Name: convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images
Uploaded: 2019-05-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية زمالة ما بعد الدكتوراه (AY)، وكالة مشاريع البحوث المتقدمة الدفاع (DARPA) إعادة التنظيم واللدونة لتسريع الانتعاش الإصابة (REPAIR; N66001-10-C-2010)، R01. NS073940، ومن قبل مركز التصوير في علم الأعصاب UCSF. كما تم دعم هذا العمل من قبل معهد يونيس كينيدي شيفير الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت جائزة رقم K12HD073945، ومركز واشنطن الوطني لبحوث الرئيسيات (WaNPCR، P51 OD010425)، و مركز تكنولوجيا الأعصاب (CNT، وهو مركز البحوث الهندسية للمؤسسة الوطنية للعلوم تحت منحة EEC-1028725). نشكر كاميلو دياز بوتيا، تيم هانسون، فيكتور خرازيا، دانيال سيلفرسميث، كارين ج. ماكلويد، جوليانا ميلاني، وبليكلي أندروز على مساعدتهم في التجارب ونان تيان، جيوي هي، بيتر ليدوكوبيتش، ميشيل ماهاربيز، وتوني هاون على المساعدة التقنية.

وقد وافقت جامعة كاليفورنيا، لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانية في سان فرانسيسكو، على جميع الإجراءات، وهي متوافقة مع دليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. تم تنفيذ الإجراء التالي باستخدام اثنين من الذكور البالغين rhesus macaques من 8 و 7 سنوات من العمر، وزنها 17.5 كجم و 16.5 كجم (القرد G وا...

<ol>
	<li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li><li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates.">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).</li><li>Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccade+modulation+by+optical+and+electrical+stimulation+in+the+macaque+frontal+eye+field.">Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field.</a> Journal of Neuroscience. 33 (42), 16684-16697 (2013).</li><li>Gerits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetically+induced+behavioral+and+functional+network+changes+in+primates.">Optogenetically induced behavioral and functional network changes in primates.</a> Current Biology. 22 (18), 1722-1726 (2012).</li><li>Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccadic+eye+movements+evoked+by+optogenetic+activation+of+primate+V1.">Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1.</a> Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).</li><li>Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+electrical+microstimulation+systematically+bias+visuospatial+choice+in+primates.">Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates.</a> Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).</li><li>Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+pharmacological+suppression+of+spatial+clusters+of+face+neurons+reveal+their+causal+role+in+face+gender+discrimination.">Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).</li><li>Ledochowitsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+optical+control+and+simultaneous+electrical+readout+of+extended+cortical+circuits.">Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits.</a> Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large-Scale+Interface+for+Optogenetic+Stimulation+and+Recording+in+Nonhuman+Primates.">A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates.</a> Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).</li><li>Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+all-optical+interrogation+of+cortical+neurons+in+awake-behaving+nonhuman+primates.">Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates.</a> PLoS Biology. 16 (8), e2005839 (2018).</li><li>Bankiewicz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+AAV+vector+in+parkinsonian+monkeys;+in+vivo+detection+of+gene+expression+and+restoration+of+dopaminergic+function+using+pro-drug+approach.">Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach.</a> Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).</li><li>Kells, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+therapy-based+method+for+the+delivery+of+therapeutics+to+primate+cortex.">Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).</li><li>Krauze, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflux-free+cannula+for+convection-enhanced+high-speed+delivery+of+therapeutic+agents.">Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents.</a> Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+optogenetic+expression+in+macaque+cortex+obtained+with+MR-guided,+convection+enhanced+delivery+(CED)+of+AAV+vector+to+the+thalamus.">Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+cortical+reorganization+using+optogenetics+in+non-human+primates.">Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+setup+for+chronic+optogenetic+stimulation+and+recording+across+cortical+areas+in+non-human+primates.">Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates.</a> SPIE BiOS. , (2015).</li><li>Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+parameters+and+virus+dependent+choice+of+promoters+to+improve+neuron+targeting+in+the+nonhuman+primate+brain.">Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain.</a> Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).</li><li>Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FEF+inactivation+with+improved+optogenetic+methods.">FEF inactivation with improved optogenetic methods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), (2016).</li><li>Bobo, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+macromolecules+in+the+brain.">Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2076-2080 (1994).</li><li>Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+distribution+of+large+molecules+in+gray+matter+during+interstitial+drug+infusion.">Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion.</a> Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).</li><li>Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+convective+delivery+of+macromolecules+to+the+spinal+cord.">Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord.</a> Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).</li><li>Szerlip, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+convection-enhanced+delivery+of+viruses+and+virus-sized+particles.">Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).</li></ol>

