Name: convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images
Uploaded: 2019-05-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par american Heart Association postdoctoral fellowship (AY), Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Reorganization and Plasticity to Accelerate Injury Recovery (REPAIR; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, et par le Centre d'imagerie des neurosciences de l'UCSF. Ce travail a également été soutenu par l'Eunice Kennedy Shiver National Institute of Child Health and Human Development des National Institutes of Health sous le numéro de prix K12HD073945, le Washington National Primate Research Center (WaNPCR, P51 OD010425), et le Center for Neurotechnology (CNT, un national Science Foundation Engineering Research Center sous la fondation Grant EEC-1028725). Nous remercions Camilo Diaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel Silversmith, Karen J. MacLeod, Juliana Milani et Blakely Andrews pour leur aide dans les expériences et Nan Tian, Jiwei He, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz et Toni Haun pour leur aide technique.

Toutes les procédures ont été approuvées par l'Université de Californie, San Francisco Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) et sont conformes au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. La procédure suivante a été effectuée à l'aide de deux macaques rhésus mâles adultes de 8 et 7 ans, pesant respectivement 17,5 kg et 16,5 kg (singe G et singe J).
REMARQUE : Utilisez des techniques aseptiques standard pour toutes les interventions chirurgicales....

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	<li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li><li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates.">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).</li><li>Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccadic+eye+movements+evoked+by+optogenetic+activation+of+primate+V1.">Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1.</a> Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).</li><li>Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+electrical+microstimulation+systematically+bias+visuospatial+choice+in+primates.">Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates.</a> Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).</li><li>Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+and+pharmacological+suppression+of+spatial+clusters+of+face+neurons+reveal+their+causal+role+in+face+gender+discrimination.">Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).</li><li>Ledochowitsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+optical+control+and+simultaneous+electrical+readout+of+extended+cortical+circuits.">Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits.</a> Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Large-Scale+Interface+for+Optogenetic+Stimulation+and+Recording+in+Nonhuman+Primates.">A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates.</a> Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).</li><li>Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+all-optical+interrogation+of+cortical+neurons+in+awake-behaving+nonhuman+primates.">Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates.</a> PLoS Biology. 16 (8), e2005839 (2018).</li><li>Bankiewicz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+AAV+vector+in+parkinsonian+monkeys;+in+vivo+detection+of+gene+expression+and+restoration+of+dopaminergic+function+using+pro-drug+approach.">Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach.</a> Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).</li><li>Kells, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+therapy-based+method+for+the+delivery+of+therapeutics+to+primate+cortex.">Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).</li><li>Krauze, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflux-free+cannula+for+convection-enhanced+high-speed+delivery+of+therapeutic+agents.">Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents.</a> Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+optogenetic+expression+in+macaque+cortex+obtained+with+MR-guided,+convection+enhanced+delivery+(CED)+of+AAV+vector+to+the+thalamus.">Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+cortical+reorganization+using+optogenetics+in+non-human+primates.">Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+setup+for+chronic+optogenetic+stimulation+and+recording+across+cortical+areas+in+non-human+primates.">Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates.</a> SPIE BiOS. , (2015).</li><li>Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+parameters+and+virus+dependent+choice+of+promoters+to+improve+neuron+targeting+in+the+nonhuman+primate+brain.">Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain.</a> Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).</li><li>Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FEF+inactivation+with+improved+optogenetic+methods.">FEF inactivation with improved optogenetic methods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), (2016).</li><li>Bobo, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+delivery+of+macromolecules+in+the+brain.">Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2076-2080 (1994).</li><li>Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convection-enhanced+distribution+of+large+molecules+in+gray+matter+during+interstitial+drug+infusion.">Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion.</a> Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).</li><li>Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+convective+delivery+of+macromolecules+to+the+spinal+cord.">Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord.</a> Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).</li><li>Szerlip, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+convection-enhanced+delivery+of+viruses+and+virus-sized+particles.">Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).</li></ol>

Ici, nous dénoncons une technique faisable et efficace pour réaliser l'expression optogénétique à grande échelle dans le cortex somatosensoriel et moteur primaire de NHP par LE CED MR-guidé. L'utilisation du CED MR-guidé présente des avantages significatifs au-dessus des méthodes traditionnelles de perfusion virale dans le cerveau de NHP. Un tel avantage est la capacité d'atteindre l'expression sur de grandes zones avec moins d'infusions requises. Par exemple, avec des méthodes conventionnelles, des injection...

