Name: convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images
Uploaded: 2019-05-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af American Heart Association postdoktorat Fellowship (AY), Defense Advanced forskningsprojekter Agency (DARPA) reorganisering og plasticitet for at fremskynde skaden inddrivelse (reparation; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, og af UCSF Neuroscience Imaging Center. Dette arbejde blev også støttet af Eunice Kennedy Shiver National Institute of Child Health & menneskelig udvikling af de nationale institutter for sundhed under Award nummer K12HD073945, Washington national Primate Research Center (WaNPCR, P51 OD010425), og Center for Neuroteknologi (CNT, en National Science Foundation Engineering Research Center i henhold til Grant EØF-1028725). Vi takker Camilo Diaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel Silversmith, Karen J. MacLeod, Juliana Milani og Blakely Andrews for deres hjælp med eksperimenterne og Nan Tian, Jiwei HE, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz og Toni Haun for teknisk hjælp.

Alle procedurer er blevet godkendt af University of California, San Francisco institutionel dyrepleje og brug udvalg (IACUC) og er i overensstemmelse med vejledningen for pleje og brug af forsøgsdyr. Følgende procedure blev udført ved hjælp af to voksne mandlige rhesus macaques af 8 og 7 år, vejer 17,5 kg og 16,5 kg (abe G og abe J), hhv.
Bemærk: Brug aseptiske standardteknikker til alle kirurgiske indgreb.
1. billeddannelse ved baseline
<ol><li>Sedat og int...

<ol>
	<li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li><li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates.">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).</li><li>Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccade+modulation+by+optical+and+electrical+stimulation+in+the+macaque+frontal+eye+field.">Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field.</a> Journal of Neuroscience. 33 (42), 16684-16697 (2013).</li><li>Gerits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetically+induced+behavioral+and+functional+network+changes+in+primates.">Optogenetically induced behavioral and functional network changes in primates.</a> Current Biology. 22 (18), 1722-1726 (2012).</li><li>Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccadic+eye+movements+evoked+by+optogenetic+activation+of+primate+V1.">Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1.</a> Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).</li><li>Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+electrical+microstimulation+systematically+bias+visuospatial+choice+in+primates.">Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates.</a> Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).</li><li>Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+pharmacological+suppression+of+spatial+clusters+of+face+neurons+reveal+their+causal+role+in+face+gender+discrimination.">Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).</li><li>Ledochowitsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+optical+control+and+simultaneous+electrical+readout+of+extended+cortical+circuits.">Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits.</a> Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large-Scale+Interface+for+Optogenetic+Stimulation+and+Recording+in+Nonhuman+Primates.">A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates.</a> Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).</li><li>Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+all-optical+interrogation+of+cortical+neurons+in+awake-behaving+nonhuman+primates.">Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates.</a> PLoS Biology. 16 (8), e2005839 (2018).</li><li>Bankiewicz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+AAV+vector+in+parkinsonian+monkeys;+in+vivo+detection+of+gene+expression+and+restoration+of+dopaminergic+function+using+pro-drug+approach.">Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach.</a> Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).</li><li>Kells, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+therapy-based+method+for+the+delivery+of+therapeutics+to+primate+cortex.">Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).</li><li>Krauze, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflux-free+cannula+for+convection-enhanced+high-speed+delivery+of+therapeutic+agents.">Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents.</a> Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+optogenetic+expression+in+macaque+cortex+obtained+with+MR-guided,+convection+enhanced+delivery+(CED)+of+AAV+vector+to+the+thalamus.">Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+cortical+reorganization+using+optogenetics+in+non-human+primates.">Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+setup+for+chronic+optogenetic+stimulation+and+recording+across+cortical+areas+in+non-human+primates.">Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates.</a> SPIE BiOS. , (2015).</li><li>Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+parameters+and+virus+dependent+choice+of+promoters+to+improve+neuron+targeting+in+the+nonhuman+primate+brain.">Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain.</a> Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).</li><li>Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FEF+inactivation+with+improved+optogenetic+methods.">FEF inactivation with improved optogenetic methods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), (2016).</li><li>Bobo, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+macromolecules+in+the+brain.">Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2076-2080 (1994).</li><li>Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+distribution+of+large+molecules+in+gray+matter+during+interstitial+drug+infusion.">Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion.</a> Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).</li><li>Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+convective+delivery+of+macromolecules+to+the+spinal+cord.">Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord.</a> Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).</li><li>Szerlip, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+convection-enhanced+delivery+of+viruses+and+virus-sized+particles.">Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).</li></ol>