هنا، نحدد تقنية مجدية وفعالة لتحقيق التعبير البصري على نطاق واسع في القشرة الحسية الجسدية والحركية الأولية NHP من قبل التصوير بالرنين المغناطيسي الموجه. استخدام الرنين المغناطيسي الموجه MR يقدم مزايا كبيرة على الأساليب التقليدية للتسريب الفيروسي في الدماغ NHP. وتتمثل إحدى هذه المزايا في ال?...

علم الوراثة البصرية هو أداة قوية تسمح بالتلاعب في النشاط العصبي ودراسة اتصالات الشبكة في الدماغ. تنفيذ هذه التقنية في الرئيسيات غير البشرية (NHPs) لديه القدرة على تعزيز فهمنا للحساب العصبي على نطاق واسع, الإدراك, والسلوك في الدماغ الرئيسيات. على الرغم من أن علم الوراثة البصرية قد نفذت بنجاح في NHPs في السنوات الأخيرة1،2،3،4،5،6،7،وهو التحدي الذي يواجه الباحثون تحقيق مستويات عالية من التعبير عبر مناطق الدماغ الكبيرة في هذه الحيوانات. هنا، نحن نقدم نهج فعال ومبسط لتحقيق مستويات عالية من التعبير البصري في جميع أنحاء مناطق واسعة من القشرة في المكاك. هذه التقنية لديها إمكانات كبيرة لتحسين الدراسات البصريات الحالية في هذه الحيوانات في تركيبة مع الدولة من بين الفن تسجيل8و9 والتحفيز البصري10 التكنولوجيات.
الحمل الحراري تعزيز التسليم (CED) هو وسيلة راسخة لتسليم العوامل الدوائية وغيرها من الجزيئات الكبيرة، بما في ذلك ناقلات الفيروسية، إلى الجهاز العصبي المركزي11،12،13. في حين أن طرق التسليم التقليدية تنطوي على ضخ اتّصال منخفض الحجم متعدد موزع ة عبر مناطق صغيرة من الدماغ، يمكن أن يحقق CED توزيعًا أوسع وأكثر تكافؤًا للعوامل مع عدد أقل من التسريبات. تدفق السوائل السائبة الناجمة عن الضغط (الحمل الحراري) أثناء التسريب يسمح بنقل الأنسجة المستهدفة على نطاق أوسع وبشكل موحد عند تقديم ناقلات الفيروسية مع CED. في الدراسات الحديثة، أظهرنا الانتراب واللاحقة التعبير الجيني لمساحات كبيرة من المحرك الأولي (M1) والحسية الجسدية (S1) القشرية9 والمهاد14 باستخدام الرنين المغناطيسي (MR) الموجهة CED.
هنا، نحن الخطوط العريضة لاستخدام CED لتحقيق التعبير البصري الوراثي عبر المناطق القشرية الكبيرة مع عدد قليل فقط من الحقن القشرية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL High Pressure IV Tubing</td>
			<td>Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA</td>
			<td>533640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP</td>
			<td>Penn Vector Core, University of Pennsylvania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABS plastic</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>ABSplus-P430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimicrobial incise drape</td>
			<td>3M</td>
			<td>6650EZ</td>
			<td>Ioban Drape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Acrylic</td>
			<td>Henry Schein, Inc.</td>
			<td>1013117</td>
			<td>Acrylic Bonding Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevators</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>10196-564</td>
			<td>Langenbeck Elevator, Wide Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine suture</td>
			<td>McKesson Medical-Surgical Inc.</td>
			<td>1034505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadoteridol</td>
			<td>Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser for light stimulation</td>
			<td>Omicron-Laserage, Germany</td>
			<td>PhoxX 488-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR compatible 3cc syringe</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>59-8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR Imaging Software</td>
			<td>Pixmeo</td>
			<td>OsiriX MD 10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-Compatible Pump</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>Harvard PHD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-compatible stereotaxic frame</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430M MRI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifix Clamp Style Catheter Connector</td>
			<td>B-Braun, Bethlehem, PA, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Screws</td>
			<td>Plastics 1</td>
			<td>0-80 x 1/8N</td>
			<td>Nylon screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium screws</td>
			<td>Crist Instrument Co., Inc.</td>
			<td>6-YCX-0312</td>
			<td>Self-tapping bone screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>GerMedUSA Inc,</td>
			<td>SKU:GV70-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uPrinter SE 3D printer</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin E Capsule</td>
			<td>Pure Encapsulations, LLC.</td>
			<td>DE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet sterile absorbable gelatin</td>
			<td>Pfizer Inc.</td>
			<td>AZL0009034201</td>
			<td>Gelfoam</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images

