Name: convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images
Uploaded: 2019-05-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door American Heart Association postdoctorale Fellowship (AY), Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) reorganisatie en plasticiteit om schade herstel te versnellen (reparatie; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, en door het UCSF Neuroscience Imaging Center. Dit werk werd ook gesteund door het Eunice Kennedy Shiver National Institute of Child Health & menselijke ontwikkeling van de National Institutes of Health onder Award Number K12HD073945, het Washington National Primate Research Center (WaNPCR, P51 OD010425), en het Center for Neuro Technology (CNT, een National Science Foundation Engineering Research Center onder subsidie EEC-1028725). We danken Camilo Diaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel Silversmith, Karen J. MacLeod, Juliana Milani en Blakely Andrews voor hun hulp bij de experimenten en Nan Tian, Jiwei he, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz en Toni Haun voor technische hulp.

Alle procedures zijn goedgekeurd door de Universiteit van Californië, San Francisco institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) en zijn in overeenstemming met de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. De volgende procedure werd uitgevoerd met twee volwassen mannelijke rhesus-makaken van 8 en 7 jaar, die respectievelijk 17,5 kg en 16,5 kg (Monkey G en Monkey J) wogen.
Opmerking: gebruik standaard aseptische technieken voor alle chirurgische ingrepen.
<p class="jo...

<ol>
	<li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li><li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates.">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).</li><li>Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccade+modulation+by+optical+and+electrical+stimulation+in+the+macaque+frontal+eye+field.">Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field.</a> Journal of Neuroscience. 33 (42), 16684-16697 (2013).</li><li>Gerits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetically+induced+behavioral+and+functional+network+changes+in+primates.">Optogenetically induced behavioral and functional network changes in primates.</a> Current Biology. 22 (18), 1722-1726 (2012).</li><li>Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccadic+eye+movements+evoked+by+optogenetic+activation+of+primate+V1.">Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1.</a> Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).</li><li>Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+electrical+microstimulation+systematically+bias+visuospatial+choice+in+primates.">Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates.</a> Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).</li><li>Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+pharmacological+suppression+of+spatial+clusters+of+face+neurons+reveal+their+causal+role+in+face+gender+discrimination.">Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).</li><li>Ledochowitsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+optical+control+and+simultaneous+electrical+readout+of+extended+cortical+circuits.">Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits.</a> Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large-Scale+Interface+for+Optogenetic+Stimulation+and+Recording+in+Nonhuman+Primates.">A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates.</a> Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).</li><li>Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+all-optical+interrogation+of+cortical+neurons+in+awake-behaving+nonhuman+primates.">Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates.</a> PLoS Biology. 16 (8), e2005839 (2018).</li><li>Bankiewicz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+AAV+vector+in+parkinsonian+monkeys;+in+vivo+detection+of+gene+expression+and+restoration+of+dopaminergic+function+using+pro-drug+approach.">Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach.</a> Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).</li><li>Kells, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+therapy-based+method+for+the+delivery+of+therapeutics+to+primate+cortex.">Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).</li><li>Krauze, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflux-free+cannula+for+convection-enhanced+high-speed+delivery+of+therapeutic+agents.">Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents.</a> Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+optogenetic+expression+in+macaque+cortex+obtained+with+MR-guided,+convection+enhanced+delivery+(CED)+of+AAV+vector+to+the+thalamus.">Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+cortical+reorganization+using+optogenetics+in+non-human+primates.">Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+setup+for+chronic+optogenetic+stimulation+and+recording+across+cortical+areas+in+non-human+primates.">Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates.</a> SPIE BiOS. , (2015).</li><li>Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+parameters+and+virus+dependent+choice+of+promoters+to+improve+neuron+targeting+in+the+nonhuman+primate+brain.">Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain.</a> Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).</li><li>Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FEF+inactivation+with+improved+optogenetic+methods.">FEF inactivation with improved optogenetic methods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), (2016).</li><li>Bobo, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+macromolecules+in+the+brain.">Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2076-2080 (1994).</li><li>Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+distribution+of+large+molecules+in+gray+matter+during+interstitial+drug+infusion.">Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion.</a> Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).</li><li>Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+convective+delivery+of+macromolecules+to+the+spinal+cord.">Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord.</a> Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).</li><li>Szerlip, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+convection-enhanced+delivery+of+viruses+and+virus-sized+particles.">Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).</li></ol>

Hier schetsen we een haalbare en efficiënte techniek voor het bereiken van grootschalige optogenetische expressie in NHP primaire somatosensorische en motorische cortex door de heer-Guided CED. Het gebruik van de heer-geleide CED biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van traditionele methoden van virale infusie in het NHP brein. Een van die voordelen is het vermogen om expressie te bereiken over grote gebieden met minder vereiste infusies. Bijvoorbeeld, met conventionele methoden, meerdere injecties van 1-2 μL van ...

