Name: 3d analysis of multi-cellular responses to chemoattractant gradients
Uploaded: 2019-05-24T14:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a AJE (NSF PD-11-7246, Breast Cancer Research Foundation (BCRF-17-048), e NCI U54 CA210173) e AL (U54CA209992).

Tutto il lavoro animale è stato condotto in conformità con i protocolli esaminati e approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali, Johns Hopkins University, School of Medicine.
1. fabbricazione del dispositivo mesofluidico
<ol><li>Progettare la maschera dello stampo per il dispositivo PDMS utilizzando un software CAD 3D.</li>
	<li>Stampare lo stampo utilizzando apparecchiature di stereolitografia con una resina termoresistente. Nota: le procedure qui descritte s...

<ol>
	<li>Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+and+extracellular+matrix+homeostasis.">Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).</li><li>Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins:+emerging+paradigms+of+signal+transduction.">Integrins: emerging paradigms of signal transduction.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).</li><li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Stem+Cell+Organoids.">Engineering Stem Cell Organoids.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).</li><li>Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+3D+matrix+microenvironment+regulates+cell+migration+through+spatiotemporal+dynamics+of+contractility-dependent+adhesions.">Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions.</a> Nature Communications. 6, 8720 (2015).</li><li>Meyvantsson, I., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+models+in+microfluidic+systems.">Cell culture models in microfluidic systems.</a> Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li><li>Zervantonakis, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+microfluidic+model+for+tumor+cell+intravasation+and+endothelial+barrier+function.">Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).</li><li>Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluidic+device+to+study+directional+angiogenesis+in+complex+tissue+and+organ+culture+models.">A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models.</a> Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+lapse+investigation+of+antibiotic+susceptibility+using+a+microfluidic+linear+gradient+3D+culture+device.">Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).</li><li>Ellison, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+communication+enhances+the+capacity+of+cell+ensembles+to+sense+shallow+gradients+during+morphogenesis.">Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+assays+of+murine+mammary+branching+morphogenesis+and+epithelial+invasion.">3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).</li></ol>

La fabbricazione di stampi PDMS è stata eseguita utilizzando un servizio di stampa 3D commerciale, ma può anche essere realizzato da una stampante 3D di fascia alta in-House. Tra i vari metodi di fabbricazione 3D, la stereolitografia è consigliata per la generazione di stampi ad alta risoluzione. Poiché la polimerizzazione PDMS si verifica ad una temperatura elevata (80 ° c), i materiali devono essere sufficientemente resistenti al termicamente, che devono essere specificati esplicitamente, se la stampa è esternali...

In ambiente fisiologico, le cellule sono incorporate in una matrice extracellulare (ECM) ed esposte a una pletora di biomolecole. Le interazioni tra le cellule e il microambiente circostante regolano i processi intracellulari che controllano diversi fenotipi, tra cui la migrazione, la crescita, la differenziazione e la sopravvivenza1,2. Molto è stato appreso sui comportamenti cellulari in una coltura cellulare 2D convenzionale. Tuttavia, con l'avvento dell'imaging intravitale e della sperimentazione con cellule incorporate in idrogel 3D, importanti differenze nei comportamenti delle cellule sono state riconosciute nelle colture 2D in vitro semplificate rispetto agli ambienti simili a tessuti 3D. Mentre le cellule interagiscono con le fibre ECM e percepiscono le loro proprietà meccaniche all'interno della matrice 3D, la rigidità del materiale del gel non è una variabile completamente indipendente in un sistema 2D in vitro. La dimensionalità altera la formazione di adesione focale, con conseguente morfologia e comportamento delle cellule differenti. Inoltre, le celle su una superficie 2D sono esposte a meno segnali di segnalazione rispetto alle celle aperte a tutte le direzioni in 3D.
Queste limitazioni hanno aumentato gli interessi dei sistemi 3D che rappresentano la complessità spaziale e chimica dei tessuti viventi e prevedono meglio le funzioni tissutali in vivo. Sono stati sviluppati in molte forme da organoidi come microstrutture cellulari auto-assemblaggio alle cellule intervallate casualmente in ECM3,4. I recenti progressi nelle tecnologie di microfabbricazione hanno facilitato l'avvento di vari tipi di sistemi di coltura 3D5, 6,7,8,9 per lo studio dei cambiamenti fenotipici e risposte cellulari ai segnali solubili; Tuttavia, le barriere tecnologiche limitano l'uso diffuso nei laboratori di ricerca. In molti casi, i processi di fabbricazione richiedono tecniche di fotolitografia e conoscenze di fondo per la litografia morbida. Inoltre, vari fattori devono essere controllati per costruire con successo un dispositivo e per ottenere una funzione ottimale del dispositivo per un lungo periodo di tempo.
Il nostro metodo descrive come costruire un dispositivo 3D PDMS per incorporare le cellule e gli organoidi multicellulari in un microambiente 3D con gradienti chemioattrattante definiti e quindi analizzare le risposte epiteliali a EGF10. I nostri dati rivelano che la capacità degli organoidi di reagire ai gradienti del FEG superficiali deriva dall'accoppiamento chimico intercellulare attraverso incroci di Gap. Suggerisce il potenziale degli organoidi per una rilevazione più precisa di ingressi deboli e rumorosi spazialmente graduati. Il processo di fabbricazione non richiede una struttura per camera bianca né tecniche di fotolitografia. Tuttavia, il dispositivo 3D PDMS include i fattori necessari dell'ambiente fisiologico 3D. Questo metodo sarà utile per studiare i comportamenti cellulari 3D e ha un grande potenziale di ricerca con diversi tipi di cellule, chemoattractants, e combinazioni ECM.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:773px;" width="773">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">22mm x 22mm coverslip&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">12-542-B</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Collagen I, Rat</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">CB-40236</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Collagenease</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">C5138</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">COMSOL Multiphysics 4.2</td>
			<td style="width:171px;">COMSOL Inc</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Used for simulating diffusion dynamics</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">10x DMEM</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2429</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DEME/F12</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher</td>
			<td>11330032</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">DNase</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">D4623</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">EGF Recombinant Mouse Protein</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:135px;">PMG8041</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:171px;">Life technologies</td>
			<td>16140-071</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Fiji-ImageJ</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Used for measuring branching length and angles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:171px;">GIBCO&#160;</td>
			<td style="width:135px;">5750-060</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">IMARIS</td>
			<td style="width:171px;">Bitplane</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Insulin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">19278</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Insulin-Transferrin-Selenium-X</td>
			<td style="width:171px;">GIBCO&#160;</td>
			<td style="width:135px;">51500</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Low-lint tissue</td>
			<td style="width:171px;">Kimberly-Clark Professional</td>
			<td style="width:135px;">Kimtech wipe</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Mold Material</td>
			<td style="width:171px;">Proto labs</td>
			<td style="width:135px;">Accura SL5530&#160;</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Mold printing equipment</td>
			<td style="width:171px;">Proto labs</td>
			<td style="width:135px;">Stereolithogrphy</td>
			<td style="width:269px;">Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Mold printing Service</td>
			<td style="width:171px;">Proto labs</td>
			<td style="width:135px;">Custom</td>
			<td style="width:269px;">https://www.protolabs.com/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">NaOH</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2770</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td>16777-164P</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Spinning-disk confocal microscope</td>
			<td style="width:171px;">Solamere Technology Group</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Sylgard 184</td>
			<td style="width:171px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT&#160;</td>
			<td style="width:269px;">PDMS kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Trypsin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9935</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d analysis of multi-cellular responses to chemoattractant gradients