في الجينات البصرية غير البشرية (NHP)، غالباً ما تكون إصابة المناطق القشرية الكبيرة بالنواقل الفيروسية مهمة صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً. هنا، نبرهن على استخدام الرنين المغناطيسي (MR) الموجهة الحمل الحراري تعزيز التسليم (CED) من ناقلات الفيروسية البصرية في الحسية الجسدية الأولية (S1) والمحرك (M1) القشرية من المكاك للحصول على كفاءة، والتعبير القشرية على نطاق واسع من قنوات أيون حساسة للضوء. تم حقن ناقلات الفيروسية المرتبطة بالغدينو (AAV) التي ترمز إلى أوبسين C1V1 المنصهر ة إلى بروتين فلوري أصفر (EYFP) في قشرة المكاك ريسوس تحت CED الموجهة بالرنين المغناطيسي. بعد ثلاثة أشهر من التسريب، أكد التصوير الفلورسنت مناطق كبيرة منالتعبير البصري (> 130 مم 2) في M1 و S1 في اثنين من المكاك. وعلاوة على ذلك، تمكنا من تسجيل استجابات موثوقة للفيزيولوجيا الكهربائية التي تثير الضوء من المناطق التي تعبر عن ذلك باستخدام صفائف الكورتيكوستيصور ية الدقيقة. في وقت لاحق التحليل النسيجي وتلطيخ المناعة ضد مراسل كشفت عن التعبير البصريات واسعة النطاق وكثيفة في M1 و S1 المقابلة للتوزيع المشار إليه من قبل التصوير الفلورسنت. هذه التقنية تمكننا من الحصول على التعبير عبر مناطق واسعة من القشرة في غضون فترة أقصر من الزمن مع الحد الأدنى من الضرر مقارنة مع التقنيات التقليدية ويمكن أن يكون النهج الأمثل للتسليم الفيروسي البصري في الحيوانات الكبيرة مثل NHPs. هذا النهج يدل على إمكانات كبيرة للتلاعب على مستوى الشبكة من الدوائر العصبية مع خصوصية من نوع الخلية في النماذج الحيوانية التطورية القريبة من البشر.

التسليم المعزز للتصوير الحراري (CED) تحت إرشادات التصوير بالرنين المغناطيسي
تم رصد انتشار ناقلات الفيروسية خلال ضخ CED تحت إشراف صور MR على الانترنت (الشكل3A). في هذه الدراسة، تم استهداف S1 و M1 من اثنين من الالقردة (الشك...