L'optogénétique est un outil puissant qui permet la manipulation de l'activité neuronale et l'étude des connexions réseau dans le cerveau. La mise en œuvre de cette technique chez les primates non humains (PSN) a le potentiel d'améliorer notre compréhension du calcul neuronal à grande échelle, de la cognition et du comportement dans le cerveau des primates. Bien que l'optogénétique a été mise en œuvre avec succès dans les PSN au cours des dernières années1,2,3,4,5,6,7, un défi qui chercheurs face est d'atteindre des niveaux élevés d'expression à travers de grandes zones du cerveau chez ces animaux. Ici, nous fournissons une approche efficace et simplifiée pour atteindre des niveaux élevés d'expression optogénétique à travers de grandes zones du cortex chez les macaques. Cette technique a un grand potentiel pour améliorer les études optogénétiques actuelles chez ces animaux en combinaison avec l'enregistrement de pointe8,9 et la stimulation optique10 technologies.
Convection livraison améliorée (CED) est une méthode établie de livraison d'agents pharmacologiques et d'autres grandes molécules, y compris les vecteurs viraux, au système nerveux central11,12,13. Alors que les méthodes d'administration conventionnelles impliquent de multiples infusions à faible volume réparties dans de petites régions du cerveau, le DEC peut obtenir une distribution plus large et plus uniforme des agents avec moins d'infusions. Le flux de fluide en vrac (convection) sous pression pendant la perfusion permet une transduction plus large et uniformément distribuée du tissu cible lors de la transmission de vecteurs viraux atteints de DEC. Dans des études récentes, nous avons démontré la transduction et l'expression optogénétique suivante de grandes zones du moteur primaire (M1) et des cortices somatosensory (S1)9 et thalamus14 utilisant la résonance magnétique (MR)-guidé CED.
Ici, nous décrivons l'utilisation du CED pour réaliser l'expression optogénétique à travers de grandes zones corticales avec seulement quelques injections corticales.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL High Pressure IV Tubing</td>
			<td>Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA</td>
			<td>533640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing</td>
			<td>Polymicro Technologies</td>
			<td>1068150625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP</td>
			<td>Penn Vector Core, University of Pennsylvania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABS plastic</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>ABSplus-P430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimicrobial incise drape</td>
			<td>3M</td>
			<td>6650EZ</td>
			<td>Ioban Drape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Acrylic</td>
			<td>Henry Schein, Inc.</td>
			<td>1013117</td>
			<td>Acrylic Bonding Agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevators</td>
			<td>VWR International, LLC.</td>
			<td>10196-564</td>
			<td>Langenbeck Elevator, Wide Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine suture</td>
			<td>McKesson Medical-Surgical Inc.</td>
			<td>1034505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gadoteridol</td>
			<td>Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ</td>
			<td>0270-1111-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser for light stimulation</td>
			<td>Omicron-Laserage, Germany</td>
			<td>PhoxX 488-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR compatible 3cc syringe</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>59-8377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR Imaging Software</td>
			<td>Pixmeo</td>
			<td>OsiriX MD 10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-Compatible Pump</td>
			<td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>Harvard PHD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR-compatible stereotaxic frame</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1430M MRI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifix Clamp Style Catheter Connector</td>
			<td>B-Braun, Bethlehem, PA, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Screws</td>
			<td>Plastics 1</td>
			<td>0-80 x 1/8N</td>
			<td>Nylon screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium screws</td>
			<td>Crist Instrument Co., Inc.</td>
			<td>6-YCX-0312</td>
			<td>Self-tapping bone screws</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>GerMedUSA Inc,</td>
			<td>SKU:GV70-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uPrinter SE 3D printer</td>
			<td>Stratasys, MN, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin E Capsule</td>
			<td>Pure Encapsulations, LLC.</td>
			<td>DE1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet sterile absorbable gelatin</td>
			<td>Pfizer Inc.</td>
			<td>AZL0009034201</td>
			<td>Gelfoam</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

convection enhanced delivery of optogenetic adeno-associated viral vector to the cortex of rhesus macaque under guidance of online mri images

