Name: 3d analysis of multi-cellular responses to chemoattractant gradients
Uploaded: 2019-05-24T14:00:00
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Este trabalho foi apoiado por subsídios à AJE (NSF PD-11-7246, Fundação de pesquisa em câncer de mama (BCRF-17-048) e NCI U54 CA210173) e AL (U54CA209992).

Todo o trabalho animal foi conduzido de acordo com protocolos revisados e aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais da Universidade Johns Hopkins, faculdade de medicina.
1. fabricação do dispositivo mesofluídico
<ol><li>Projete a máscara do molde para o dispositivo de PDMS usando um software do CAD 3D.</li>
	<li>Imprima o molde usando o equipamento do estereolitografia com uma resina resistente térmica. Nota: os procedimentos aqui descritos foram realizados por...

<ol>
	<li>Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+and+extracellular+matrix+homeostasis.">Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).</li><li>Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins:+emerging+paradigms+of+signal+transduction.">Integrins: emerging paradigms of signal transduction.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).</li><li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Stem+Cell+Organoids.">Engineering Stem Cell Organoids.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).</li><li>Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+3D+matrix+microenvironment+regulates+cell+migration+through+spatiotemporal+dynamics+of+contractility-dependent+adhesions.">Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions.</a> Nature Communications. 6, 8720 (2015).</li><li>Meyvantsson, I., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+models+in+microfluidic+systems.">Cell culture models in microfluidic systems.</a> Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li><li>Zervantonakis, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+microfluidic+model+for+tumor+cell+intravasation+and+endothelial+barrier+function.">Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).</li><li>Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluidic+device+to+study+directional+angiogenesis+in+complex+tissue+and+organ+culture+models.">A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models.</a> Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+lapse+investigation+of+antibiotic+susceptibility+using+a+microfluidic+linear+gradient+3D+culture+device.">Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).</li><li>Ellison, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+communication+enhances+the+capacity+of+cell+ensembles+to+sense+shallow+gradients+during+morphogenesis.">Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+assays+of+murine+mammary+branching+morphogenesis+and+epithelial+invasion.">3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).</li></ol>

A fabricação de moldes PDMS foi realizada utilizando um serviço de impressão 3D comercial, mas também pode ser realizada por uma impressora 3D de alta-final em casa. Entre os vários métodos da fabricação 3D, o estereolitografia é recomendado para a geração de molde de alta resolução. Como a cura do PDMS ocorre em uma temperatura alta (80 ° c), os materiais devem ser suficientemente resistentes a termicamente, o que deve ser explicitamente especificado, se a impressão for terceirizada. Uma pós-cura térmi...