Watch this Scientific Journal Video about Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images at JoVE.com

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

هنا، نقوم بإظهار الرنين المغناطيسي (MR) الموجهة الحمل الحراري تعزيز التسليم (CED) من النواقل الفيروسية في القشرة كنهج فعال ومبسط لتحقيق التعبير البصري الجيني عبر المناطق القشرية الكبيرة في الدماغ macaque.

الحمل الحراري تعزيز التسليم من ناقلات الفيروسية المرتبطة الغدينو البصريات إلى قشرة ريسوس Macaque تحت توجيه الصور بالرنين المغناطيسي على الانترنت

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

إن تحسين التسليم الحراري، أو CED، للنواقل الفيروسية البصرية في الرئيسيات غير البشرية سيمكن الباحثين من التعامل مع النشاط العصبي على نطاق واسع لفهم الحسابات والسلوكيات العصبية المعقدة. مع CED يمكننا تحقيق التعبير البصري عالية عبر مناطق واسعة من الدماغ الرئيسيات مع حقن قليلة فقط في فترة قصيرة من الزمن مقارنة مع الطرق التقليدية. يتم إجراء الرنين المغناطيسي أو زرع غرفة MR متوافقة باستخدام الممارسة القياسية في العمليات الجراحية الرئيسيات غير البشرية ، يتم وصف الإجراء بالتفصيل في بروتوكول النص ويرد موجزًا بإيجاز في هذا الفيديو.بعد التخوم الحيوانية، وتحديد المواقع، والشق الأولي كما هو موضح في بروتوكول النص، قم بإنشاء عملية استئصال القحف الدائرية لتغطية المسارات المخططة مسبقًا للحقن باستخدام التريبين. إنشاء المسافة البادئة في وسط استئصال القحف المخطط لها في عمق كاف في الجمجمة لترسيخ التريبين باستخدام نقطة مركز قابل للتعديل من التريبين. مرة واحدة تم إجراء المركز، خفض trephine على الجمجمة وتدوير التربتين في اتجاه عقارب الساعة ومضادة عقارب الساعة أثناء تطبيق الضغط النزولي حتى يمكن إزالة غطاء العظام مع ملقط.بعد رفع دورا كما هو مفصل في بروتوكول النص، وقطع دورا من المركز إلى حافة استئصال القحف والاستمرار على طول الحافة مع مقص العيون غرامة. جبل العرف أسطواني جعل الحمل الحراري تعزيز تسليم MR غرفة متوافقة مع الجمجمة على رأس استئصال القحف لتوفير دعم القنب أثناء التسريب بحيث انحناء شفة الغرفة محاذاة بشكل جيد مع انحناء الجمجمة. تأمين يزرع إلى الجمجمة باستخدام إما مسامير بلاستيكية والأكريليك الأسنان أو مسامير التيتانيوم قليلة.بعد وقت قصير من زرع غرفة متوافقة MR وإدراج شبكة حقن القنية في الغرفة، وملء الشبكة مع 0.9٪ المالحة لتصور مواقع الحقن عن طريق الصور التشريحية MR. أيضا ملء تجاويف الغرفة مع رغوة هلام معقم قابل للامتصاص الرطب للحفاظ على رطوبة الدماغ. تغطية الجلد والاسطوانة مع التنقية المضادة للميكروبات معقمة لتغطيه للحفاظ على عقم الاسطوانات أثناء النقل وFUES.ضع كبسولة فيتامين E لوضع علامة على الجزء العلوي من شبكة الحقن لتحديد الهوية الإيجابية. بينما يبقى الحيوان في حالة انبات، فصل أنبوب endotracheal من دائرة التخدير وإعادة ربطه إلى جهاز ISOflurane MR المحمولة المتوافقة. نقل الحيوان إلى ماسح التصوير بالرنين المغناطيسي.الحصول على صور T1 لحساب المسافة من أعلى شبكة الحقن والسطح القشرية. الكبسولة فيتامين (ه) واضحة في الصور T1 وينبغي أن تستخدم كعلامة لأعلى شبكة الحقن. الحصول على صور T2 لتحديد أدلة cannula الأمثل لكل موقع على أساس الموقع المستهدف من التسريب.تمتلئ شبكة القنية بالملحة المالحة التي هي أفضل مرئية في صور T2. باستخدام برنامج التصوير MR، انتقل من خلال الطائرات التاجية والقوس للعثور على الموقع المستهدف من التسريب. بعد ذوبان ناقلات الفيروسية لبضع ساعات في درجة حرارة الغرفة، وخلط ناقلات الفيروسية مع وكيل تباين MR gadoteridol عن طريق خلط ماصة أو دوامة.تحميل الفيروس المختلط في 0.2 ملليلتر ارتفاع ضغط الرابع أنابيب. باستخدام ارتفاع ضغط أنابيب الرابع، وربط خط تمديد طويل إلى حقنة MR متوافقة ثلاث ملليلتر ورئيس مع المالحة. قم بتوصيل الطرف الآخر من أنابيب التمديد الطويلة إلى أنابيب IV 0.2 ملليلتر محملة بالفيروس.