Name: 3d analysis of multi-cellular responses to chemoattractant gradients
Uploaded: 2019-05-24T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por donaciones a AJE (NSF PD-11-7246, Breast Cancer Research Foundation (BCRF-17-048), y NCI U54 CA210173) y AL (U54CA209992).

Todo el trabajo en animales se llevó a cabo de acuerdo con los protocolos revisados y aprobados por el Comité institucional de cuidado y uso de animales, Universidad Johns Hopkins, Facultad de medicina.
1. fabricación del dispositivo mesofluidic
<ol><li>Diseñe la máscara del molde para el dispositivo PDMS utilizando un software CAD 3D.</li>
	<li>Imprima el molde con un equipo de estereolitografía con una resina resistente térmica. Nota: los procedimientos descritos aquí fueron lle...

<ol>
	<li>Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+and+extracellular+matrix+homeostasis.">Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).</li><li>Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins:+emerging+paradigms+of+signal+transduction.">Integrins: emerging paradigms of signal transduction.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).</li><li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Stem+Cell+Organoids.">Engineering Stem Cell Organoids.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).</li><li>Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+3D+matrix+microenvironment+regulates+cell+migration+through+spatiotemporal+dynamics+of+contractility-dependent+adhesions.">Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions.</a> Nature Communications. 6, 8720 (2015).</li><li>Meyvantsson, I., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+models+in+microfluidic+systems.">Cell culture models in microfluidic systems.</a> Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).</li><li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+organs-on-chips.">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li><li>Zervantonakis, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+microfluidic+model+for+tumor+cell+intravasation+and+endothelial+barrier+function.">Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).</li><li>Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluidic+device+to+study+directional+angiogenesis+in+complex+tissue+and+organ+culture+models.">A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models.</a> Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).</li><li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+lapse+investigation+of+antibiotic+susceptibility+using+a+microfluidic+linear+gradient+3D+culture+device.">Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).</li><li>Ellison, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+communication+enhances+the+capacity+of+cell+ensembles+to+sense+shallow+gradients+during+morphogenesis.">Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+assays+of+murine+mammary+branching+morphogenesis+and+epithelial+invasion.">3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).</li></ol>

La fabricación de moldes PDMS se realizó utilizando un servicio de impresión 3D comercial, pero también puede ser logrado por una impresora 3D de alta gama en la casa. Entre los diversos métodos de fabricación 3D, la estereolitografía se recomienda para la generación de moldes de alta resolución. Debido a que el curado PDMS se produce a una temperatura alta (80 ° c), los materiales deben ser suficientemente resistentes térmicamente, lo que debe especificarse explícitamente, si la impresión es externalizada. ...