Her skitserer vi en gennemførlig og effektiv teknik til at opnå storstilet optogenetisk ekspression i NHP primær somatosensorisk og motorisk cortex af MR-Guided CED. Brugen af MR-Guided CED giver betydelige fordele i forhold til traditionelle metoder til viral infusion i NHP hjernen. En sådan fordel er evnen til at opnå udtryk over store områder med færre nødvendige infusioner. For eksempel, med konventionelle metoder, flere injektioner af 1-2 μl af vektor udbytte udtryk i en 2-3 mm diameter region<sup class="xr...

Optogenetics er et kraftfuldt værktøj, der giver mulighed for manipulation af neurale aktivitet og studiet af netværksforbindelser i hjernen. Gennemførelsen af denne teknik i ikke-menneskelige primater (NHP'er) har potentiale til at forbedre vores forståelse af storstilet neurale beregning, kognition, og adfærd i primat hjernen. Selv om optogenetik er blevet gennemført med succes i NHP'er i de seneste år1,2,3,4,5,6,7, en udfordring, der forskere ansigt er at opnå høje niveauer af udtryk på tværs af store hjerneområder i disse dyr. Her giver vi en effektiv og forenklet tilgang til at opnå høje niveauer af optogenetisk udtryk på tværs af store områder af cortex i macaques. Denne teknik har et stort potentiale til at forbedre nuværende optogenetiske undersøgelser i disse dyr i kombination med state-of-the-art optagelse8,9 og optisk stimulation10 teknologier.
Konvektion forbedret levering (CED) er en etableret metode til levering af farmakologiske midler og andre store molekyler, herunder virale vektorer, til centralnervesystemet11,12,13. Mens konventionelle leveringsmetoder involverer flere lav volumen infusioner fordelt på små regioner i hjernen, CED kan opnå bredere og mere jævn agent fordeling med færre infusioner. Tryk styret bulk fluid flow (konvektion) under infusionen giver mulighed for mere bredt og ensartet distribueret transduktion af målvævet, når de leverer virale vektorer med CED. I nylige undersøgelser demonstrerede vi transduktionen og den efterfølgende optogenetiske ekspression af store områder af primær motor (M1) og somatosensoriske (S1) corticer9 og thalamus14 ved hjælp af magnetisk resonans (MR)-guidet CED.
Her skitserer vi brugen af CED for at opnå optogenetisk ekspression på tværs af store kortikale områder med kun få kortikale injektioner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL High Pressure IV Tubing</td>
			<td>Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA</td>
			<td>533640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP</td>
			<td>Penn Vector Core, University of Pennsylvania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABS plastic</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>ABSplus-P430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimicrobial incise drape</td>
			<td>3M</td>
			<td>6650EZ</td>
			<td>Ioban Drape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Acrylic</td>
			<td>Henry Schein, Inc.</td>
			<td>1013117</td>
			<td>Acrylic Bonding Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevators</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>10196-564</td>
			<td>Langenbeck Elevator, Wide Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine suture</td>
			<td>McKesson Medical-Surgical Inc.</td>
			<td>1034505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadoteridol</td>
			<td>Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser for light stimulation</td>
			<td>Omicron-Laserage, Germany</td>
			<td>PhoxX 488-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR compatible 3cc syringe</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>59-8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR Imaging Software</td>
			<td>Pixmeo</td>
			<td>OsiriX MD 10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-Compatible Pump</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>Harvard PHD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-compatible stereotaxic frame</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430M MRI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifix Clamp Style Catheter Connector</td>
			<td>B-Braun, Bethlehem, PA, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Screws</td>
			<td>Plastics 1</td>
			<td>0-80 x 1/8N</td>
			<td>Nylon screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium screws</td>
			<td>Crist Instrument Co., Inc.</td>
			<td>6-YCX-0312</td>
			<td>Self-tapping bone screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>GerMedUSA Inc,</td>
			<td>SKU:GV70-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uPrinter SE 3D printer</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin E Capsule</td>
			<td>Pure Encapsulations, LLC.</td>
			<td>DE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet sterile absorbable gelatin</td>
			<td>Pfizer Inc.</td>
			<td>AZL0009034201</td>
			<td>Gelfoam</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images