ثم نعلق على cannula مقاومة الجزر مع تلميح ملليلتر واحد صعدت إلى نهاية هذا التجميع مع موصل القسطرة نمط المشبك. وأخيرا تعيين حقنة في مضخة MR متوافق. باستخدام الصور MR تشريحية خط الأساس، حدد موقع شبكة حقن كانولا وعمق الإدراج اللازمة للوصول إلى موقع ضخ الهدف.وضع علامة على عمق الإدراج على القنية باستخدام شريط معقمة. تبدأ ضخ بمعدل ميكرولتر واحد في الدقيقة والتحقق بصريا من تدفق السائل في خط التسريب عن طريق مراقبة طرد السائل من تلميح كانولا. إدراج القنية يدويا من خلال شبكة الحقن إلى عمق الهدف مع الحفاظ على تدفق في خط التسريب لأن هذا سيمنع الأنسجة اختراق انسداد كانولا أثناء الإدراج.الآن الحصول على فلاش سريع T1-المرجح الصور لرصد على الانترنت من ضخ ناقلات الفيروسية. بعد غرس ما يقرب من 10 ميكرولترات من الناقل بحيث يتم غرس ما يكفي من الفيروسات للكشف في الماسح الضوئي MR، والحصول على صور MR للتحقق من وضع كانولا الصحيح كما يتضح من انتشار لاحظت الفيروس. إذا كان عمق القنية المدرجة غير صحيح، ضبط العمق وفقا لذلك أو ببطء إزالة القنية وإعادة استخدام الإدراج.مراقبة التسريب عن طريق توجيه الصور MR على الانترنت. زيادة معدل التسريب إلى خمسة ميكرولتررس في الدقيقة الواحدة من قبل microliter واحد في خطوات دقيقة كل بضع دقائق. من المهم زيادة معدل التسريب ببطء وعدم تجاوز خمسة ميكرولترات في الدقيقة الواحدة حيث أن معدلات التسريب العالية يمكن أن تسبب تلف الأنسجة.بعد ضخ ما يقرب من 40 ميكرولترات من ناقلات الفيروسية، والبدء في خفض معدل التسريب من قبل microliter واحد في خطوات دقيقة. وقف التسريب بعد حقن ما يقرب من 50 ميكرولترات. اتركي القنية في مكانها لمدة عشر دقائق.إزالة ببطء كانولا من الدماغ والانتقال إلى الموقع التالي. غطي الأسطوانة بستارة معقمة في نهاية الحقن قبل نقل الحيوانات، ثم نقل الحيوان مرة أخرى إلى غرفة العمليات. تكشف التحليلات النسيجية على الأقسام التاجية التسلسلية عن تعبير optogenetic واسع النطاق حول مواقع التسريب.يظهر هنا هو صورة MR الإكليلي الأساسي وانتشار عامل التباين بعد التسريب لنفس شريحة MR coronal. يظهر قسم الأنسجة التاجية من نفس القسم تقريبًا. يعكس تلطيخ البيروكسيديز التعبير عن البروتين الفلورسنت الأصفر أو مراسل EYFP.ويلاحظ محاذاة جيدة بين منطقة التعبير EYFP، تقاس مع epifluorescense السطح ومع تلطيخ النسيج. وتشمل هذه المناطق انتشار ناقلات الناقلات المقدرة من صور MR. تشير النقاط البيضاء إلى مواقع الحقن وتمثل المنطقة السوداء بأكملها المنطقة التي يتعرض لها استئصال القحف.يظهر هنا هو صورة التكبير منخفضة من المقاطع التاجية الملطخة بالأجسام المضادة GFP تظهر الجانب الجانبي الوسيط للتعبير YFP في القشرة somatosensory. يشير رأس السهم الأسود إلى موقع مسار القنيولا. يظهر النسيج المجاور في أكبر التكبير لإظهار توزيع laminar من الخلايا الإيجابية YFP.وتقع المناطق الكثيفة السكان من الخلايا الإيجابية YFP في الغالب في الطبقات من 2 إلى 3 وخمسة إلى ستة. مزيد من التوسعة يكشف عن خلايا هرمية نموذجية في طبقات من اثنين إلى ثلاثة، وطبقة خمسة، وطبقة السادسة. من المهم ترك القنية في مكانها لمدة 10 دقائق بعد توقف التدفق.وهذا يضمن أن الفيروس قد تتغلغل في الأنسجة العصبية المستهدفة المحيطة بها. CED هو نهج فعال لتحقيق مستويات التعبير عالية موحدة عبر مناطق الدماغ الكبيرة في الثدييات. لديها القدرة على توسيع فهمنا للدوائر العصبية والاتصال.بعد النقل الفيروسي عن طريق CED ، يمكن إقران تجارب التحفيز البصري اللاحقة مع التسجيل الكهربائي والمقالات السلوكية للكشف عن ديناميكيات الدوائر المعقدة داخل الدماغ. وقد سبق أن استخدمت هذه التقنية من قبل Yazdan-Shahmorad وزملاؤه في عام 2018 حيث تم استخدام التعديل العصبي البصري لتحفيز الشبكات لإحداث تغييرات في الاتصال الواسع في القشرة الحركية الحسية.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

