佳功能。
我们的方法描述了如何构建一个 3D PDMS 设备, 将细胞和多细胞有机体整合到具有明确趋化因子梯度的三维微环境中, 然后分析上皮对 EGF10的反应。我们的数据表明, 有机生物对浅 EGF 梯度的反应能力来自于通过缝隙连接的细胞间化学耦合。这表明有机生物在更精确地检测弱和嘈杂的空间梯度输入方面具有潜力。制造过程不需要洁净室设施, 也不需要光刻技术。然而, 3D PDMS 设备包含了3D 生理环境的必要因素。该方法将有助于研究三维细胞行为, 具有较大的研究潜力, 不同的细胞类型, 趋化因子和 ECM 组合。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:773px;" width="773">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">22mm x 22mm coverslip&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">12-542-B</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Collagen I, Rat</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">CB-40236</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Collagenease</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">C5138</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">COMSOL Multiphysics 4.2</td>
			<td style="width:171px;">COMSOL Inc</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Used for simulating diffusion dynamics</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">10x DMEM</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2429</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DEME/F12</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher</td>
			<td>11330032</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">DNase</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">D4623</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">EGF Recombinant Mouse Protein</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:135px;">PMG8041</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:171px;">Life technologies</td>
			<td>16140-071</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Fiji-ImageJ</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Used for measuring branching length and angles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:171px;">GIBCO&#160;</td>
			<td style="width:135px;">5750-060</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">IMARIS</td>
			<td style="width:171px;">Bitplane</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Insulin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">19278</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Insulin-Transferrin-Selenium-X</td>
			<td style="width:171px;">GIBCO&#160;</td>
			<td style="width:135px;">51500</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Low-lint tissue</td>
			<td style="width:171px;">Kimberly-Clark Professional</td>
			<td style="width:135px;">Kimtech wipe</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Mold Material</td>
			<td style="width:171px;">Proto labs</td>
			<td style="width:135px;">Accura SL5530&#160;</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Mold printing equipment</td>
			<td style="width:171px;">Proto labs</td>
			<td style="width:135px;">Stereolithogrphy</td>
			<td style="width:269px;">Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Mold printing Service</td>
			<td style="width:171px;">Proto labs</td>
			<td style="width:135px;">Custom</td>
			<td style="width:269px;">https://www.protolabs.com/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">NaOH</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2770</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td>16777-164P</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Spinning-disk confocal microscope</td>
			<td style="width:171px;">Solamere Technology Group</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Sylgard 184</td>
			<td style="width:171px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT&#160;</td>
			<td style="width:269px;">PDMS kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Trypsin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9935</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d analysis of multi-cellular responses to chemoattractant gradients

2D 细胞培养系统的各种局限性引发了人们对三维细胞培养和分析平台的兴趣, 这些平台将更好地模拟活组织的空间和化学复杂性, 并模拟体内组织功能。最近在微细加工技术的发展促进了三维在体外环境中的发展, 在这种环境中, 细胞可以被整合到一个明确的细胞外基质 (ECM) 和一组定义的可溶性或基质相关的生物分子。然而, 技术障碍限制了其在研究实验室的广泛使用。在这里, 我们描述了一种方法, 以构建简单的设备, 用于三维培养和实验的细胞和多细胞有机体在三维微环境中具有明确的趋化因子梯度。我们说明了使用这个平台来分析上皮细胞和有机体对生长因子梯度的反应, 如表皮生长因子 (EGF)。EGF 梯度在设备中稳定了几天, 导致乳腺有机体中的定向分支形成。这一分析使我们能够得出结论, 细胞组的集体梯度检测对单个细胞更为敏感。我们还描述了制造方法, 它不需要光刻设施, 也不需要先进的软光刻技术。该方法将有助于研究三维细胞行为的背景下, 分析发展和病理状态, 包括癌症。

EGF 是乳腺分枝形态发生的重要调节剂, 也是指导浸润性癌症生长中乳腺上皮细胞迁移的关键趋化剂。我们使用上述介观流体器件来研究细胞对定义的 EGF 梯度的反应 (图 1a, b)10。该装置产生5毫米宽、10毫米长、1毫米高的养区。培养区的两侧由六角形柱从开井中分离, 这些柱通过表面张力将液体 ECM 和细胞混合物捕获在细?...