Optogenetics is een krachtige tool die het mogelijk maakt voor de manipulatie van neurale activiteit en de studie van netwerkverbindingen in de hersenen. Het implementeren van deze techniek in niet-menselijke primaten (Nhp's) heeft het potentieel om ons begrip van grootschalige neurale berekeningen, cognitie en gedrag in het primaat brein te verbeteren. Hoewel optogenetics met succes is geïmplementeerd in nhp's in de afgelopen jaren1,2,3,4,5,6,7, een uitdaging die onderzoekers worden geconfronteerd met het bereiken van hoge niveaus van expressie in grote hersengebieden in deze dieren. Hier bieden we een efficiënte en vereenvoudigde aanpak om hoge niveaus van optogenetische expressie te bereiken in grote gebieden van de cortex in macaques. Deze techniek heeft een groot potentieel om de huidige optogenetische studies bij deze dieren te verbeteren in combinatie met state-of-the-art opname van8,9 en optische stimulatie10 technologieën.
Convectie verbeterde levering (CED) is een vaste methode voor de levering van farmacologische agentia en andere grote moleculen, waaronder virale vectoren, aan het centrale zenuwstelsel11,12,13. Terwijl conventionele toedienings methoden betrekking hebben op meervoudige infusies met een laag volume verdeeld over kleine hersengebieden, kan CED een bredere en meer gelijkmatige verdeling van de middelen met minder infusies bereiken. Druk-gedreven bulk vloeistofstroom (convectie) tijdens de infusie zorgt voor een breder en uniform verdeelde transductie van het doelweefsel bij het leveren van virale vectoren met CED. In recente studies toonden we de transductie en daaropvolgende optogenetische expressie van grote delen van de primaire motor (M1) en somatosensorische (S1) cortices9 en thalamus14 met behulp van magnetische resonantie (Mr)-geleide CED.
Hier schetsen we het gebruik van CED om optogenetische expressie in grote corticale gebieden te bereiken met slechts een paar corticale injecties.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL High Pressure IV Tubing</td>
			<td>Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA</td>
			<td>533640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP</td>
			<td>Penn Vector Core, University of Pennsylvania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABS plastic</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>ABSplus-P430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimicrobial incise drape</td>
			<td>3M</td>
			<td>6650EZ</td>
			<td>Ioban Drape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Acrylic</td>
			<td>Henry Schein, Inc.</td>
			<td>1013117</td>
			<td>Acrylic Bonding Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevators</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>10196-564</td>
			<td>Langenbeck Elevator, Wide Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine suture</td>
			<td>McKesson Medical-Surgical Inc.</td>
			<td>1034505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadoteridol</td>
			<td>Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser for light stimulation</td>
			<td>Omicron-Laserage, Germany</td>
			<td>PhoxX 488-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR compatible 3cc syringe</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>59-8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR Imaging Software</td>
			<td>Pixmeo</td>
			<td>OsiriX MD 10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-Compatible Pump</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>Harvard PHD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-compatible stereotaxic frame</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430M MRI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifix Clamp Style Catheter Connector</td>
			<td>B-Braun, Bethlehem, PA, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Screws</td>
			<td>Plastics 1</td>
			<td>0-80 x 1/8N</td>
			<td>Nylon screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium screws</td>
			<td>Crist Instrument Co., Inc.</td>
			<td>6-YCX-0312</td>
			<td>Self-tapping bone screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>GerMedUSA Inc,</td>
			<td>SKU:GV70-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uPrinter SE 3D printer</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin E Capsule</td>
			<td>Pure Encapsulations, LLC.</td>
			<td>DE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet sterile absorbable gelatin</td>
			<td>Pfizer Inc.</td>
			<td>AZL0009034201</td>
			<td>Gelfoam</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images