داخل القحف حقن الغدة المرتبطة ناقلات فيروسية

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

الفيروسية تنبيغ الانتقائي للبالغين المولودين في الخلايا العصبية الشمية لالمزمنة في الجسم الحي تحفيز Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

في وقت واحد رسم المخ، في الوقت الحقيقي قياس تركيز اللاكتات والتلاعب Optogenetic من نشاط الخلايا العصبية في القشرة الدماغية القوارض

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Optogenetic Functional MRI

التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي علم البصريات الوراثي

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

سوببيال الغدة المرتبطة فيروس 9 (AAV9) ناقلات تسليم في الفئران الكبار

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

آثار Transcranial التحفيز التيار المتردد في القشرة الحركية الأولية بنهج موحد على الإنترنت مع التحفيز المغناطيسي Transcranial

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

التعبير المرتبطة بالغدة التحوير الفيروس بوساطة في المعرفة وراثيا من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Automated Segmentation of Cortical Grey Matter from T1-Weighted MRI Images

تجزئة الآلي للمادة الرمادية القشرية من صور الرنين المغناطيسي T1 المرجحة

Within neuroimaging research, a number of recent studies have discussed the impact of between-study differences in volumetric findings that are thought to ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

حقن Intrathecal المباشر للفيروسات المرتبطة بالغدة المؤتلف في الفئران الكبار

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

تسليم الأجسام المضادة إلى الدماغ مورين عن طريق الحمل الحراري تعزيز التسليم

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...