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3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

我们描述了一种方法来构建设备的三维培养和实验与细胞和多细胞有机体。该装置允许分析在具有明确趋化因子梯度的三维微环境中对可溶性信号的细胞反应。在检测弱噪声输入时, 有机体优于单个细胞。

趋化梯度多细胞响应的三维分析

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

在体外培养的简化的2D培养物与3D组织样环境的差异增加了对3D系统的兴趣，以表示活组织的空间和化学复杂性。制造过程不需要设施或光刻技术。但是，3D PDMS 器件包括 3D 生理环境应用所需的矢量。对于中流体器件制备，使用适当的三维计算机辅助设计软件程序为聚二甲基硅氧烷或PDMS器件设计模具的面罩，并使用带热抗性树脂的立体光刻设备打印模具。当模具准备就绪时，将每个模具的三毫升 PDMS 单体溶液与固化剂以 10 比 1 的比例大致混合，并使用真空在真空干燥器中解气一小时。在干燥结束时，使用一块胶带清除模具表面的任何灰尘，并小心地用脱气的 PDMS 溶液填充模具。接下来，在 80 摄氏度下固化 PDMS 两个小时，然后让模具在室温下冷却。当模具冷却到触摸时，使用刀片切割模具和 PDMS 之间的边界，并小心地从模具中剥离 PDMS。修剪 PDMS 以适合 22 由 22 毫米的盖玻片，并在入口打孔。使用低绒组织和 70% 乙醇，擦拭设备和盖玻片，然后用新的胶带涂抹设备，以去除任何大的灰尘颗粒。然后，在 121 摄氏度下将 PDMS 设备和盖玻片进行 <3>00，8 分钟潮湿，15 分钟干燥，然后用冠状放电枪将部分底部表面处理 5 分钟，然后用组织培养罩将部件粘合在一起。要加载设备，首先在适当体积的生长介质中重新暂停感兴趣的细胞，并辅以 1% 青霉素和链霉素和 1% 胰岛素转移素-钚-x。接下来混合50微升的乳腺细胞悬浮液与425微升新鲜准备的中和胶原蛋白溶液，并填补200微升移液器与胶原蛋白细胞悬浮液。通过入口将悬浮液注入 PDMS 设备，直到整个腔室充满，将设备在 37 摄氏度的培养箱中放入 5%的二氧化碳中一小时，以诱导凝胶，然后用生长介质填充两侧的储液罐，然后将设备返回到培养箱，直到共生成像。对于 3D 成像和定量，在共合显微镜上安装活细胞成像培养室，并分别将温度和二氧化碳预设为 37 摄氏度和 5%。向成像室储液罐中加入水以加湿腔室，根据需要将湿巾放入腔室，并将 PDMS 设备放入腔室中。将表皮生长因子添加到其中一个储层中，作为梯度形成因子的来源，让另一个储层作为空间分级表皮生长因子分布发展的汇。然后设置 Z 堆栈的范围，覆盖感兴趣的器官的体积，然后开始成像。在实验结束时，使用适当的图像分析程序来测量从器官延伸的分支的长度和角度或单个细胞的迁移。在硅和体外测试中，都显示细胞培养区形成稳定的线性表皮生长因子梯度，该梯度持续约两天，无需补充源或汇储层，这表明表皮生长因子（一种 6.4 千多吨蛋白）可以在相对较短的时间内在胶原蛋白凝胶内形成稳定的扩散梯度，如相对短的时间内所证明的。如果将表皮生长因子添加到线性梯度中，每毫升有 0.5 纳米摩尔，在空间均匀的 2.5 纳米摩尔表皮生长因子存在的情况下，乳腺器官形成多个分支，三天内无方向偏向。但是，分支形成表现出显著的方向偏差。值得注意的是，间隙结抑制剂的加入抑制了器官对梯度的反应能力。胶原蛋白溶液的pH值对于凝胶和细胞的生存能力至关重要。如果在混合之前未中和胶原蛋白，细胞活力将较低。这种方法可以扩展，以适应更真实的组织建模，并可以容纳血管网络形成从单个细胞在凝胶。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

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循环压力为生物反应器的设计体外主动脉心脏瓣膜的研究

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科研

生物工程

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

创建的胶粘剂和可溶性梯度荧光显微镜成像细胞迁移

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Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

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多尺度孔梯度，聚电解质和间接监测改性金属植入物<em&gt;在体内</em

Metallic implants, especially titanium implants, are widely used in  clinical applications. Tissue in-growth and integration to these implants in  the ...

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