I ikke-menneskelige primat (NHP) optogenetik, inficere store kortikale områder med virale vektorer er ofte en vanskelig og tidskrævende opgave. Her viser vi brugen af magnetisk resonans (MR)-guidet konvektion forbedret levering (CED) af optogenetiske virale vektorer til primære somatosensoriske (S1) og motor (M1) corticer af macaques at opnå effektiv, udbredt kortikale udtryk for lysfølsomme ion-kanaler. Adeno-associerede virale (AAV) vektorer kodning af rødt forskudt opsin C1V1 smeltet til gult fluorescerende protein (EYFP) blev injiceret i cortex af rhesus macaques under MR-Guided CED. Tre måneder efter infusionen bekræftede epifluorescerende billeddannelse store områder af optogenetisk ekspression (> 130 mm2) i M1 og S1 i to makakaber. Desuden var vi i stand til at registrere pålidelige lys-fremkaldte Elektrofysiologi svar fra de udtrykte områder ved hjælp af mikro-elektro kortikografiske arrays. Senere histologisk analyse og immun farvning mod indberetteren afslørede udbredt og tæt optogenetisk ekspression i M1 og S1 svarende til fordelingen indikeret ved epifluorescerende billeddannelse. Denne teknik gør det muligt for os at opnå udtryk på tværs af store områder af cortex inden for en kortere periode med minimal skade i forhold til de traditionelle teknikker og kan være en optimal tilgang til optogenetisk viral levering i store dyr, såsom NHP'er. Denne fremgangsmåde viser et stort potentiale for manipulation på netværksniveau af neurale kredsløb med celletype specificitet i dyremodeller evolutionært tæt på mennesker.

Konvektion forbedret levering (CED) under Mr-vejledning
Spredningen af viral vektor blev overvåget under CED infusion under vejledning af online MR images (figur 3a). I denne undersøgelse blev S1 og M1 af to aber målrettet (figur 3b). De tredimensionale fordelings volumener blev anslået i en post-hoc analyse af MR images (figur ...

Watch this Scientific Journal Video about Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images at JoVE.com

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

Her viser vi magnetisk resonans (MR)-guidet konvektion forbedret levering (CED) af virale vektorer i cortex som en effektiv og forenklet tilgang til opnåelse af optogenetisk udtryk på tværs af store kortikale områder i makak hjernen.

Konvektion forbedret levering af Optogenetic adeno-associeret viral vektor til cortex af rhesus Macaque under vejledning af online MRI-billeder