Varie limitazioni dei sistemi di coltura cellulare 2D hanno suscitato interesse per le piattaforme di analisi e coltura cellulare 3D, che simulerebbero meglio la complessità spaziale e chimica dei tessuti viventi e mimano le funzioni tissutali in vivo. I recenti progressi nelle tecnologie di microfabbricazione hanno facilitato lo sviluppo di ambienti 3D in vitro in cui le cellule possono essere integrate in una matrice extracellulare ben definita (ECM) e un set definito di biomolecole solubili o a matrice associata. Tuttavia, le barriere tecnologiche hanno limitato il loro uso diffuso nei laboratori di ricerca. Qui, descriviamo un metodo per costruire semplici dispositivi per la cultura 3D e la sperimentazione con cellule e organoidi multicellulari in microambienti 3D con un gradiente chemioattrattante definito. Illustreremo l'uso di questa piattaforma per l'analisi della risposta delle cellule epiteliali e degli organoidi ai gradienti dei fattori di crescita, come il fattore di crescita epidermico (FEG). I gradienti del FEG erano stabili nei dispositivi per diversi giorni, portando alla formazione di rami diretti negli organoidi del seno. Questa analisi ci ha permesso di concludere che il rilevamento del gradiente collettivo da parte di gruppi di cellule è più sensibile rispetto alle singole cellule. Descriviamo anche il metodo di fabbricazione, che non richiede strutture fotolitografiche né tecniche avanzate di Litografia morbida. Questo metodo sarà utile per studiare i comportamenti cellulari 3D nel contesto dell'analisi dello sviluppo e degli stati patologici, compreso il cancro.

Il FEG è un regolatore essenziale della morfogenesi ramificazione nelle ghiandole mammarie e di un chemioattrattante critico che guida la migrazione delle cellule epiteliali del seno nella crescita invasiva del cancro. Abbiamo usato i dispositivi fluidi mesoscopici sopra descritti per studiare la risposta delle cellule ai gradienti del FEG definiti (Figura 1a, B)10. Il dispositivo produce un'area di coltura larga 5 mm...

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3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Descriviamo un metodo per costruire dispositivi per la cultura 3D e la sperimentazione con cellule e organoidi multicellulari. Questo dispositivo consente l'analisi delle risposte cellulari ai segnali solubili in microambienti 3D con gradienti chemioattrattante definiti. Gli organoidi sono meglio di cellule singole al rilevamento di ingressi rumorosi deboli.