Dans l'optogénétique des primates non humains (PSN), infecter de grandes zones corticales avec des vecteurs viraux est souvent une tâche difficile et longue. Ici, nous démontrons l'utilisation de la résonance magnétique (MR)-guidée convection améliorée de livraison (CED) des vecteurs viraux optogénétiques dans les cortices somatosensory (S1) primaires (S1) et moteurs (M1) des macaques pour obtenir l'expression corticale efficace et répandue de canaux ioniques sensibles à la lumière. Des vecteurs viraux associés à l'adéno (AAV) codant l'opsine rouge-shifted il C1V1 fusionné à la protéine fluorescente jaune (EYFP) ont été injectés dans le cortex des macaques rhésus sous CED MR-guidé. Trois mois après l'infusion, la formation image épifluorescente a confirméde grandes régions de l'expression optogénétique (-130 mm 2) dans M1 et S1 dans deux macaques. En outre, nous avons pu enregistrer des réponses électrophysiologiques fiables évoquées par la lumière à partir des zones d'expression à l'aide de tableaux micro-électrocorticographiques. L'analyse histologique et l'immunostaining postérieurs contre le journaliste ont indiqué l'expression optogenetic répandue et dense dans M1 et S1 correspondant à la distribution indiquée par la formation image épifluorescente. Cette technique nous permet d'obtenir l'expression sur de grandes zones du cortex dans un délai plus court avec des dommages minimes par rapport aux techniques traditionnelles et peut être une approche optimale pour la livraison virale optogénétique chez les grands animaux tels que les PSN. Cette approche démontre un grand potentiel de manipulation au niveau du réseau des circuits neuronaux avec une spécificité de type cellulaire dans les modèles animaux évolutivement proches des humains.

Convection Enhanced Delivery (CED) dans le cadre de l'IRM
La propagation du vecteur viral a été surveillée lors de l'infusion de DEC sous la direction d'images MR en ligne (figure 3A). Dans cette étude, S1 et M1 de deux singes ont été ciblés (Figure 3B). Les volumes de distribution tridimensionnels ont été estimés dans une analyse post-hoc des...

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Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

Ici, nous démontrons la résonance magnétique (MR)-guidée convection a augmenté la livraison (CED) des vecteurs viraux dans le cortex comme approche efficace et simplifiée pour réaliser l'expression optogénétique à travers de grandes zones corticales dans le cerveau macaque.

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In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