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

Konvektion forbedret levering, eller CED, af optogenetiske virale vektorer i ikke-menneskelige primater vil gøre det muligt for forskere at manipulere neurale aktivitet i stor skala til at forstå komplekse neurale beregninger og adfærd. Med CED kan vi opnå et højt optogenetisk udtryk på tværs af store regioner af primathjernen med kun få injektioner på kort tid sammenlignet med traditionelle metoder. Magnetisk resonans eller MR-kompatibel kammerimplantatation udføres ved hjælp af standardpraksis i ikke-menneskelige primatoperationer, proceduren er beskrevet i detaljer i tekstprotokollen og skitseret kort i denne video.Efter dyrs sedation, positionering og indledende snit som beskrevet i tekstprotokollen, skabe en cirkulær kraniotomi til at dække de forplanlagte baner for injektioner ved hjælp af en trephine. Opret en indrykning i midten af den planlagte kraniotomi tilstrækkeligt dybt i kraniet til at forankre trephine ved hjælp af trephins justerbare midterpunkt. Når midten er gjort, sænke trephin på kraniet og rotere trephin med uret og mod uret, mens du anvender nedadgående tryk, indtil knoglehætten kan fjernes med syrbånd.Efter at have løftet duraen som beskrevet i tekstprotokollen, klippes duraen fra midten til kanten af kraniotomien og fortsætte langs kanten med fin oftalmisk saks. Monter den cylindriske specialfremstillede konvektion forbedret levering MR kompatibelt kammer til kraniet på toppen af kraniotomien for at give kanylestøtte under infusion, således at krumningen af kammerflangen flugter godt med kraniets krumning. Fastgør implantaterne til kraniet ved hjælp af enten plast skruer og dental akryl eller et par titanium skruer.Snart efter implantering af MR kompatibel kammer og indsætte kanyle injektion gitter i kammeret, fylde nettet med 0,9% saltvand til visualisering af injektion steder via MR anatomiske billeder. Også fylde kammeret hulrum med våde sterile absorberbare gel skum til at opretholde fugten i hjernen. Dæk huden og cylinderen med en steril antimikrobiel incise drapere for at opretholde cylindrenes sterilitet under transport og MR-infusioner.Anse en vitamin E-kapsel for at markere toppen af injektionsgitteret for positiv identifikation. Mens dyret forbliver intuberet, løslad endotrakeal røret fra anæstesi kredsløb og sæt det på en bærbar MR kompatibel isoflurane maskine. Transporter dyret til MR-scanneren.Ansk af dem T1-billeder for at beregne afstanden fra toppen af injektionsnettet og den kortikale overflade. Vitamin E-kapslen er tydeligt synlig i T1-billeder og bør bruges som markør for toppen af injektionsgitteret. Ansk af dem T2-billeder for at bestemme de optimale kanylevejledninger for hvert sted baseret på det målrettede infusionssted.Kanylegitteret er fyldt med saltvand, som er bedst synlig i T2-billeder. Brug MR imaging software, rulle gennem koronale og sagittal fly for at finde målet placering af infusion. Efter optøning af den virale vektor i et par timer ved stuetemperatur, bland den virale vektor med MR kontrast agent gadoteridol ved pipette eller vortex blanding.Den blandede virus indlæses i 0,2 milliliter højtryks IV-slanger. Ved hjælp af højtryks IV slanger, tilslut en lang forlængerlinje til en MR kompatibel tre milliliter sprøjte og prime med saltvand. Tilslut den anden ende af den lange forlængerslang til 0,2 milliliter IV-slangen, der er læsset med virus.Fastgør derefter den refluksresistente kanyle med en 1 milliliter trinspids til den distale ende af denne samling med et klemisk kateterstik. Sæt endelig sprøjten i en MR-kompatibel pumpe. Ved hjælp af de opnåede baseline anatomiske MR-billeder skal du vælge den placering af kanyleinjektionsgitteret og indføringsdybden, der er nødvendig for at nå målinfusionsstedet.Marker indføringsdybden på kanylen med steril tape. Infusionen påbegyndes med en hastighed på en mikroliter pr. minut, og væskestrømmen i infusionslinjen valideres visuelt ved at observere udslyngningen af væske fra kanylespidsen. Sæt kanylen manuelt gennem injektionsgitteret til måldybden, samtidig med at strømmen opretholdes i infusionslinjen, da dette vil forhindre det gennemtrængende væv i at tilstopning af kanylen under indføring.Nu erhverve hurtig flash T1-vægtede billeder til online overvågning af den virale vektor infusion. Efter infusion af ca. 10 mikroliter af vektoren, således at der er infunderet nok virus til at detektere i MR-scanneren, skal du anskaffe MR-billeder for at kontrollere korrekt kanyleplacering som tydelig ved