No ambiente fisiológico, as células são incorporadas em uma matriz extracelular (ECM) e expostas a uma infinidade de biomoléculas. As interações entre as células e o microambiente circundante regulam processos intracelulares controlando diversos fenótipos, incluindo migração, crescimento, diferenciação e sobrevida1,2. Muito tem sido aprendido sobre os comportamentos celulares em uma cultura de células 2D convencional. Entretanto, com o advento da imagem latente e da experimentação intravital com as pilhas encaixadas em hydrogels 3D, as diferenças importantes em comportamentos da pilha foram reconhecidas nas culturas 2D in vitro simplificadas contra o tecido 3D-como ambientes. Enquanto as células interagem com as fibras de ECM e sentem suas propriedades mecânicas dentro da matriz 3D, a rigidez do material do gel não é uma variável totalmente independente em um sistema in vitro 2D. A dimensionalidade altera a formação de adesão focal, resultando em diferentes morfologia e comportamento celular. Além disso, as células em uma superfície 2D são expostas a menos sinais de sinalização do que as células abertas a todas as direções em 3D.
Essas limitações aumentaram os interesses dos sistemas 3D que representam a complexidade espacial e química dos tecidos vivos e melhor prever as funções in vivo do tecido. Eles foram desenvolvidos em muitas formas de organóides como microestruturas celulares de automontagem para células aleatoriamente intercaladas em ECM3,4. Os recentes avanços nas tecnologias de microfabricação facilitaram o advento de vários tipos de sistemas de cultura 3D5,6,7, 8,9 para o estudo de alterações fenotípicas e respostas celulares a sinais solúveis; no entanto, as barreiras tecnológicas limitam o uso generalizado em laboratórios de pesquisa. Em muitos casos, os processos de fabricação requerem técnicas de fotolitografia e conhecimentos de fundo para litografia suave. Além disso, vários fatores devem ser controlados para construir com sucesso um dispositivo e para conseguir uma função óptima do dispositivo durante um longo período de tempo.
Nosso método descreve como construir um dispositivo 3D PDMS para incorporar células e organóides multicelulares em um microambiente 3D com gradientes quimioatrativos definidos e, em seguida, analisar respostas epiteliais ao EGF10. Nossos dados revelam que a capacidade de organóides para responder a gradientes de EGF superficial surge do acoplamento químico intercelular através de junções de Gap. Sugere o potencial de organóides para a deteção mais precisa de entradas espacially graduadas fracas e ruidosas. O processo da fabricação não exige uma facilidade da sala de limpeza nem técnicas do photolithography. No entanto, o dispositivo 3D PDMS inclui os fatores necessários do ambiente fisiológico 3D. Este método será útil para estudar os comportamentos celulares 3D e tem grande potencial de pesquisa com diferentes tipos de células, quimioattractantes e combinações de ECM.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:773px;" width="773">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">22mm x 22mm coverslip&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">12-542-B</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Collagen I, Rat</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">CB-40236</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Collagenease</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">C5138</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">COMSOL Multiphysics 4.2</td>
			<td style="width:171px;">COMSOL Inc</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Used for simulating diffusion dynamics</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">10x DMEM</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2429</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DEME/F12</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher</td>
			<td>11330032</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">DNase</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">D4623</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">EGF Recombinant Mouse Protein</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:135px;">PMG8041</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:171px;">Life technologies</td>
			<td>16140-071</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Fiji-ImageJ</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Used for measuring branching length and angles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:171px;">GIBCO&#160;</td>
			<td style="width:135px;">5750-060</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">IMARIS</td>
			<td style="width:171px;">Bitplane</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Insulin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">19278</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Insulin-Transferrin-Selenium-X</td>
			<td style="width:171px;">GIBCO&#160;</td>
			<td style="width:135px;">51500</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Low-lint tissue</td>
			<td style="width:171px;">Kimberly-Clark Professional</td>
			<td style="width:135px;">Kimtech wipe</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Mold Material</td>
			<td style="width:171px;">Proto labs</td>
			<td style="width:135px;">Accura SL5530&#160;</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Mold printing equipment</td>
			<td style="width:171px;">Proto labs</td>
			<td style="width:135px;">Stereolithogrphy</td>
			<td style="width:269px;">Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Mold printing Service</td>
			<td style="width:171px;">Proto labs</td>
			<td style="width:135px;">Custom</td>
			<td style="width:269px;">https://www.protolabs.com/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">NaOH</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2770</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td>16777-164P</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Spinning-disk confocal microscope</td>
			<td style="width:171px;">Solamere Technology Group</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Sylgard 184</td>
			<td style="width:171px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT&#160;</td>
			<td style="width:269px;">PDMS kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Trypsin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9935</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d analysis of multi-cellular responses to chemoattractant gradients

Várias limitações de sistemas de cultura de células 2D têm despertou interesse em plataformas de análise e cultura de células 3D, o que seria melhor imitar a complexidade espacial e química dos tecidos vivos e imitar as funções de tecido in vivo. Os recentes avanços nas tecnologias de microfabricação facilitaram o desenvolvimento de ambientes in vitro em 3D em que as células podem ser integradas em uma matriz extracelular bem definida (ECM) e um conjunto definido de biomoléculas solúveis ou matriciais associadas. No entanto, as barreiras tecnológicas limitaram seu uso generalizado em laboratórios de pesquisa. Aqui, descrevemos um método para construir dispositivos simples para a cultura 3D e experimentação com células e organóides multicelulares em microambientes 3D com um gradiente quimioatractivo definido. Nós ilustramos o uso desta plataforma para a análise da resposta de pilhas epithelial e de organóides aos gradientes de fatores de crescimento, tais como o fator de crescimento epidérmico (EGF). Os gradientes de EGF eram estáveis nos dispositivos por diversos dias que conduzem à formação dirigida da filial em organoids da mama. Essa análise permitiu concluir que a detecção coletiva de gradiente por grupos de células é mais sensível versus células individuais. Nós igualmente descrevemos o método da fabricação, que não exige facilidades do photolithography nem técnicas macias avançadas da litografia. Este método será útil para estudar os comportamentos celulares 3D no contexto da análise do desenvolvimento e dos Estados patológicos, incluindo o câncer.

EGF é um regulador essencial da morfogênese ramificando em glândulas mamárias e um quimioatractivo crítico orientando a migração de células epiteliais do peito no crescimento do cancro invasivo. Utilizamos os dispositivos fluílicos mesoscópicos descritos acima para estudar a resposta das células aos gradientes de EGF definidos (Figura 1a, B)10. O dispositivo produz uma área de cultura de 5 mm de largura, 10...

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3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Nós descrevemos um método para construir dispositivos para a cultura 3D e a experimentação com pilhas e os organoids multicelular. Este dispositivo permite a análise de respostas celulares a sinais solúveis em microambientes 3D com gradientes quimioatrativos definidos. Os organóides são melhores do que as células únicas na detecção de entradas barulhentas fracas.