En el entorno fisiológico, las células se incrustan en una matriz extracelular (ECM) y se exponen a una plétora de biomoléculas. Las interacciones entre las células y el microentorno circundante regulan los procesos intracelulares que controlan diversos fenotipos, incluyendo la migración, el crecimiento, la diferenciación y la supervivencia1,2. Se ha aprendido mucho acerca de los comportamientos celulares en un cultivo celular 2D convencional. Sin embargo, con el advenimiento de la imagen intravital y la experimentación con células incrustadas en los hidrogeles 3D, se han reconocido importantes diferencias en los comportamientos celulares en los cultivos 2D in vitro simplificados frente a los entornos de tejido 3D. Mientras que las células interactúan con las fibras de ECM y detectan sus propiedades mecánicas dentro de la matriz 3D, la rigidez del material del gel no es una variable totalmente independiente en un sistema 2D in vitro. La dimensionalidad altera la formación de adherencia focal, resultando en diferentes morfología y comportamiento de las células. Además, las celdas en una superficie 2D se exponen a menos señales de señalización que las celdas abiertas a todas las direcciones en 3D.
Estas limitaciones han incrementado los intereses de los sistemas 3D que representan la complejidad espacial y química de los tejidos vivos y predicen mejor las funciones de tejido in vivo. Se han desarrollado en muchas formas a partir de organoides como microestructuras celulares de auto-ensamblaje a las células intercaladas aleatoriamente en ECM3,4. Los recientes avances en las tecnologías de microfabricación han facilitado el advenimiento de varios tipos de sistemas de cultivo 3D5,6,7,8,9 para estudiar los cambios fenotíricos y respuestas celulares a señales solubles; sin embargo, las barreras tecnológicas limitan el uso generalizado en los laboratorios de investigación. En muchos casos, los procesos de fabricación requieren técnicas de fotolitografía y conocimientos de fondo para la litografía blanda. Por otra parte, varios factores deben ser controlados para construir con éxito un dispositivo y para lograr una función óptima del dispositivo durante un largo período de tiempo.
Nuestro método describe cómo construir un dispositivo PDMS 3D para incorporar células y organoides multicelulares en un microentorno 3D con gradientes de prenilado definidos y luego analizar las respuestas epiteliales al EGF10. Nuestros datos revelan que la capacidad de los organoides para responder a los degradados de EGF superficiales surge del acoplamiento químico intercelular a través de uniones de brecha. Sugiere el potencial de los organoides para una detección más precisa de entradas débiles y ruidosas espacialmente graduadas. El proceso de fabricación no requiere una instalación de sala limpia ni técnicas de fotolitografía. Sin embargo, el dispositivo PDMS 3D incluye los factores necesarios del entorno fisiológico 3D. Este método será útil para estudiar comportamientos celulares en 3D y tiene un gran potencial de investigación con diferentes tipos de células, quimioattractantes, y combinaciones de ECM.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:773px;" width="773">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">22mm x 22mm coverslip&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">12-542-B</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Collagen I, Rat</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">CB-40236</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Collagenease</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">C5138</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">COMSOL Multiphysics 4.2</td>
			<td style="width:171px;">COMSOL Inc</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Used for simulating diffusion dynamics</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">10x DMEM</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2429</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DEME/F12</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher</td>
			<td>11330032</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">DNase</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">D4623</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">EGF Recombinant Mouse Protein</td>
			<td style="width:171px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:135px;">PMG8041</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:171px;">Life technologies</td>
			<td>16140-071</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Fiji-ImageJ</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Used for measuring branching length and angles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:171px;">GIBCO&#160;</td>
			<td style="width:135px;">5750-060</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">IMARIS</td>
			<td style="width:171px;">Bitplane</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Insulin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">19278</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Insulin-Transferrin-Selenium-X</td>
			<td style="width:171px;">GIBCO&#160;</td>
			<td style="width:135px;">51500</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Low-lint tissue</td>
			<td style="width:171px;">Kimberly-Clark Professional</td>
			<td style="width:135px;">Kimtech wipe</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Mold Material</td>
			<td style="width:171px;">Proto labs</td>
			<td style="width:135px;">Accura SL5530&#160;</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Mold printing equipment</td>
			<td style="width:171px;">Proto labs</td>
			<td style="width:135px;">Stereolithogrphy</td>
			<td style="width:269px;">Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Mold printing Service</td>
			<td style="width:171px;">Proto labs</td>
			<td style="width:135px;">Custom</td>
			<td style="width:269px;">https://www.protolabs.com/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">NaOH</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2770</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td>16777-164P</td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Spinning-disk confocal microscope</td>
			<td style="width:171px;">Solamere Technology Group</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:199px;">Sylgard 184</td>
			<td style="width:171px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT&#160;</td>
			<td style="width:269px;">PDMS kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:199px;">Trypsin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9935</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d analysis of multi-cellular responses to chemoattractant gradients