In niet-menselijke primaat (NHP) optogenetica, het infecteren van grote corticale gebieden met virale vectoren is vaak een moeilijke en tijdrovende taak. Hier tonen we het gebruik van magnetische resonantie (Mr) geleide convectie verbeterde levering (CED) van optogenetische virale vectoren in primaire somatosensorische (S1) en motor (M1) cortices van Makaken om een efficiënte, wijdverspreide corticale expressie van lichtgevoelige ionenkanalen. Adeno-geassocieerde virale (Aav) vectoren coderen van de rood-verplaatste opsin C1V1 gesmolten tot geel fluorescerende eiwit (eyfp) werden geïnjecteerd in de cortex van rhesus makaken onder leiding van de heer-geleide CED. Drie maanden na de infusie bevestigde epifluorescerende beeldvorming grote gebieden van optogenetische expressie (> 130 mm2) in M1 en S1 in twee macaques. Bovendien waren we in staat om betrouwbare licht-opgeroepen elektrofysiologie reacties op te nemen vanuit de uitschrijf gebieden met behulp van micro-elektrocorticografische arrays. Latere histologische analyse en immunokleuring tegen de reporter onthulde wijdverspreide en dichte optogenetische expressie in M1 en S1 overeenkomend met de verdeling aangegeven door epifluorescerende beeldvorming. Deze techniek stelt ons in staat om binnen een kortere periode uitdrukking te krijgen in grote delen van de cortex met minimale schade in vergelijking met de traditionele technieken en kan een optimale aanpak zijn voor optogenetische virale bezorging bij grote dieren zoals Nhp's. Deze aanpak toont een groot potentieel voor manipulatie op netwerkniveau van neurale circuits met cel-type specificiteit in diermodellen evolutionair dicht bij de mens.

Convectie verbeterde levering (CED) onder MRI-geleiding
De verspreiding van de virale vector werd gecontroleerd tijdens de infusie van CED onder leiding van online MR images (Figuur 3a). In deze studie werden S1 en M1 van twee apen getarget (Figuur 3b). De driedimensionale verdelings volumes werden geschat in een post-hoc analyse van de heer images (<st...

Watch this Scientific Journal Video about Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images at JoVE.com

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

Hier demonstreren we magnetische resonantie (MR)-geleide convectie verbeterde levering (CED) van virale vectoren in de cortex als een efficiënte en vereenvoudigde aanpak voor het bereiken van optogenetische expressie in grote corticale gebieden in de makaak hersenen.

Convectie verbeterde levering van Optogenetische adeno-geassocieerde virale vector aan de cortex van rhesus macaque onder begeleiding van online MRI-beelden