den observerede spredning af virus. Hvis dybden af den indsatte kanyle er forkert, justeres dybden i overensstemmelse hermed eller fjernes langsomt kanylen, og indsætningen skal forsinkes igen.Overvåg infusionen via vejledning af online MR-billeder. Forøg infusionshastigheden til fem mikroliter pr. minut med en mikroliter pr. minut med få minutters mellemrum. Det er vigtigt at øge infusionshastigheden langsomt og ikke at overstige fem mikroliter pr. minut, da høje infusionsrater kan forårsage vævsskader.Efter infusion af ca. 40 mikroliter af den virale vektor, begynde at reducere infusionshastigheden med en mikroliter pr. minut trin. Stop infusionen, når der er injiceret ca. 50 mikroliter. Lad kanylen være på plads i ti minutter.Fjern langsomt kanylen fra hjernen og gå videre til næste sted. Dæk cylinderen med en steril drapere i slutningen af injektioner før dyretransport, derefter transportere dyret tilbage til operationsstuen. Histologiske analyser af serielle koronale sektioner afslører storstilet optogenetiske udtryk omkring infusionssteder.Vist her er baseline koronale MR billede og spredningen af kontrastmidlet efter infusionen for samme MR koronale skive. En koronal væv sektion er vist fra omtrent det samme. Peroxidase farvning afspejler udtryk for det gule fluorescerende protein eller EYFP reporter.God tilpasning er observeret mellem arealet af EYFP udtryk, målt med overflade epifluorescense og med histologisk farvning. Disse omfatter regionen vektor spredning anslået fra MR-billeder. Hvide prikker angiver injektionssteder, og hele den sorte region repræsenterer det område, der er udsat for kraniotomien.Vist her er en lav forstørrelse billede af koronale sektioner farves med anti GFP antistof viser den mediale laterale aspekt af YFP udtryk i somatosensoriske cortex. Den sorte pilespids angiver placeringen af kanylesporet. Det tilstødende væv er vist ved større forstørrelse for at vise laminar fordeling af YFP positive celler.Tætbefolkede områder af YFP-positive celler er placeret overvejende i lag to til tre og fem til seks. Yderligere udvidelse afslører typiske pyramideceller i lag to til tre, lag fem og lag seks. Det er vigtigt at lade kanylen være på plads i 10 minutter, efter at strømmen er stoppet.Dette vil sikre, at virussen har percolated i det omgivende målrettede neurale væv. CED er en effektiv tilgang til at opnå ensartet høje udtryksniveauer på tværs af store hjerneregioner hos pattedyr. Det har potentiale til at udvide vores forståelse af neurale kredsløb og tilslutningsmuligheder.Efter viral transduktion af CED, efterfølgende optogenetiske stimulation eksperimenter kan parres med elektrisk optagelse og adfærdsmæssige essays til at afsløre den komplekse kredsløb dynamik i hjernen. Denne teknik har tidligere været ansat af Yazdan-Shahmorad og kolleger i 2018, hvor optogenetisk neuralmodulering blev brugt til at fremkalde netværksdækkende forbindelsesændringer i den sensoriske motoriske cortex.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selektiv Viral transduktion af Voksen-fødte olfaktoriske neuroner for Kronisk In vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Samtidig Elektroencefalografi, Real-time måling af laktat Koncentration og Optogenetic Manipulation af neuronale aktivitet i Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Optogenetic Functional MRI

Optogenetic Funktionel MRI

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpiel Adeno-associeret Virus 9 (AAV9) Vector Levering i Voksne Mus

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Virkningerne af transkranial vekselstrøm Stimulation på den primære Motor Cortex af Online kombineret tilgang med transkranial magnetisk Stimulation

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-associeret Virus-medieret transgen udtryk i genetisk definerede neuroner i rygmarven

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Automated Segmentation of Cortical Grey Matter from T1-Weighted MRI Images

Automatiseret segmentering af kortikale grå materie fra T1-vægtet Mr billeder

Within neuroimaging research, a number of recent studies have discussed the impact of between-study differences in volumetric findings that are thought to ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Direkte Intratekal injektion af rekombinant Adeno-associeret virus i voksen mus

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Levering af antistoffer i murine hjernen via konvektion-forbedret levering

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...