Varias limitaciones de los sistemas de cultivo celular 2D han despertado interés en las plataformas de análisis y cultivo celular 3D, que imitaría mejor la complejidad espacial y química de los tejidos vivos y imitará las funciones de tejido in vivo. Los recientes avances en las tecnologías de microfabricación han facilitado el desarrollo de entornos 3D in vitro en los que las células pueden integrarse en una matriz extracelular bien definida (ECM) y un conjunto definido de biomoléculas solubles o asociadas a matrices. Sin embargo, las barreras tecnológicas han limitado su uso generalizado en los laboratorios de investigación. Aquí describimos un método para construir dispositivos simples para la cultura 3D y la experimentación con células y organoides multicelulares en microentornos 3D con un gradiente de quimioattractant definido. Ilustramos el uso de esta plataforma para el análisis de la respuesta de células epiteliales y organoides a gradientes de factores de crecimiento, como el factor de crecimiento epidérmico (EGF). Los gradientes de EGF fueron estables en los dispositivos durante varios días, lo que condujo a la formación de ramas dirigidas en organoides mamarios. Este análisis nos permitió concluir que la detección de gradiente colectiva por grupos de células es más sensible frente a células individuales. También describimos el método de fabricación, que no requiere instalaciones de fotolitografía ni técnicas avanzadas de litografía blanda. Este método será útil para estudiar los comportamientos celulares en 3D en el contexto del análisis del desarrollo y los estados patológicos, incluyendo el cáncer.

El EGF es un regulador esencial de la morfogénesis ramificada en las glándulas mamarias y un quimioattractante crítico que guía la migración de las células epiteliales del seno en el crecimiento invasivo del cáncer. Se utilizaron los dispositivos fluídico mesoscópicos descritos anteriormente para estudiar la respuesta de las células a los gradientes definidos de EGF (figura 1A, B)10. El dispositivo produce un...

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3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Describimos un método para construir dispositivos para la cultura 3D y la experimentación con células y organoides multicelulares. Este dispositivo permite el análisis de las respuestas celulares a señales solubles en microambientes 3D con degradados de quimioattractant definidos. Los organoides son mejores que las células individuales en la detección de entradas ruidosas débiles.