Analisi 3D delle risposte multi-cellulari ai gradienti chemoattractant

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Le differenze nelle colture semplificate in vitro 2D rispetto agli ambienti tissutali 3D hanno aumentato l'interesse per i sistemi 3D per rappresentare la complessità spaziale e chimica dei tessuti viventi. Il processo di fabbricazione non richiede tecniche di struttura o fotolitografia. Tuttavia, il dispositivo 3D PDMS include i vettori necessari per le applicazioni dell'ambiente fisiologico 3D.Per la preparazione del dispositivo mesofluidico, utilizzare un programma software di progettazione tridimensionale tridimensionale per progettare la maschera dello stampo per il dispositivo polidimetilsilossano o PDMS e stampare lo stampo utilizzando apparecchiature di litografia stereo con una resina termoresistante. Quando lo stampo è pronto, mescolare approssimativamente tre millilitri di soluzione monomero PDMS per stampo con un agente polimerizzante con un rapporto 10 a uno e utilizzare un vuoto per degasare la miscela in un essiccatore sottovuoto per un'ora. Al termine dell'essiccazione, utilizzare un pezzo di nastro adesivo per rimuovere qualsiasi polvere dalla superficie dello stampo e riempire accuratamente lo stampo con la soluzione PDMS degassata.Quindi, polimerizza il PDMS a 80 gradi Celsius per due ore prima di lasciare raffreddare lo stampo a temperatura ambiente. Quando lo stampo viene raffreddato al tatto, utilizzare una lama per tagliare il limite tra lo stampo e pdms e sbucciare con cura il PDMS dallo stampo. Tagliare il PDMS per adattarlo a un coverslip da 22 per 22 millimetri e fare un foro all'ingresso.Utilizzando tessuti di lanugine bassi e 70%etanolo, pulire il dispositivo e asciugare e tamponare il dispositivo con un nuovo pezzo di nastro adesivo per rimuovere eventuali particelle di polvere di grandi dimensioni. Quindi autoclave il dispositivo PDMS e coverslip a 121 gradi Celsius per otto minuti bagnati e 15 minuti asciutti e trattare la superficie inferiore della parte PDMS e coprilip con una pistola di scarico corona per cinque minuti in un cappuccio di coltura tissutale prima di legare i pezzi insieme. Per caricare il dispositivo, è necessario innanzitutto rimodere le cellule di interesse in un volume appropriato di mezzo di crescita integrato con 1%penicillina e streptomicina e 1%insulina-transferrina-selenio-x.Successivamente mescolare 50 microlitri della sospensione cellulare della ghiandola mammaria con 425 microlitri di soluzione di collagene neutralizzata preparata al momento e riempire una pipetta da 200 microlitri con la sospensione della cellula di collagene. Iniettare la sospensione attraverso l'ingresso nel dispositivo PDMS fino a riempire l'intera camera e posizionare il dispositivo nell'incubatore a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5% per un'ora per indurre la gelazione prima di riempire i serbatoi su entrambi i lati con mezzo di crescita e riportare il dispositivo all'incubatore fino all'imaging confocale. Per l'imaging e la quantificazione 3D, installare una camera di coltura di imaging cellulare vivo su un microscopio confocale e preimpostare la temperatura e l'anidride carbonica rispettivamente a 37 gradi Celsius e al 5%.Aggiungere acqua al serbatoio della camera di imaging per umidificare la camera, posizionando le salviette umidificate nella camera se necessario e posizionando il dispositivo PDMS nella camera. Aggiungere il fattore di crescita epidermico a uno dei bacini come fonte del fattore nella formazione del gradiente lasciando che l'altro serbatoio serva da lavandino per lo sviluppo della distribuzione del fattore di crescita epidermica mediamente graduata. Quindi impostare l'intervallo della pila Z che copre il volume degli organoidi di interesse e avviare l'imaging.Alla fine dell'esperimento, utilizzare un programma di analisi delle immagini appropriato per misurare la lunghezza e l'angolo dei rami che si estendono dagli organoidi o la migrazione delle singole cellule. Sia nei test silico che in vitro ha rivelato la formazione di un gradiente del fattore di crescita epidermico lineare stabile attraverso l'area di coltura cellulare che dura circa due giorni senza rifornimento dei serbatoi della sorgente o del lavandino suggerendo che il fattore di crescita epidermico, una proteina da 6,4 kilodalton, può formare un gradiente stabile a base di diffusione all'interno di un gel di collagene preparato come dimostrato in un periodo di tempo relativamente breve. Gli organoidi mammari formano più rami in presenza di un fattore di crescita epidermico nanomolare spaziale uniforme 2,5 senza pregiudizi direzionali per tre giorni se il fattore di crescita epidermico viene aggiunto nel gradiente lineare per avere 0,5 nanomolare per millilitro.Tuttavia, la formazione del ramo mostra una distorsione direzionale significativa. Da notare che l'aggiunta di inibitori della giunzione gap sopprime la capacità degli organoidi di rispondere al gradiente. Il pH della soluzione di collagene è fondamentale per la gelazione e la vitalità cellulare.Se il collagene non viene neutralizzato prima della miscelazione, la vitalità cellulare sarà bassa. Questo metodo può essere esteso per adattarsi a modelli di tessuti più realistici e potrebbe ospitare la formazione di reti vascolari da singole cellule all'interno del gel.

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