La convection a amélioré la livraison, ou CED, des vecteurs viraux optogénétiques chez les primates non humains permettra aux chercheurs de manipuler l’activité neuronale à grande échelle pour comprendre les calculs et les comportements neuronaux complexes. Avec la DEC, nous pouvons atteindre une forte expression optogénétique dans de grandes régions du cerveau des primates avec seulement quelques injections en peu de temps par rapport aux méthodes traditionnelles. La résonance magnétique ou l’implantation compatible de chambre de MR est exécutée utilisant la pratique standard dans les chirurgies non humaines de primate, la procédure est décrite en détail dans le protocole de texte et décrite brièvement dans cette vidéo.Après la sédation animale, le positionnement et l’incision initiale tel que décrit dans le protocole de texte, créez une craniotomie circulaire pour couvrir les trajectoires préplanées pour les injections à l’aide d’une tréphine. Créer une indentation au centre de la craniotomie planifiée suffisamment profondément dans le crâne pour ancrer la tréphine en utilisant le point de centrage réglable de la tréphine. Une fois que le centre a été fait, abaissez la tréphine sur le crâne et faites pivoter la tréphine dans le sens des aiguilles d’une montre et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre tout en appliquant une pression vers le bas jusqu’à ce que la calotte osseuse puisse être enlevée avec des forceps.Après avoir soulevé la dura comme détaillé dans le protocole de texte, couper la dura du centre au bord de la craniotomie et continuer le long du bord avec de fines ciseaux ophtalmiques. Monter la convection cylindrique sur mesure améliorée livraison MR chambre compatible avec le crâne sur le dessus de la craniotomie pour fournir un soutien canule pendant l’infusion de sorte que la courbure de la bride de chambre s’aligne bien avec la courbure du crâne. Fixez les implants au crâne à l’aide de vis en plastique et d’acrylique dentaire ou de quelques vis en titane.Peu de temps après l’implantation de la chambre compatible MR et l’insertion de la grille d’injection de canule dans la chambre, remplissez la grille de 0,9% salin pour visualiser les emplacements d’injection via des images anatomiques MR. Remplissez également les cavités de chambre avec de la mousse de gel absorbable stérile humide pour maintenir l’humidité du cerveau. Couvrir la peau et le cylindre d’un drapé stérile d’incise antimicrobienne pour maintenir la stérilité des cylindres pendant le transport et les perfusions MR.Placez une capsule de vitamine E pour marquer le haut de la grille d’injection pour une identification positive. Pendant que l’animal reste intubé, détachez le tube entérachéal du circuit d’anesthésie et rattachez-le à une machine portative compatible MR isoflurane. Transportez l’animal au scanner IRM.Acquérir des images T1 pour calculer la distance par rapport au haut de la grille d’injection et à la surface corticale. La capsule de vitamine E est clairement visible dans les images T1 et doit être utilisée comme marqueur pour le haut de la grille d’injection. Acquérir des images T2 pour déterminer les guides de canule optimaux pour chaque site en fonction du site ciblé d’infusion.La grille de canule est remplie de solution saline qui est mieux visible dans les images T2. À l’aide du logiciel d’imagerie MR, faites défiler les plans coronal et sagittal pour trouver l’emplacement cible de l’infusion. Après avoir décongelé le vecteur viral pendant quelques heures à température ambiante, mélanger le vecteur viral avec l’agent de contraste MR gadoteridol par pipette ou mélange vortex.Chargez le virus mélangé dans un tube IV haute pression de 0,2 millilitre. À l’aide d’un tube IV haute pression, connectez une longue ligne d’extension à une seringue compatible MR de trois millilitres et amorce avec de la solution saline. Connectez l’autre extrémité du tube à longue extension au tube IV de 0,2 millilitre chargé du virus.Attachez ensuite la canule résistante au reflux avec une pointe en gradins d’un millilitre à l’extrémité distale de cet assemblage avec un connecteur cathéter de style pince. Enfin, placez la seringue dans une pompe compatible MR. À l’aide des images mr anatomiques de base obtenues, sélectionnez l’emplacement de la grille d’injection de canule et la profondeur d’insertion nécessaires pour atteindre le site de perfusion cible.Marquer la profondeur d’insertion sur la canule à l’aide de ruban stérile. Commencez l’infusion à raison d’un microlitre par minute et validez visuellement l’écoulement du fluide dans la ligne d’infusion en observant l’éjection du liquide de la pointe de la canule. Insérez la canule manuellement à travers la grille d’injection à la profondeur cible tout en maintenant le flux dans la ligne de perfusion car cela empêchera le tissu pénétré d’obstruer la canule pendant l’insertion.Maintenant acquérir rapide flash T1 pondérées images pour la surveillance en ligne de l’infusion vecteur viral. Après avoir infusé environ 10 microlitres du vecteur de sorte qu’assez de virus est infusé pour détecter dans le scanner MR, obtenir des images MR pour vérifier le placement correct de la canule comme en témoigne la propagation observée du virus. Si la