Análisis 3D de las respuestas multicelulares a los degradados Quimioattractant

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Las diferencias en cultivos in vitro 2D simplificados frente a entornos similares a tejidos 3D han aumentado el interés en los sistemas 3D para representar la complejidad espacial y química de los tejidos vivos. El proceso de fabricación no requiere instalaciones ni técnicas de fotolitografía. Sin embargo, el dispositivo 3D PDMS incluye los vectores necesarios para aplicaciones de entorno fisiológico 3D.Para la preparación de dispositivos mesofluídicos, utilice un programa de software de diseño tridimensional adecuado para diseñar la máscara del molde para el dispositivo polidimetilsiloxano o PDMS e imprimir el molde utilizando equipos de litografía estéreo con una resina termorresistente. Cuando el molde esté listo, mezcle aproximadamente tres mililitros de solución monórica PDMS por molde con un agente de curado en una proporción de 10 a 10 y utilice un vacío para desgasificar la mezcla en un desecador de vacío durante una hora. Al final de la desicación, utilice un pedazo de cinta adhesiva para eliminar cualquier polvo de la superficie del molde y llene cuidadosamente el molde con la solución PDMS desgasada.A continuación, cura el PDMS a 80 grados Centígrados durante dos horas antes de permitir que el molde se enfríe a temperatura ambiente. Cuando el molde se enfríe al tacto, utilice una hoja para cortar el límite entre el molde y PDMS y pelar cuidadosamente los PDMS del molde. Recorte el PDMS para que se ajuste a un cubreobjetos de 22 por 22 milímetros y haga un agujero en la entrada.Usando tejidos de pelusa baja y 70%etanol, limpie el dispositivo y cubra y desempolve el dispositivo con una nueva pieza de cinta adhesiva para eliminar las partículas de polvo grandes. A continuación, autoclave el dispositivo PDMS y el cubreobjetos a 121 grados Celsius durante ocho minutos húmedos y 15 minutos secos y tratar la superficie inferior de la parte PDMS y cubreobjetos con una pistola de descarga corona durante cinco minutos en una capucha de cultivo de tejido antes de unir las piezas. Para cargar el dispositivo, primero resuspender las células de interés en un volumen adecuado de medio de crecimiento complementado con 1%penicilina y estreptomicina y 1%insulina-transferrina-selenium-x.A continuación mezclar 50 microlitros de la suspensión celular de la glándula mamaria con 425 microlitros de solución de colágeno neutralizada recién preparada y llenar una pipeta de 200 microlitros con la suspensión de la célula de colágeno. Inyecte la suspensión a través de la entrada en el dispositivo PDMS hasta que se llene toda la cámara y coloque el dispositivo en la incubadora a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante una hora para inducir la gelización antes de llenar los depósitos en ambos lados con medio de crecimiento y devolver el dispositivo a la incubadora hasta que se realicen imágenes confocales. Para la toma de imágenes 3D y la cuantificación, instale una cámara de cultivo de imágenes de células vivas en un microscopio confocal y preestablece la temperatura y el dióxido de carbono a 37 grados centígrados y al 5%, respectivamente.Agregue agua al depósito de la cámara de imágenes para humidificar la cámara, colocando toallitas húmedas en la cámara según sea necesario y coloque el dispositivo PDMS en la cámara. Añadir factor de crecimiento epidérmico a uno de los reservorios como una fuente del factor en la formación de gradiente dejando el otro reservorio para servir como un sumidero para el desarrollo de la distribución del factor de crecimiento epidérmico clasificado espacialmente. A continuación, establezca el rango de la pila Z que cubre el volumen de organoides de interés e inicie la toma de imágenes.Al final del experimento, utilice un programa de análisis de imágenes adecuado para medir la longitud y el ángulo de las ramas que se extienden desde los organoides o la migración de células individuales. Tanto en pruebas de silico como in vitro revelaron la formación de un gradiente de factor de crecimiento epidérmico lineal estable a través del área de cultivo celular que duran aproximadamente dos días sin reponer la fuente o los depósitos del fregadero, lo que sugiere que el factor de crecimiento epidérmico, una proteína de 6,4 kilodalton, puede formar un gradiente estable a base de difusión dentro de un gel de colágeno preparado como se ha demostrado durante un período de tiempo relativamente corto. Los organoides mamarios forman múltiples ramas en presencia de un factor de crecimiento epidérmico nanomolar espacialmente uniforme de 2,5 nanomolares sin sesgo direccional durante tres días si se añade factor de crecimiento epidérmico en el gradiente lineal para tener 0,5 nanomolares por mililitro.Sin embargo, la formación de ramas muestra un sesgo direccional significativo. Cabe destacar que la adición de inhibidores de la unión de brecha suprime la capacidad de los organoides para responder al gradiente. El pH de la solución de colágeno es fundamental para la geleración y la viabilidad celular.Si el colágeno no se neutraliza antes de mezclar, la viabilidad celular será baja. Este método se puede extender para acomodar el modelado de tejido más realista y podría acomodar la formación de la red vascular a partir de células individuales dentro del gel.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Diseño de un biorreactor de presión cíclica de la Ex Vivo Estudio de las válvulas aórtica del corazón

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Investigación

Bioingeniería

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Creación de degradados adhesivas y soluble para la migración celular con imágenes de microscopía de fluorescencia

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Microscopía correlativa para el análisis estructural en 3D de Interacciones Dinámicas

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

Modificación Multi-Escala de implantes metálicos con gradientes de poro, polielectrolitos y su control indirecto<em&gt; En vivo</em

Metallic implants, especially titanium implants, are widely used in  clinical applications. Tissue in-growth and integration to these implants in  the ...

A Method for Evaluating Timeliness and Accuracy of Volitional Motor Responses to Vibrotactile Stimuli

Un método para evaluar puntualidad y la exactitud de las respuestas Volitiva Motorizados para vibrotáctil Estímulos

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