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

Convectie verbeterde levering, of CED, van optogenetische virale vectoren in niet-menselijke primaten zal onderzoekers in staat stellen om neurale activiteit te manipuleren op grote schaal om complexe neurale berekeningen en gedrag te begrijpen. Met CED kunnen we een hoge optogenetische expressie bereiken in grote gebieden van het primaatbrein met slechts een paar injecties in een korte tijd in vergelijking met traditionele methoden. Magnetische resonantie of MR compatibele kamer implantatie wordt uitgevoerd met behulp van standaard praktijk in niet-menselijke primaten operaties, de procedure wordt in detail beschreven in het tekstprotocol en kort beschreven in deze video.Na dierlijke sedatie, positionering, en de eerste incisie zoals beschreven in het tekstprotocol, maak een cirkelvormige craniotomie om de vooraf geplande trajecten voor injecties met behulp van een trephine te dekken. Maak een inkeping in het midden van de geplande craniotomie voldoende diep in de schedel om de trephine te verankeren met behulp van het verstelbare middelpunt van de trephine. Zodra het centrum is gemaakt, laat de trephine op de schedel en draai de trephine met de klok mee en tegen de klok in, terwijl het toepassen van neerwaartse druk totdat het bot dop kan worden verwijderd met tangen.Na het opheffen van de dura zoals beschreven in het tekstprotocol, snijd de dura van het centrum naar de rand van de craniotomie en ga verder langs de rand met fijne oogheelkundige schaar. Monteer de cilindrische op maat gemaakte convectie verbeterde levering MR compatibele kamer aan de schedel op de top van de craniotomie om canule ondersteuning te bieden tijdens de infusie zodanig dat de kromming van de kamer flens goed aansluit bij de kromming van de schedel. Zet de implantaten aan de schedel met behulp van plastic schroeven en tandheelkundige acryl of een paar titanium schroeven.Kort na het implanteren van de MR compatibele kamer en het inbrengen van de canule injectie raster in de kamer, vul het rooster met 0,9% zout voor het visualiseren van de injectie locaties via MR anatomische beelden. Vul ook de kamerholtes met nat steriel absorbeerbaar gelschuim om het vocht van de hersenen te behouden. Bedek de huid en de cilinder met een steriel antimicrobiële snijgordijnen om de steriliteit van de cilinders tijdens het transport en MR-infusies te behouden.Plaats een vitamine E-capsule om de bovenkant van het injectierooster te markeren voor positieve identificatie. Terwijl het dier blijft geïntubeerd, los de endotracheale buis van de anesthesie circuit en opnieuw aan een draagbare MR compatibele isoflurane machine. Breng het dier naar de MRI-scanner.Verkrijg T1-beelden om de afstand tot de bovenkant van het injectieraster en het corticale oppervlak te berekenen. De vitamine E-capsule is duidelijk zichtbaar in T1-beelden en moet worden gebruikt als markering voor de bovenkant van het injectieraster. Verwerf T2-afbeeldingen om de optimale canulegeleiders voor elke site te bepalen op basis van de beoogde plaats van infusie.Het canulerooster is gevuld met zoutoplossing die het best zichtbaar is in T2-beelden. Scroll met de MR-beeldvormingssoftware door de coronale en sagittale vlakken om de doellocatie van infusie te vinden. Na het ontdooien van de virale vector gedurende een paar uur bij kamertemperatuur, meng de virale vector met de MR contrast agent gadoteridol door pipet of vortex mengen.Laad het gemengde virus in 0,2 milliliter hoge druk IV buizen. Sluit met behulp van de 4-buizen onder hoge druk een lange verlenglijn aan op een MR-compatibele drie milliliterspuit en prime met zoutoplossing. Sluit het andere uiteinde van de lange verlengbuis aan op de 0,2 milliliter IV-slang geladen met het virus.Bevestig vervolgens de refluxbestendige canule met een één milliliter getrapte punt aan het distale uiteinde van deze montage met een klemstijlkatheterconnector. Tot slot zet de spuit in een MR compatibele pomp. Selecteer met behulp van de verkregen anatomische MR-afbeeldingen de locatie van het canule-injectieraster en de invoegdiepte die nodig is om de doelinfusieplaats te bereiken.Markeer de invoegdiepte op de canule met steriele tape. Begin met de infusie met een snelheid van één microliter per minuut en valideer de stroom van de vloeistof in de infuuslijn visueel door de uitwerping van vloeistof uit de canulepunt te observeren. Steek de canule handmatig door het injectieraster in de doeldiepte terwijl de stroom in de infusielijn behouden blijft, omdat dit voorkomt dat het doorgedrongen weefsel de canule verstopt tijdens het inbrengen.Nu verwerven snelle flitser T1-gewogen beelden voor online monitoring van de virale vector infusie. Na het inbrengen van ongeveer 10 microliter van de vector zodanig dat er voldoende virus is toegediend om te detecteren in de MR-scanner, verkrijgen MR beelden om de juiste canule plaatsing te verifiëren, zoals blijkt uit de waargenomen verspreiding van het virus. Als de diepte van