Análise 3D de respostas multicelulares a gradientes Quimioatrativos

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

As diferenças em culturas in vitro 2D simplificadas versus ambientes semelhantes a tecidos 3D aumentaram o interesse em sistemas 3D para representar a complexidade espacial e química dos tecidos vivos. O processo de fabricação não requer técnicas de instalação ou fotolitografia. No entanto, o dispositivo PDMS 3D inclui os vetores necessários para aplicações de ambiente fisiológico 3D.Para a preparação do dispositivo mesofluido, use um programa de software de design tridimensional tridimensional para projetar a máscara do molde para o dispositivo polidimetilsiloxano ou PDMS e imprimir o molde usando equipamento de litografia estereotéreo com uma resina termoresistante. Quando o molde estiver pronto, misture aproximadamente três mililitros de solução monômero PDMS por molde com um agente de cura a uma proporção de 10 para um e use um vácuo para desgas a mistura em um desiccador de vácuo por uma hora. No final da dessecação, use um pedaço de fita adesiva para remover qualquer poeira da superfície do molde e encher cuidadosamente o molde com a solução PDMS desgasecida.Em seguida, cure o PDMS a 80 graus Celsius por duas horas antes de permitir que o molde esfrie à temperatura ambiente. Quando o molde for resfriado ao toque, use uma lâmina para cortar o limite entre o molde e o PDMS e retire cuidadosamente o PDMS do molde. Corte o PDMS para caber um deslizamento de cobertura de 22 por 22 milímetros e faça um furo na entrada.Usando tecidos de fiapos baixos e 70% de etanol, limpe o dispositivo e cubra o dispositivo com uma nova peça de fita adesiva para remover quaisquer partículas de poeira grandes. Em seguida, autoclave o dispositivo PDMS e cubra a 121 graus Celsius por oito minutos molhados e 15 minutos secos e trate a superfície inferior da parte PDMS e cubra com uma arma de descarga de corona por cinco minutos em uma capa de cultura de tecido antes de unir as peças. Para carregar o dispositivo, primeiro resuspenco as células de interesse em um volume adequado de crescimento médio suplementado com penicilina de 1%e estreptomicina e 1% insulina-transferrin-selênio-x.Em seguida, misture 50 microliters da suspensão celular da glândula mamária com 425 microliters de solução de colágeno neutralizada recém-preparada e encha uma pipeta de 200 microliteres com a suspensão celular de colágeno. Injete a suspensão através da entrada no dispositivo PDMS até que toda a câmara esteja cheia e coloque o dispositivo na incubadora a 37 graus Celsius com dióxido de carbono de 5% por uma hora para induzir a gelação antes de encher os reservatórios de ambos os lados com meio de crescimento e retornar o dispositivo à incubadora até que a imagem confocal. Para imagem 3D e quantificação, instale uma câmara de cultura de imagem de células vivas em um microscópio confocal e predefina a temperatura e o dióxido de carbono a 37 graus Celsius e 5%, respectivamente.Adicione água ao reservatório da câmara de imagem para umidificar a câmara, colocando lenços umedecidos na câmara conforme necessário e coloque o dispositivo PDMS na câmara. Adicione o fator de crescimento epidérmico a um dos reservatórios como fonte do fator na formação de gradientes deixando o outro reservatório para servir de pia para o desenvolvimento da distribuição do fator de crescimento epidérmico espacialmente classificado. Em seguida, defina o alcance da pilha Z cobrindo o volume de organoides de interesse e inicie a imagem.Ao final do experimento, use um programa de análise de imagem adequado para medir o comprimento e o ângulo dos ramos que se estendem dos organoides ou a migração de células individuais. Tanto em testes de silico quanto in vitro revelaram a formação de um gradiente de fator de crescimento epidérmico linear estável em toda a área de cultura celular que dura aproximadamente dois dias sem reposição dos reservatórios de origem ou pia sugerindo que o fator de crescimento epidérmico, uma proteína de 6,4 quilodalton, pode formar um gradiente estável à base de difusão dentro de um gel de colágeno preparado como demonstrado em um período relativamente curto de tempo. Organoides mamários formam múltiplos ramos na presença de fator de crescimento epidérmico nanomolar espacialmente uniforme 2,5 nanomolar sem viés direcional ao longo de três dias se o fator de crescimento epidérmico for adicionado no gradiente linear para ter 0,5 nanomolar por mililitro.No entanto, a formação do ramo apresenta um viés direcional significativo. Note-se que a adição de inibidores de junção de lacunas suprime a capacidade dos organoides de responder ao gradiente. O pH da solução de colágeno é fundamental para a gelação e viabilidade celular.Se o colágeno não for neutralizado antes da mistura, a viabilidade da célula será baixa. Este método pode ser estendido para acomodar modelagem de tecido mais realista e poderia acomodar a formação de rede vascular a partir de células individuais dentro do gel.

Research

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Bioengineering

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Criando Gradientes adesivas e solúvel para a migração celular Imaging com Microscopia de Fluorescência

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