profondeur de la canule insérée est incorrecte, ajustez la profondeur en conséquence ou retirez lentement la canule et reemptez l’insertion.Surveillez l’infusion par guidage d’images MR en ligne. Augmentez le taux d’infusion à cinq microlitres par minute d’un microlitre par minute toutes les quelques minutes. Il est important d’augmenter le taux de perfusion lentement et de ne pas dépasser cinq microlitres par minute car des taux de perfusion élevés pourraient causer des lésions tissulaires.Après avoir infusé environ 40 microlitres du vecteur viral, commencer à réduire le taux d’infusion d’un microlitre par minute étapes. Arrêter l’infusion après l’injection d’environ 50 microlitres. Laisser la canule en place pendant dix minutes.Retirez lentement la canule du cerveau et passez à l’endroit suivant. Couvrir le cylindre d’un drapé stérile à la fin des injections avant le transport des animaux, puis le ramener à la salle d’opération. Les analyses histologiques sur les sections coronaires périodiques révèlent l’expression optogénétique à grande échelle autour des emplacements de perfusion.Montré ici est l’image coronale de référence MR et la propagation de l’agent de contraste après l’infusion pour la même tranche coronale MR. Une section de tissu coronal est montrée à peu près la même. La coloration à la peroxyde reflète l’expression de la protéine fluorescente jaune ou du journaliste de l’EYFP.Un bon alignement est observé entre la zone d’expression EYFP, mesurée avec l’épifluoréscense de surface et avec la coloration histologique. Il s’agit notamment de la région de propagation vectorielle estimée à partir d’images MR. Les points blancs indiquent les sites d’injection et toute la région noire représente la zone exposée par la craniotomie.Montré ici est une image de grossissement faible des sections coronales tachées avec anticorps anti GFP montrant l’aspect latéral médial de l’expression de YFP dans le cortex somatosensory. La pointe de flèche noire indique l’emplacement de la piste de canule. Le tissu adjacent est montré à un grossissement plus grand pour montrer la distribution laminaire des cellules positives de YFP.Les régions densément peuplées des cellules positives du PJ sont situées principalement dans les couches deux à trois et cinq à six. L’agrandissement ultérieur révèle les cellules pyramidales typiques dans les couches deux à trois, la couche cinq, et la couche six. Il est important de laisser la canule en place pendant 10 minutes après l’arrêt du débit.Cela permettra de s’assurer que le virus a percolé dans le tissu neuronal ciblé environnant. La DECE est une approche efficace pour atteindre des niveaux d’expression uniformément élevés dans les grandes régions du cerveau chez les mammifères. Il a le potentiel d’élargir notre compréhension des circuits neuronaux et de la connectivité.Après la transduction virale par CED, les expériences suivantes de stimulation optogénétique peuvent être jumelées avec l’enregistrement électrique et les essais comportementaux pour révéler la dynamique complexe de circuit dans le cerveau. Cette technique a déjà été utilisée par Yazdan-Shahmorad et ses collègues en 2018 dans laquelle la modulation neuronale optogénétique a été utilisée pour induire des changements de connectivité à l’échelle du réseau dans le cortex moteur sensoriel.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Injection intracrânienne des vecteurs adéno-associés virale

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Recherche

Neurosciences

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Sélective transduction virale des adultes-né pour les neurones olfactifs chronique In vivo Stimulation optogénétique

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Électroencéphalographie simultanée, en temps réel Mesure de la concentration de lactate et manipulation optogenetic de l&#39;activité neuronale dans le cortex cérébral des rongeurs

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Optogenetic Functional MRI

L&#39;IRM fonctionnelle optogénétiques

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

La livraison de vecteur 9 (AAV9) associée au virus Adeno-Associé Subpial (AAV9) chez les souris adultes

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Effets de la Stimulation transcrânienne courant alternatif sur le Cortex moteur primaire par en ligne approche combinée avec la Stimulation magnétique transcrânienne

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression dans les neurones de la moelle épinière génétiquement définies

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Automated Segmentation of Cortical Grey Matter from T1-Weighted MRI Images

Segmentation automatique de substance grise corticale des Images d’IRM pondérées en T1

Within neuroimaging research, a number of recent studies have discussed the impact of between-study differences in volumetric findings that are thought to ...

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Direct Injection intrathécale de Recombinant Adeno-associated virus chez la souris adulte

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Livraison d'anticorps dans le cerveau murine via la livraison convection-améliorée

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...