de ingebrachte canule onjuist is, past u de diepte dienovereenkomstig aan of verwijdert u de canule langzaam en voert u de invoegpositie opnieuw in.Monitor de infusie via begeleiding van online MR-afbeeldingen. Verhoog de infusiesnelheid tot vijf microliter per minuut met één microliter per minuut om de paar minuten. Het is belangrijk om de infusiesnelheid langzaam te verhogen en niet meer dan vijf microliter per minuut te overschrijden, omdat hoge infusiesnelheden weefselschade kunnen veroorzaken.Na het inbrengen van ongeveer 40 microliters van de virale vector, beginnen met het verminderen van de infusiesnelheid met een microliter per minuut stappen. Stop de infusie nadat ongeveer 50 microliter wordt geïnjecteerd. Laat de canule tien minuten op zijn plaats.Verwijder langzaam de canule uit de hersenen en ga naar de volgende locatie. Bedek de cilinder met een steriele gordijn aan het einde van injecties voor het vervoer van dieren en breng het dier vervolgens terug naar de operatiekamer. Histologische analyses op seriële coronale secties onthullen grootschalige optogenetische expressie rond de infusieplaatsen.Hier wordt de baseline coronale MR-afbeelding en de verspreiding van het contrastmiddel na de infusie voor dezelfde MR coronale slice weergegeven. Een coronale weefselsectie wordt getoond van ongeveer het zelfde. Peroxidase kleuring weerspiegelt expressie van het gele fluorescerende eiwit of EYFP-verslaggever.Goede uitlijning wordt waargenomen tussen het gebied van de EYFP-expressie, gemeten met oppervlakte-epifluorescense en met histologische kleuring. Deze omvatten het gebied van vector verspreid geschat op MR-beelden. Witte stippen geven injectieplaatsen aan en het hele zwarte gebied vertegenwoordigt het gebied dat door de craniotomie wordt blootgesteld.Hier is een lage vergroting beeld van de coronale secties bevlekt met anti GFP anti-antilichaam toont het mediale laterale aspect van YFP expressie in de somatosensorische cortex. De zwarte pijlpunt geeft de locatie van de canuletrack aan. Het aangrenzende weefsel wordt bij een grotere vergroting getoond om laminaire verdeling van de YFP-positieve cellen te tonen.Dichtbevolkte gebieden van YFP-positieve cellen bevinden zich voornamelijk in de lagen twee tot en met drie en vijf tot en met zes. Verdere uitbreiding onthult typische piramidale cellen in lagen twee tot en met drie, laag vijf en laag zes. Het is belangrijk om de canule 10 minuten na het stoppen van de stroom op zijn plaats te laten.Dit zal ervoor zorgen dat het virus is doorgeperceerd in de omliggende gerichte neurale weefsel. CED is een efficiënte aanpak om uniform hoge expressieniveaus te bereiken in grote hersengebieden bij zoogdieren. Het heeft het potentieel om ons begrip van neurale circuits en connectiviteit uit te breiden.Na virale transductie door CED, kunnen latere optogenetische stimulatie-experimenten worden gecombineerd met elektrische opname- en gedragsessays om de complexe circuitdynamiek in de hersenen te onthullen. Deze techniek werd eerder gebruikt door Yazdan-Shahmorad en collega's in 2018, waarbij optogenetische neurale modulatie werd gebruikt om netwerkbrede connectiviteitsveranderingen in de sensorische motorische cortex te induceren.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracraniële Injectie van adeno-geassocieerde virale vectoren

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selectieve Viral Transductie van Adult geboren Olfactorische Neuronen voor chronische In vivo Optogenetic Stimulatie

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Gelijktijdig Elektro, Real-time meting van lactaatconcentratie en Optogenetic Manipulatie van neuronale activiteit in de Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Optogenetic Functional MRI

Optogenetische Functionele MRI

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Subpiaal Adeno-geassocieerde Virus 9 (AAV9) Vector Levering in Volwassene Muizen

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Effecten van Transcraniële wisselstroom stimulatie op de primaire motorische Cortex door Online-gecombineerde aanpak met Transcraniële magnetische stimulatie

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-associated Virus-gemedieerde transgenic expressie in genetisch gedefinieerde neuronen van het ruggenmerg

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Automated Segmentation of Cortical Grey Matter from T1-Weighted MRI Images

Automatische segmentatie van corticale grijze stof van MRI T1-gewogen beelden

Within neuroimaging research, a number of recent studies have discussed the impact of between-study differences in volumetric findings that are thought to ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Directe intrathecale injectie van recombinante Adeno-geassocieerde virussen in volwassen muizen

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Levering van antilichamen in de Muriene hersenen via convectie-verbeterde levering

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...